口服鼠疫F1-V重组融合基因DNA活菌疫苗的构建及免疫原性研究

目的 构建携带鼠疫耶尔森菌F1-V融合基因的重组减毒沙门菌苗,口服免疫Balb/c小鼠检测其免疫原性,为口服鼠疫活载体DNA疫苗研究打下基础.方法 将F1-V融合基因克隆到真核表达载体asd-pVAX1,进一步依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd-pVAX1/F1-V),提取重组质粒转染COS-7细胞并做免疫组化和Western-blot检测F1-V融合蛋白在细胞中的表达.以1×109CFU/只的剂量3次口服免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测血清中抗体水平.结果 构建的重组减毒沙门菌转染COS-7细胞后,免疫组化和Western-blot试验证明F1-V融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清有特异性抗体IgG产生.结论 构建的重组沙门菌能运送DNA疫苗到体内并成功释放质粒刺激机体产生特异性免疫应答,为口服鼠疫活载体DNA疫苗的黏膜免疫研究打下了基础.     

以减毒沙门菌为载体布鲁氏菌DNA疫苗的构建及免疫原性分析

目的 构建携带布鲁氏菌BLS-L7/L12融合基因的重组减毒沙门菌并进行免疫原性分析,为口服布鲁氏菌DNA疫苗研究奠定基础.方法将BLS-7/L12融合基因克隆到真核表达载体asd -pVAX1,依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd -pVAX1-BLS-L7/L12).以1×109CFU/只的剂量口服免疫Balb/C小鼠,3次免疫后进行免疫效果的评价.结果构建的重组减毒沙门菌质粒转染COS-7细胞经免疫组化和Western-blot试验证明BLS-L7/L12融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清和肠黏液中有特异性抗体IgG和sIgA产生.通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主.结论 所构建的以重组沙门菌为载体口服布鲁氏菌DNA疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,且以细胞免疫应答为主.可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗.     

H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位核酸疫苗构建及表达研究

目的构建表达A型流感病毒多种表位的核酸疫苗，并研究其在幼仓鼠肾细胞（BHK细胞）内表达产物的生物学活性。方法筛选流感病毒主要抗原（HA、NA、NP、M）表位基因，以生物信息学软件优化其排列结构，合成流感通用的复合多表位基因（Epi），以H5、H7亚型流感病毒HA融合表达基因为骨架，将多表位基因Epi插入构建H7HA-Epi-H5HA阅读盒，定向克隆至pVAX1，构建抗A型流感H3579亚型的pVAX1-H7HA-Epi-H5HA。最后将该重组质粒转染BHK细胞，提取细胞总RNA，以RT-PCR方法检测目的基因；以间接免疫荧光试验（IFA）初步测其表达产物抗原性。结果RT-PCR检测到目的基因；IFA检测到特异性荧光存在。结论本试验所构建的重组质粒pVAX1-H7HA-EpiH5HA，在真核细胞内均获了有效地转录和表达；而且其表达产物均能与相应的抗体特异性结合，证明了其具有一定的生物学活性和抗原性，有望成为抗多种A型流感病毒的通用核酸疫苗。     

Survivin-△Ex3蛋白HLA-A2．1限制性CTL表位的基因疫苗抗肿瘤效果初探

预测并合成survivin-△Ex3 HLA-A2．1限制性CTL表位的基因疫苗,探讨携带表位基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗对小鼠移植肝癌模型的保护作用。将表位基因序列连接,构建pVAX1-STEs-EGFP真核表达载体,转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗。实验动物分为未免疫对照组、口服沙门氏菌组、pVAX1质粒转染的减毒鼠伤寒沙门氏菌组;口服pVAX1-Survivin-△3（T34A）！ EGFP质粒转染的的减毒鼠伤寒沙门氏菌组和口服pVAX1-STEs ！ EGFP质粒转染的的减毒鼠伤寒沙门氏菌组。结果表明：在5组肿瘤模型小鼠中,肿瘤瘤块平均直径分别为：15．11±2．43 mm、13．70±2．97 mm、13．05±1．77 mm、7．46±2．61 mm、9．05±2．18 mm;表位疫苗组与其他组相比,有显著性差异（P＜0．01）。说明小鼠口服携带survivin-△Ex3 HLA-A2．1限制性CTL表位的基因疫苗后,能抑制小鼠肝癌细胞的增殖和扩散。     

