蚀斑法测定呼吸道合胞病毒滴度的建立和验证

目的 建立蚀斑法用于呼吸道合胞病毒的病毒滴度测定，并进行验证。方法 通过测定样品的病毒滴度，比较滴度结果，筛选最佳覆盖物、覆盖物浓度和病毒孵育时间，从而建立蚀斑法用于测定呼吸道合胞病毒滴度。根据国际人用药品注册技术协调会指导原则和《中华人民共和国药典》要求，验证该方法的准确性、精密性、线性和耐用性。结果 采用0.8%微晶纤维素作为覆盖物，病毒孵育2～3 h为建立蚀斑法的最优条件。该蚀斑法测定不同浓度样品病毒滴度的结果相对偏倚均小于10%;试验内和试验间精密性几何变异系数分别为11%和18%;本方法的线性斜率为1.004,相关系数为0.999 1;本方法中固定细胞的时间0.5～24 h均适用，差异无统计学意义(F=1.767,P=0.222 5)。结论 建立的蚀斑法具有较好的准确性、精密性、线性和耐用性，适用于呼吸道合胞病毒的滴度测定。     

经典方法与LaSRT法测定绿色荧光蛋白标记重组病毒滴度的研究

目的以带有绿色荧光蛋白(GFP)标记基因的重组逆转录病毒为例,对经典方法与批量快速病毒滴度法(LaSRT)测定病毒滴度进行比较研究。方法(1)经典方法:于6孔培养板分别接种NIH3T3细胞2×105/孔,培养12 h 后分别以0.5 ml、50 μl和5 μl带有GFP 标记基因的病毒感染,聚凝胺终浓度为8 μg/ml,48 h后以流式细胞仪检测细胞eGFP 率。病毒滴度(TU/ml)=(2×105×细胞eGFP 率)/病毒原液体积。(2)LaSRT法:NIH3T3 细胞以5 000/孔接种于96 孔板,12 h后更换成完全培养液90 μl/孔,以8孔为一组,第1 孔中加入病毒液10 μl,此后每孔依次10∶1 倍比稀释,聚凝胺终浓度为8 μg/ml,48 h后以浓度自高到低的方向,在荧光倒置显微镜下确定计量孔(第n孔),计数孔中的阳性细胞数m。病毒滴度(TU/ml)=m×10n 1。(3)对7批病毒以LaSRT法研究,探讨冻存/复苏过程对重组病毒滴度的影响。结果经典方法测定的重组病毒滴度为(1.54±0.38)×106 TU/ml,LaSRT法测定的病毒滴度为(1.33±0.57)×106 TU/ml,两者无统计学差异(P>0.05)。LaSRT法可以大批量、快速地测定以GFP为标记基因的重组病毒滴度。单次冻存/复苏后的病毒滴度为冻存前的(18.1±9.9)%(n=7)。结论LaSRT法和经典方法测定以GFP为标记基因的重组病毒滴度,结果无统计学差异;LaSRT法获得结果简     

人巨细胞病毒蚀斑实验条件的优化及在抗病毒物质活性测定中的应用

目的探讨人巨细胞病毒（HCMV）的蚀斑形成实验最适工作条件,建立稳定易行的HCMV蚀斑技术,用于HC-MV的定量测定及体外抗病毒物质活性测定的研究。方法HCMV病毒悬液接种至人胚成纤维细胞（HF）单层,37℃吸附1h,分别用含0.463‰、0.925‰NaHCO3及0.5%、1%DMSO琼脂糖覆盖,1周后加盖第2层;2周后用0.5%结晶紫染色5min,计数、计算pfu/ml,采用PCR法对蚀斑培养物进行鉴定;分别用患者血清及HCMVAD169株兔免疫血清进行蚀斑抑制实验,计算中和抗体滴度;蚀斑减少实验测定不同浓度更昔洛韦（GCV）的抗HCMV活性。结果HCMV对照孔在5d出斑,蚀斑为圆形、实心、不透明状;两种浓度NaHCO3对蚀斑形成数量、大小有明显影响且病毒滴度差异有显著性（P〈0.05）。在含0.463‰NaHCO3培养孔内,出斑时间提前至3d;但不同浓度的DMSO对蚀斑数量、大小以及病毒滴度的影响差异无显著性（P〉0.05）。HCMV患者血清及HCMVAD169株兔免疫血清均可以抑制蚀斑形成。利用蚀斑减少实验测定GCV抗HCMV活性,可在7d内获得结果。结论HCMV蚀斑形成实验条件经优化后,可以方便稳定地对HCMV进行定量测定以及抗病毒活性物质的筛选和评价。     

