弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫小鼠诱导体液免疫应答及保护性的初步观察

目的观察弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫BALB/c小鼠诱导其体内产生的体液免疫应答及抗虫感染的免疫保护作用. 方法重组质粒pBK-P30用生理盐水稀释后,肌注免疫BALB/c小鼠.分别于免疫后5周和10周,ELISA测定IgG抗体滴度;取免疫鼠的血液、肺、心脏、肝脏、脾、肾脏及肌肉PCR扩增P30基因;免疫鼠腹腔注射弓形虫速殖子攻击感染.结果两次检测,均可测到特异性IgG抗体,且抗体的滴度随免疫时间的延长而增高;免疫后5周,免疫鼠的上述组织均可扩增出P30基因条带,但免疫后10周仅血液扩增出特异P30基因条带;弓形虫速殖子腹腔攻击感染,免疫组鼠的平均存活时间较对照组鼠延长,但统计学差异不显著(P＞0.05). 结论弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗能诱导BALB/c小鼠产生特异性体液免疫应答及部分抗虫免疫保护作用.     

弓形虫感染家兔精液中虫体DNA检测初报

目的了解弓形虫感染家兔精液中是否有虫体存在，探明虫体在精液中动态变化情况。方法用RH株弓形虫速殖子不同剂量经腹腔感染家兔6只。在家兔感染前后分别采集精液，-40℃冻存备用，分别用普通PCR检测弓形虫感染家兔精液中弓形虫DNA。结果5只家兔在感染后的8～14d死亡，仅1只家兔在感染后的8d和72d，用PCR检测手段在精液中均可检测到弓形虫DNA。结论弓形虫感染雄兔精液中有虫体存在。     

5种方法提取弓形虫速殖子DNA的效果比较

目的用5种方法提取弓形虫速殖子基因组DNA,比较其效果。方法分别以试剂盒法、直接裂解法、煮沸法、酚-氯仿法和盐析法提取10倍系列稀释的弓形虫速殖子DNA,通过分光光度计、琼脂糖凝胶电泳和PCR比较其效果。结果酚-氯仿法提取的DNA纯度最高,煮沸法、盐析法、直接裂解法和试剂盒法依次降低;琼脂糖凝胶电泳可检测出由直接裂解法、酚-氯仿法、盐析法提取1×106个速殖子的基因组DNA;试剂盒法、直接裂解法、煮沸法、酚-氯仿法、盐析法提取的DNA经PCR扩增可检测最少速殖子的数量依次为1×104,无目的条带,1×102,1×101,1×103个。结论酚-氯仿提取的DNA纯度高,用于PCR扩增具有较高的敏感性,但操作相对繁琐;煮沸法操作简单,与除酚-氯仿法外其他3种方法相比具有较高的敏感性。其它3种方法提取的DNA纯度不高,用于PCR扩增的效果不如前面2种。     

应用环介导等温扩增技术检测弓形虫

目的 用环介导等温扩增（LAMP）技术检测弓形虫。 方法　 用酚-氯仿法提取弓形虫速殖子基因组 DNA,设计两对扩增弓形虫 B1基因的 LAMP 引物。以间日疟原虫、恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、日本血吸虫及小鼠白细胞作对照,进行LAMP反应,产物经 SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性。将弓形虫速殖子经倍比稀释为（2～3）×106个/ml至（2～3）×10-1个/ml 等8个浓度,进行LAMP反应,验证该方法的敏感性。 结果 LAMP反应结果显示,弓形虫速殖子检测管经显色后呈绿色,对照组均呈棕色。弓形虫的LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组均无扩增产物。LAMP技术可检测到的弓形虫速殖子最低浓度为2～3个/ml。 结论 LAMP技术在弓形虫检测中显示出较好的特异性与敏感性。     

聚合酶链反应检测日本血吸虫DNA的实验研究

目的探索核酸检测在日本血吸虫病诊断中的应用。方法根据日本血吸虫基因设计特异性引物,采用PCR方法对日本血吸虫的成虫、虫卵、日本血吸虫感染家兔的肝组织、粪便、外周血清标本中的DNA进行扩增,并将虫卵和粪便的模板DNA倍比稀释后进行扩增,以测定PCR扩增法的敏感性。结果从日本血吸虫的成虫、虫卵、日本血吸虫感染家兔的肝组织、粪便和外周血清中均扩增到分子量为230bp的阳性条带,扩增产物经测序并在基因库中匹配,证实为日本血吸虫基因中的一个片段,其同源性为98%。其PCR扩增敏感性检测结果表明,0.021个虫卵DNA模板即可扩增出该特异性阳性条带。结论聚合酶链反应检测日本血吸虫DNA有较高的敏感性,尤其是能从日本血吸虫感染宿主血清中检测出特异性DNA,具有潜在的诊断应用价值。     

原位PCR对弓形虫感染鼠病理检测效果的观察

观察原位PCR方法在弓形虫感染病原学检测中的效果。以RH株弓形虫速殖子感染小鼠后第 2、 4、 6天处死 ,取肝脏制备石蜡标本及冰冻切片标本 ,以直接法原位PCR扩增并检测石蜡标本中的弓形虫DNA ,与免疫组化方法检测冷冻切片标本的结果相比较。 18例直接原位PCR法检测标本中均得到阳性信号 ,病原体检出率为 10 0 % ,优于免疫组化法 (11/18)。直接法原位PCR为检测病理标本中的弓形虫DNA提供了一种新的可行方法。     