流感疫苗株为载体的重组HAdV疫苗候选株构建及免疫效果

目的以冷适应、减毒流感活疫苗株为载体,构建并拯救喷鼻重组HAd V疫苗候选株,并评价其免疫效果,为腺病毒候选疫苗研制提供实验数据。方法应用反向遗传学技术,以冷适应、减毒流感活疫苗A/Ann Arbor/6/60ca(H2N2)株为骨架,与季节性流感病毒A/California/07/209疫苗株的血凝素(haemagglutination,HA)及插入HAd V六邻体蛋白抗优势原表位的2个重复序列经改造的神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因构建流感病毒八质粒系统,转染COS-1/MDCK细胞筛选疫苗候选株并鉴定;制备的候选疫苗株滴鼻免疫Balb/c小鼠,通过中和抗体、s Ig A黏膜抗体及细胞因子的测定评价其免疫原性,并用野生HAd V-7病毒株攻击评价免疫保护效果。结果成功拯救获得重组HAd V疫苗候选株,命名为rg Flu/HAd V-Ca,其形态符合流感病毒典型特征,可有效表达HAd V病毒Hexon优势表位,且具有冷适应、减毒表型。小鼠免疫后可产生针对HAd V-7及H1N1流感病毒的特异性中和抗体,肺鼻灌洗液中可检测到针对HAd V-7中和抗体s Ig A抗体,并可检测到脾淋巴细胞分泌HAd V-7特异性细胞因子IFN-γ、IL-4;攻毒实验显示,rg Flu/HAd V-Ca疫苗候选株可有效降低小鼠肺病毒载量。结论重组冷适应、减毒HAd V活疫苗株rg Flu/HAd V-Ca具有良好的免疫效果,为腺病毒候选疫苗的研制提供了新思路。     

含H5N1-HA基因重组腺病毒疫苗的构建及其诱导免疫应答的初步探讨

目的 构建包含H5N1-HA基因的重组腺病毒疫苗并探讨其免疫效果.方法 用Admax系统构建包含H5N1-HA基因的重组腺病毒疫苗,并用PCR、Western-Blot等方法对重组病毒疫苗进行鉴定;疫苗免疫小鼠后,通过HI实验和ELISPOT实验检测其体液免疫和细胞免疫反应,评价其免疫效果.结果 成功得到了含有H5N1-HA基因的重组腺病毒疫苗;基因表达鉴定表明,HA基因能够在细胞中进行表达;血凝抑制实验结果显示小鼠产生的针对HA抗体滴度在1:320和1:640之间;ELISPOT结果显示实验组和对照组(PBS)相比斑点数量差异有统计学意义(P<0.05),以上免疫结果表明重组腺病毒载体疫苗可以诱导小鼠产生良好的特异性体液和细胞免疫反应.结论 含H5NA-HA的重组腺病毒疫苗可以诱导小鼠产生良好的免疫反应,为研制人禽流感疫苗打下基础.     

鼠疫耶尔森氏菌核酸疫苗的构建及其免疫学评价

目的获得鼠疫F1和V抗原的重组质粒pVAX1/F1和pVAX1/V,并比较其诱导的特异性免疫应答的能力。方法PCR扩增鼠疫菌F1和V编码基因,分别与pGEMT连接测序,构建pVAX1/F1和pVAX1/V重组质粒,转染COS7细胞。用细胞免疫化学方法鉴定目的蛋白的表达,重组质粒加GMCSF免疫Balb/c小鼠,观察免疫效果。结果F1和V均在COS7细胞中表达;免疫鼠体内产生特异性抗体,pVAX1/V所诱导的抗体水平比pVAX1/F1高;通过抗体亚型分析、细胞因子和CD分子等指标的测定表明所构建DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主。结论成功构建重组真核表达质粒pVAX1/F1和pVAX1/V,并且均具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础。     