多孔板对B型流感病毒分离影响因素分析

目的 研究B型流感病毒在不同多孔板中的生长情况，探索其合适的分离条件。方法 对4株B型流感病毒进行血凝鉴定后将滴度调整到1∶32,稀释10 000倍后接种于6孔板，按接种量(0.40ml、0.60ml、0.80ml和1.00ml)分为4组，吸附后每组加入2.00ml、2.50ml、3.00ml和3.50ml病毒维持液。接种于24孔板，按接种量(0.10ml、0.15ml、0.20ml和0.25ml)分为4组，吸附后每组加入0.80ml、1.00ml、1.20ml和1.40ml病毒维持液，每24h观察致细胞病变并进行血凝滴度(hemagglutination titer, HA)鉴定。采用χ²检验对不同多孔板的HA进行分析。结果 随时间增长，病毒滴度均增加，所有致细胞病变均有滴度，6孔板每24h检测各孔滴度均能达到1∶8以上，B/Yamagata和B/Victoria亚型滴度最高为1∶256,24孔板每24h检测各孔阴阳性不一，B/Victoria亚型的滴度最高为1∶16,B/Yamagata亚型的滴度最高为1∶32。不同多孔板的HA差异有统计学意义(χ^2...     

蚀斑法定量测定HSV-2病毒颗粒的优化实验条件

目的 建立稳定易操作的HSV-2蚀斑技术,为纯化和定量测定HSV-2毒株的感染性研究提供依据。方法HSV-2病毒悬液接种至Hela细胞单层,分别经37℃吸附和室温吸附60min,用含0．75％琼脂糖或0．75％羧甲基纤维素RPMI 1640液覆盖,3d后用1％结晶紫染色5min,记数蚀斑数量,在挑取蚀斑接种扩增及保祓的同时,应用PCR法对蚀斑培养物进行鉴定。结果 蚀斑经1％结晶紫染色在Hela细胞单层上呈紫色,多为圆形,着色深,散在分布,与周围区域界限明显。用琼脂糖和羧甲基纤维素覆盖下所形成的蚀斑大小及形状不同,但病毒滴度差异无显著性（P〉0.05）。经室温和37℃吸附的病毒滴度差异亦无显著性（P〉0．05）。结论 建立了简便易行的蚀斑形成测定方法,可准确滴定HSV-2病毒感染数量和感染力。     

消毒剂对脊髓灰质炎病毒感染力灭活的研究

目的：评价微量组织培养半数感染量病毒滴定法（简称微量ＴＣＩＤ５０法）检测４种常用消毒剂对脊髓灰质炎病毒（ｐｏｌｉｏＶ）的灭活效果。方法：将ＰｏｌｉｏＶ滴定于９６孔细胞培养板中的细胞上进行培养，测定病毒接触消毒剂前后感染细胞的滴度。结果：２％碱性戊二醛、１％二氯异氰尿酸钠（５２００ｍｇ·Ｌ１）５ｍｉｎ内能有效杀灭ｐｏｌｉｏＶ（病毒滴度下降≥３ｌｏｇ），０．２％过氧乙酸和０．５％碘伏（４０００ｍｇ·Ｌ１）需１０ｍｉｎ（病毒滴度下降＞３ｌｏｇ）。结论：用微量ＴＣＩＤ５０法评价消毒剂对病毒的灭活效果，客观、灵敏、简便易行     

噻唑蓝(MTT)法空斑形成实验在病毒检测中的应用

目的:探讨噻唑蓝(MTT)法空斑形成实验在病毒滴度检测中的应用。方法:用噻唑蓝(MTT)代替常规的中性红作为染色剂进行空斑形成实验MDCK和Hep-2细胞在12孔板上形成单层后,分别感染流感病毒和呼吸道合胞病毒,加入单层琼脂糖代替传统双层琼脂糖培养3-4天,用噻唑蓝(MTT)代替常规的中性红作为染色剂计数空斑。结果:⑴MTT法空斑形成实验检测流感病毒和RSV病毒滴度操作简单,时间短;⑵与常规中性红法空斑形成实验比较检测病毒滴度没有差异;⑶MTT法可以避免假空斑形成。结论:MTT法空斑形成实验可替代中性红法空斑形成实验,且更快速、准确。     