tPA信号肽和鼠疫杆菌保护性抗原V融合基因的构建及免疫效果鉴定

获得含有鼠疫杆菌V抗原编码基因以及tPA信号肽编码序列的重组质粒,并测定其诱导特异性免疫应答的能力。采用PCR扩增鼠疫菌杆菌V基因构建到pVAX1质粒中产生pVAX1/V重组质粒,PCR扩增tPA信号肽编码序列片段并将其插入到pVAX1/V中V基因的上游,构建tPA-pVAX1/V重组质粒;转染COS-7细胞,免疫细胞化学方法鉴定V蛋白的表达;二重组质粒分别加mGM-CSF质粒免疫BALB/c小鼠,观察免疫应答反应;以400个LD50强毒鼠疫杆菌皮下攻击免疫小鼠观察保护效率。结果显示,tPA-pVAX1/V在COS-7细胞中表达了V蛋白;免疫小鼠血清产生了特异性抗体和细胞免疫应答;攻毒保护率达80%。成功构建了分泌型V蛋白的真核表达质粒载体,具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,对强毒鼠疫杆菌攻毒有一定的保护效力,为鼠疫杆菌新型疫苗研制奠定了基础。     

鼠疫菌重组质粒pcDNATE/F1-V的构建及其免疫效果的研究

目的 获得含有鼠疫F1和V抗原编码基因的重组质粒pcDNATE／E1-V,并测定其诱导特异性免疫应答的能力。方法PCR扩增鼠疫菌F1和V编码基因,分别与pGEM-T连接测序,构建pcDNATE／F1-V融合重组质粒,转染COS-7细胞,用Western blot方法鉴定目的蛋白的表达,重组质粒pcDNATE／E1-V加集落刺激因子(GM-CSF)免疫Balb／c小鼠,观察免疫效果。结果pcDNATE／F11-V在COS-7细胞中表达,免疫鼠体内产生特异性抗体,抗体亚型分析、细胞因子等指标的测定结果表明所构建DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主。结论成功构建重组真核表达质粒pcDNATE／F1-V,其具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础。     

中国株HIV-1外膜蛋白基因疫苗诱导免疫小鼠免疫应答的实验研究

目的 :构建中国流行株HIV 1外膜蛋白 (gp12 0 )基因疫苗并接种小鼠 ,评价其诱导的体液和细胞免疫应答。方法 :将HIV 1gp12 0基因插入到真核表达载体pVAX1中 ,构建重组真核表达质粒pVAX1 GP12 0 ,并经EcoRI和PstI双酶切以及测序鉴定。同时以pVAX1 GP12 0和空载体pVAX1分别免疫BALB/c小鼠 ,采用ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN γ水平 ,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖 ,用乳酸脱氢酶 (LDH)试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的应答。结果 :酶切及测序结果表明 ,成功地构建了HIV 1gp12 0基因疫苗。与空载体pVAX1组相比较 ,pVAX1 GP12 0免疫组小鼠血清抗HIV 1gp12 0抗体的滴度和IFN γ的水平均升高 ,两者差异显著 (P <0 .0 1)。pVAX1 GP12 0免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数 (SI)及特异性CTL的杀伤活性 ,均高于空载体pVAX1组 (P <0 .0 1)。结论 :构建了针对我国HIV 1流行株的gp12 0基因疫苗。以其免疫BALB/c小鼠可诱导特异性体液和细胞免疫应答 ,为进一步将其用于我国的HIV的治疗奠定了基础。     

Surface glycoproteins of influenza A H3N2 virus modulate virus replication in the respiratory tract of ferrets