双黄连、鱼腥草注射液抗鼠肝炎病毒3型的体外实验研究

目的:探讨双黄连、鱼腥草在细胞水平对鼠肝炎病毒3型(murine hepatitis virus,MHV-3)是否具有抑制作用。方法:细胞培养、蚀斑试验测定病毒滴度;MTT法进行药物毒性试验;蚀斑抑制试验检测双黄连、鱼腥草的抗MHV-3活性。结果:双黄连半数中毒质量浓度(TC50)为6 100μg.m l-1,抗MHV-3病毒的半数抑制质量浓度(IC50)为304.9μg.m l-1;鱼腥草的分别为500、22.06μg.m l-1。治疗指数(TI)双黄连为20.07,鱼腥草为22.67。两种中药成分对MHV-3病毒的抑制作用均存在明显的量效反应关系(P<0.01)。结论:双黄连、鱼腥草在细胞水平有显著的抗MHV-3作用。     

两种HSV-1及猴B病毒相关抗体测定方法的比较

目的以人单纯疱疹病毒(HSV-1)做为抗原,利用空斑法和IFA法比较猴BV和人HSV-1阳性血清两种不同血清的中和能力的差异,建立一种实用、准确、可靠的病毒毒力的检测方法。方法首先,将HSV-1病毒悬液作连续的10倍稀释,取1 mL接种于已经长成单层的Vero-E6细胞上,用1%甲基纤维素覆盖,待其出现蚀斑后计数,算出病毒悬液中每毫升所含蚀斑单位,即滴定出HSV-1的TC ID50。同时,用免疫荧光方法(IFA)对猴和人疱疹阳性血清进行滴定,得到其血清的效价。其次,用滴定出的病毒液分别与两种阳性血清体外中和后,接种到单层的Vero-E6细胞上,用1%甲基纤维素覆盖,待其出现蚀斑后计数。最后,计算出其蚀斑减少率。结果用1%甲基纤维素作覆盖层的蚀斑数量平均为10-5PFU,能形成115~116个/mL蚀斑,形状呈黍米大小的规则圆形,其蚀斑边缘清晰。IFA滴定的人HSV-1阳性血清与猴BV阳性血清的中和抗体均为1∶80。人HSV-1和猴BV两种阳性血清的空斑减少率均为100%。结论确定了利用1%甲基纤维素做为覆盖层可得到清晰可靠的蚀斑,由此方法检测到用人HSV-1可以代替猴B病毒,筛查猴B病毒抗体。且为将来进行药物筛选和中和实验中利用病毒空斑法建立方便、可靠的方法。     

RT-RCR产物固相杂交-酶联显色方法检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度

目的应用RT-PCR-EIJSA方法检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度。方法应用固相杂交一酶联显色方法，将标记有生物素的寡核苷酸引物所扩增的疫苗病毒基因产物，与微孔反应板上的特异性探针进行快速杂交，通过辣根过氧化物酶标记的链亲和素进行酶联显色，读取光密度值(OD值)，判断结果。应用此法检测了11批甲肝活疫苗滴度。并与常规细胞培养法(CCID50)比较。结果证明本方法与细胞培养法(CCID50)的敏感性相仿，具有简便、快速、特异的优点。结论RT-PCR-EIJSA法有望代替常规细胞培养法应用于甲肝减毒活疫苗病毒滴度的检测。     

消毒剂对脊髓灰质炎病毒感染力灭活的研究

目的：评价微量组织培养半数感染量病毒滴定法检测４年种常用消毒剂对脊髓灰质炎的灭活效果。方法：将ＰｏｌｉｏＶ滴定于９６孔细胞培养板中的细胞上进行培养，测定病毒接触消毒剂前后感染细胞的滴度。结果：２％碱性戊二醛、１％二氯异氰尿酸钠（５２００ｍｇ．Ｌ＾－１）５ｍｉｎ内能有效杀灭ｐｏｌｉｎｏＶ，０．２％过氧乙酸和０．５％碘伏需１０ｍｉｎ。结论：用微量ＴＣＩＤ５０法评价消毒剂对病毒的灭活效果，客观，灵活、简     

RT—PCR—ELISA方法检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度的初步研究

目的应用核酸扩增产物测定的固相杂交酶联显色法(RT-PCR-ELISA)检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度。方法应用RT-PCR-ELISA，将标记有生物素的寡核苷酸引物所扩增的疫苗病毒基因产物，与微孔反应板上的特异性探针进行快速杂交，通过辣根过氧化物酶标记的链亲和素进行酶联显色，读取吸光度(A值)，判断结果。应用此法检测了11批甲肝活疫苗滴度，并与常规细胞培养法(CCID50）比较。结果本方法与细胞培养法的敏感性相仿，具有简便、快速、特异的优点。结论RTPCR—EUSA法有望代替常规细胞培养法应用于甲肝减毒活疫苗病毒滴度的检测。     

逆转录病毒滴度测定新方法的实验研究

[目的]研究一种简便、快速的能获取较高病毒滴度的体外培养方法.[方法]用质脂体转移法将逆转录病毒载体pLXIn转染到包装细胞PA317中,用G418筛选出抗性克隆,扩大培养,再收集上清,并测定病毒滴度.比较不同方法产生病毒的多少,为提高病毒滴度而进一步感染靶细胞奠定良好的实验基础.[结果]改良后的新方法(低温32℃、无CO2条件以及反复冻融法)较常规方法(37℃、5% CO2)可提高病毒滴度至少10倍.PTs,Ptas和PLXIn组病毒颗粒数分别提高到1.3×105CFU/ mL、1.2×105CFU/ mL、1.5×105 CFU/ mL.[结论]逆转录病毒滴度测定新方法简便、快捷,能获取较高病毒滴度.     

北京株水痘减毒活疫苗病毒滴度稳定性的初步考察

目的初步考察北京株(VZV84-7)水痘减毒活疫苗病毒滴度的稳定性。方法将成都生物制品研究所有限责任公司(简称成都公司)连续生产的3批北京株水痘减毒活疫苗分别置2~8℃、25℃、37℃保存不同时间,采用蚀斑形成单位(PFU)试验检测不同时间点疫苗的病毒滴度,考察其稳定性。结果疫苗在2~8℃条件下保存18个月,25℃保存12个月,病毒滴度均符合《中华人民共和国药典》的要求;疫苗在37℃保存4周,虽然病毒滴度均符合质量标准的要求,但部分批次从第3周开始,热稳定性已不符合质量标准的要求。结论成都公司生产的北京株水痘减毒活疫苗病毒滴度的稳定性良好。     

用蚀斑形成试验分离虫媒病毒

本文报告用蚀斑形成试验分离虫媒病毒。从643个蚊虫混合标本中分离到乙脑病毒104株,甲病毒1株。经过C6/36白纹伊蚊细胞增殖后,标本阳性率为14.2％,直接从蚊虫混合标本分离的阳性率为13.2％,前者的蚀斑数显著高于后者(P<0.001)。乙脑病毒蚀斑于接种后第4～9天出现,直径约6mm,边缘较模糊。甲病毒蚀斑于接种后第2～3天出现,直径1～2mm,较乙脑病毒小。用蚀斑形成试验分离虫媒病毒的优点是可以根据蚀斑的形态和出现时间,初步区别分离物是甲病毒属或黄病毒属。     

基于Vero E6细胞的抗SARS药物筛选方法的构建

目的 构建基于Vero-E6细胞的抗SARS药物筛选模型。方法 运用四唑氮化合物(MTS)方法，对由SARS病毒(BJ-01)引起的对Vero-E6细胞的细胞毒性作用进行检测。首先优化了实验条件(检测了MTS不同孵育时间和不同接种细胞数对测试结果的影响，并绘制了病毒滴度曲线)；在检测化合物的抗病毒作用时，首先将细胞接种于96孔板中，加入待测药物和BJ-01病毒，48h后用显微镜观察细胞形态变化，96h后加入MTS和电子耦联剂(PMS)的混合溶液，在490nm检测其吸光度。结果 对4000多种化合物的抗SARS病毒作用进行了检测。获得10种可能有抗SARS病毒作用的药物。结论 基于Vero-E6细胞的MTS检测方法提供了一种快速、安全和方便的抗SARS药物筛选方法。     