The hemagglutinin (HA) genes of the influenza A H3N2 subtype viruses isolated from 1968 to 2010 have evolved substantially but their neuraminidase (NA) genes have been relatively less divergent. The H3N2 viruses isolated since 1995 were found to replicate in the lower respiratory tract of ferrets less efficiently than the earlier isolates. To evaluate whether the HA or/and NA or the internal protein gene segments of the H3N2 virus affected viral replication in the respiratory tract of ferrets, recombinant A/California/07/2004 (CA04) (H3N2) virus and its reassortants that contained the same CA04 internal protein gene segments and the HA and/or NA of A/Udorn/309/1972 (UD72) or A/Wuhan/359/1995 (WH95) H3N2 viruses were generated and evaluated for their replication in the respiratory tract of ferrets. All the reassortant viruses replicated efficiently in the upper respiratory tract of ferrets, but their replication in the lower respiratory tract of ferrets varied. In contrast to the UD72-HA reassortant virus that replicated efficiently in the lungs of ferrets, the virus with the WH95-HA or the CA04-HA either replicated modestly or did not replicate in the lungs of ferrets. The reassortants with the WH95-HA and UD72-NA or CA04-NA had the tendency to lose a N-linked glycosylation site at residue 246 in the HA, resulting in viral lung titer of 100-fold higher than the virus with the HA and NA from WH95. The UD72-NA had the highest neuraminidase activity and increased viral replication by up to 100-fold in tissue culture cells during early infection. Thus, our data indicate that both the HA and NA glycoproteins play important roles in viral replication of the H3N2 influenza virus in ferrets.     

H5N1流感疫苗株在Vero细胞中的研究[英文]

目的产生在Vero(非洲绿猴肾)细胞中能高适应生长的重配H5N1流感病毒疫苗株,并对其生物学特性进行初步测定。方法修饰A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)的NS基因为Vero细胞适应型,并合成NS基因片段,构建质粒pHW2000-NS;通过RT-PCR方法,扩增疫苗株A/Anhui/01/2005(H5N1)的HA、NA基因片段,构建质粒pHW2000-HA、pHW2000-NA;以PR8的其它5个内部基因作为骨架,按照1+2+5模式8质粒共转染Vero细胞拯救流感病毒,并对拯救病毒的生物学特性进行检测。结果由Vero拯救出具有高适应生长特性的H5N1亚型人禽流感病毒疫苗株,并检测了重配疫苗株的生物学特性。结论成功从Vero细胞拯救了具有Vero细胞高适应性生长特性的H5N1亚型人禽流感病毒疫苗株,为应用Vero细胞大规模生产流感疫苗奠定了基础。     

表达pCDR1 Th表位减毒鼠伤寒沙门菌株的构建

目的构建表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株。方法全基因合成pCDR1两条核苷酸链,在C端加上6-His标签,退火互补后插入原核表达载体pYA3149中,构建重组质粒pR1,将该重组质粒转入鼠沙门菌终宿主菌株X4550,获得杂合菌株X4550（pR1）。体外诱导表达后斑点印迹鉴定表位肽的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。体外诱导后6h细菌裂解上清液中,检测到表位肽的表达,该蛋白能与鼠抗His单克隆抗体特异结合。重组菌株在体外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖。结论成功构建了能稳定表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株。     

应用巢式RT-PCR扩增HA和NA基因片段并测序鉴定甲型H1N1流感病毒

目的 建立一种利用巢式RT-PCR特异扩增HA和NA基因片段并测序鉴定甲型H1N1流感病毒的技术.方法 设计两套共7条特异引物,通过巢式RT-PCR分别扩增甲型H1N1流感病毒HA和NA基因片段并测序,所得序列与人感染甲型流感病毒主要HA和NA亚型序列进行进化树分析以对结果作进一步鉴定,蛋白序列比对后分析其特征.结果 4例甲型H1N1流感患者流感病毒HA和NA基因RT-PCR扩增均分别得到442 bp和543 bp片段产物.核苷酸序列进化分析表明,该4例患者HA和NA序列分别与2009年爆发的甲型H1N1流感病毒HA及NA序列聚集在一起,与季节性H1、H2、H3、人禽流感H5亚型及季节性N1、N2、人禽流感N1亚型特异分开.蛋白序列分析表明,4例患者流感病毒HA蛋白裂解位点附近氨基酸序列均为PSIQSR↓GLF,不具有高致病性流感病毒的特性,NA蛋白第275位氨基酸为His,未出现H275Y的耐药变异.结论 本方法能特异扩增甲型H1N1流感病毒HA和NA基因片段,测序后可用于甲型H1N1流感病毒的进一步鉴定;同时,得到的序列也可用于流感病毒致病力及耐药性的分析.     