沃尔巴克氏体抑制流行性乙型脑炎病毒感染的研究

目的 了解沃尔巴克氏体介导的抗病原体特性能否干扰流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)复制，探讨沃尔巴克氏体对库蚊传播的JEV复制的调控作用。方法 通过实时荧光定量PCR和RNA原位杂交检测Aa23白纹伊蚊细胞(天然感染沃尔巴克氏体)和阴性对照Aa23T白纹伊蚊细胞(以四环素处理清除沃尔巴克氏体感染)，定量分析沃尔巴克氏体的生长浓度；通过病毒蚀斑滴定检测Aa23细胞(天然感染沃尔巴克氏体细胞系)和阴性对照Aa23T细胞(不含沃尔巴克氏体的细胞系)在感染JEV(P3株)后第1天至第8天的病毒复制滴度和细胞病变效应。结果 实时荧光定量PCR和RNA原位杂交分析结果表明，Aa23T细胞中沃尔巴克氏体感染呈阴性，Aa23细胞中沃尔巴克氏体的WSP基因拷贝数和靶向沃尔巴克氏体16S rDNA的荧光信号强度随细胞生长时间增长而增高；蚀斑滴定实验结果显示，携带沃尔巴克氏体的细胞系(Aa23)感染JEV后出现细胞病变的时间明显延迟，Aa23细胞中病毒复制滴度(106PFU/mL)与对照细胞病毒复制滴度(10⁸PFU/mL)相比明显降低...     

大蒜新素注射液抗鼠肝炎病毒3型的体外实验研究

目的：探讨大蒜新素（allitridin）在细胞水平对鼠肝炎病毒3型（mice hepatitis virus,MHV-3）的抑制作用.方法：细胞培养、蚀斑试验测定病毒滴度;MTT法进行药物毒性试验;蚀斑抑制试验检测大蒜新素的抗MHV-3活性,改变给药时间探索大蒜新素抗MHV-3作用环节.结果：大蒜新素半数中毒浓度（TC50）为75 mg/L,抗MHV-3病毒的半数有效浓度（IC50）为2.7 mg/L,治疗指数（TI）为27.78,大蒜新素对MHV-3病毒的抑制作用存在明显的量效反应关系（P＜0.01）,并且对MHV-3病毒有预防和中和作用（P＜0.01）.结论：大蒜新素在L2细胞中对MHV-3病毒有明显的抑制作用,其作用机制是多途径的.     

应用ELISA法检测人体血清中HFRS抗体的研究

目的：通过检测人体血液中抗肾综合出血热（HFRS）病毒抗体产生情况，分析人体体液免疫效果。方法：以HFRS病毒灭活纯化抗原为包被Ag以HRP-兔抗人IgG结合物为标记抗体，应用间接EUSA法检测随机抽取的20组HFRS双价纯化疫苗接种者免疫前、后血清抗体的产生情况，并采用蚀斑减少中和试验（PRNT）法进行中和抗体的检测。结果：第1针免疫后14天与免疫前比较，90％以上的血清抗体滴度有4倍以上升高；第2针免疫后14天与第1针免疫后14天比较，100％的血清抗体滴度有4倍以上升高；第2针免疫后14天中和抗体阳转率则达90％以上。结论：应用间接ELISA法检测人体血清中HFRS抗体产生情况可以用于分析疫苗免疫前后人体体液免疫效果。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型在单层细胞培养中的增殖特征

目的：通过对HSV-1在BHK-2l单层细胞培养中的增殖特征的研究，得出获得较高病毒含量的条件，从而对基础研究以及今后即将开展的临床病毒培养进行指导。方法：使用不同滴度的HSV-1毒株接种不同浓度培养的BHK-2l单层细胞，病毒感染后用免疫荧光法及ELISA法检测病毒滴度，并绘制曲线。结果：在细胞传代时，较大浓度的细胞在长成单层细胞后对病毒敏感性较高，并随细胞浓度减少而逐渐下降，但如将病毒滴度控制在适当范围内，仍可得到较高的病毒含量。结论：如需获得较高滴度的病毒悬液，应将培养用单层细胞以较大浓度传代或使接种病毒滴度处于适当范围。