H5N1亚型流感病毒M2与NA基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建表达H5N1亚型流感病毒M2和NA基因的多种真核表达载体.方法 以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒（A/Anhui/1/2005）作为研究对象,PCR扩增全长M2与NA基因.将M2基因克隆入真核表达载体pStar的IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-M2/和pStar-/M2.将NA基因克隆人pStar载体IRES上游或下游的MCS,构建重组pStar-NA/和pStar-/NA.将M2和NA基因先后克隆到pStar载体IRES序列的上游和下游MCS,分别构建双基因共表达重组pStar-M2/NA和pStar-NA/M2.将重组质粒转染293细胞,使用IFA方法 检测各重组质粒相应外源基因的表达.结果 通过酶切鉴定,各重组质粒构建正确.将其转染293细胞后,使用IFA方法 检测到了各重组质粒中相应外源基因的表达.结论 构建了多种表达H5NI亚型流感病毒M2和（或）NA基因的真核表达载体,为研究开发流感DNA疫苗奠定了基础.     

甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体的构建与表达

目的:构建甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏首例甲型H1N1流感病毒毒株(A/Nan jing/1/2009(H1N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。West-ern blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功克隆NS1全长基因,并构建了其真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料。     

沙眼衣原体主要外膜蛋白在减毒鼠伤寒杆菌中的表达及 …

目的 采用作为疫苗载体的减毒鼠伤寒杆菌致死性平衡系统,构建能异源表达沙眼衣原体（Ｃｔ）主要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）的重组菌株。方法 以Ｄ型Ｃｔ的ＤＮＡ为模板,用所设计的特异性引物扩增编码Ｃｔ ＭＯＭＰ高变区（ＶＤＩ～ＶＤＩＶ）基因,并将扩增产物定向克隆至质粒ｐＵＣ１９中。序列分析后,再亚克隆至与减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４５５０互补的质粒ｐＹＡ３３４１中,以重组质粒转化减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４５５０。结果 对构建的重     

鼠精子表面蛋白cyritestin在沙门氏菌平衡致死系统中的高效表达

目的 松建表达鼠精子cyritestin蛋白的可口服减毒沙门氏菌活疫苗株。方法 将编码成熟cyritestin蛋白cDNA序列的酶切片段插入含pUC复制子的表达载体pYA3339中,构建重组质粒pMCY,将该重组质粒转入鼠沙门氏伤寒杆菌疫苗株X4550,获得杂合菌株X4550（pMCY）。应用 western blot对重组菌所表达的重组cyritestin蛋白进行免疫分析,结果 该无抗药性的杂合菌株在体外营养选择压力下可较稳定携带重组质粒传代繁殖,在体内可较稳定地定居于Peyer‘s结、肠系膜淋巴结和脾脏。该重组菌可高水平表达重组cyritestin蛋白。结论 高效表达cyritestin蛋白的X4550（pMCY）疫苗株可用于免疫性避孕研究。     

堆型艾美耳球虫cSZ1基因在减毒沙门氏菌的表达及免疫保护效果研究

用PCR方法扩增堆型艾美耳球虫广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的阅读框架 (ORF) ,与质粒表达载体pYA3342连接后转化大肠杆菌E-coliX6 2 12 ,获得阳性重组质粒后将其电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)X4 5 5 0。经IPTG诱导获得了cSZ1基因在减毒S typhimurium的高效表达 ,表达产物占菌体总蛋白的 9 2 % ,重组蛋白分子量约为 19kDa。将重组减毒S typhimurium分别以 10 8或 10 9CFU 鸡经口免疫 4日龄岭南黄肉鸡 ,免疫后两周血清中可检测到抗cSZ1的特异性IgG ,3周时抗体水平达到峰值 ;2 5日龄时可在肠道检测到特异性IgA的分泌。免疫后 3周 ,试验鸡分别经口攻击感染 5 0 0个E acervulina孢子化卵囊 ,结果显示免疫组与非免疫组有相似的排卵囊曲线 ;计数攻虫感染后第 3 5～ 9 5天卵囊总产量 ,2个免疫组分别能降低 2 5 . 1%和 4 6 . 4 %的卵囊产生。