弓形虫感染家兔精液中虫体含量的动态变化

目的检测弓形虫感染家兔精液中虫体DNA,观察虫体在精液中动态变化情况。方法用RH株弓形虫速殖子105个/只的剂量腹腔感染雄性家兔16只。在家兔感染前后分别采集精液,-40℃冻存备用,采用两种方法提取精液中总DNA,用实时定量PCR(quantitativereal-timePCR,QRT-PCR)检测弓形虫感染家兔精液中弓形虫DNA,依据对照计算虫体拷贝量,绘制感染后时间与精液中虫体含量的动态曲线图。结果16只雄兔感染前其精液中均不能检测到弓形虫DNA,精液中虫体含量在感染后7wk左右达到高峰期,然后虫体含量逐渐下降。在感染9wk~15wk维持较低水平。结论弓形虫感染雄兔精液中虫体含量随感染后时间不同而变化。     

牛源贾第虫套式PCR检测方法的建立

目的建立牛源贾第虫套式PCR检测方法。方法根据牛源贾第虫TPI基因序列,设计1对保守引物和1对特异性引物,建立套式PCR检测方法;通过阳性参照摸索出该检测方法的最佳反应条件,进行特异性和敏感性试验;并用临床样品进行验证。结果该套式PCR能特异性地扩增出牛源贾第虫基因组DNA中相应片段,与艾美耳球虫、隐孢子虫、环孢子虫、弓形虫、毛首线虫和纤毛虫等10种相关原虫基因组DNA无交叉反应;最低能检测到0.395fg的阳性参照DNA。结论建立的套式PCR方法具有高度的特异性和敏感性,可以用于临床样品的检测。     

刚地弓形虫RH株GRA6分子基因克隆与序列分析

目的　克隆刚地弓形虫 RH株致密颗粒抗原 (Dense granule antigen,GRA6 )分子基因 ,为研究使用重组的GRA6分子作为抗原进行弓形虫病诊断奠定基础。　方法　根据己知的 GRA6序列合成一对引物 ,抽提弓形虫速殖子m RNA,以速殖子 m RNA为模板 ,通过反转录 PCR(RT- PCR)扩增出 GRA6的 c DNA条带。目的基因 DNA条带被克隆到质粒 p UC19中形成重组质粒。对重组质粒 DNA进行纯化 ,并对目的基因片段进行核苷酸序列分析。　结果　通过RT- PCR从 m RNA中扩增出一条分子量约 70 0 bp的 DNA条带。核苷酸序列分析表明 ,GRA6分子基因的开放的阅读框全长为 6 93bp,编码 2 30个氨基酸分子 ,与已报道的 RH株 GRA6分子具有 10 0 %的同源性。　结论　本研究获得了刚地弓形虫 RH株的 GRA6分子基因 ,为今后应用此分子作为抗原诊断弓形虫病奠定了基础     

编码弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)质粒DNA免疫小鼠诱导抗弓形虫感染的保护性

目的构建真核表达质粒pcGRA1,并观察其免疫小鼠的保护性. 方法经PCR从cDNA克隆中扩增出GRA1编码基因,定向克隆入pcDNA3的EcoRⅠ/XhoⅠ位点,从而获得pcGRA1.用限制性内切酶消化、PCR及序列测定对该重组质粒进行鉴定.将100 μg质粒于小鼠左后腿DNA肌注,于注射后2周和4周各加强1次;分别观察小鼠体内的特异性抗体滴度、GRA1基因在小鼠体内的分布、GRA1在肌细胞的表达以及免疫小鼠对弓形虫强毒株RH速殖子攻击后的保护性. 结果 DNA序列测定结果表明,将573 bp的GRA1编码阅读框定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ/XhoⅠ位点,成功构建了重组质粒pcGRA1;免疫小鼠血清中检测到特异性IgG;不同组织DNA为模板特异地扩增出GRA1编码基因;IFA检测pcGRA1免疫鼠肌细胞呈阳性反应;弓形虫RH株速殖子攻击感染pcGRA1免疫鼠,其存活时间长于对照组. 结论重组质粒pcGRA1免疫小鼠可诱导特异性免疫反应,对弓形虫强毒株的攻击感染具有一定的保护性.     

免疫筛选弓形虫速殖子cDNA文库

目的　为弓形虫疫苗研制提供新的候选分子。　方法　用弓形虫免疫兔血清作为探针筛选弓形虫速殖子cD NA文库 ,对阳性克隆的插入片段分别进行PCR扩增及DNA序列测定。　结果　筛选出 6个阳性克隆 ,其插入片段大小约为 45 0～ 2 0 0 0bp ,随机选取Toxo D2、Toxo D3、Toxo D5三个阳性克隆进行测序 ,将所得的序列与GenBank进行对比分析 ,发现Toxo D3与狒狒的线粒体DNA同源 ,Toxo D5与弓形虫致密颗粒蛋白 1序列同源 ,而Toxo D2为一新基因 (GenBank登录号为AY2 2 3 5 3 8) ,编码 3 68个氨基酸 ,有完整阅读框 ,PROSCAN分析显示该新基因含有 1个N 糖基化位点 ,9个蛋白激酶C磷酸化位点 ,7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点 ,7个肉豆蔻酰化位点。　结论　新基因的获得为弓形虫病疫苗和免疫诊断的进一步研究奠定了基础。     

Sensitive and specific detection of toxoplasma DNA in an experimental murine model: use of Toxoplasma gondii-specific cDNA and the polymerase chain reaction

Toxoplasma gondii, an apicomplexan parasite of mammals and birds, is well recognized as a cause of encephalitis in AIDS patients and as a cause of congenital infections. The polymerase chain reaction (PCR) and toxoplasma cDNA clones were used to diagnose T. gondii infection in an acute murine model of toxoplasmosis. Diagnosis of tissue infection by Southern blot hybridization with cDNA clones of T. gondii was possible within 5 days of infection. This technique could detect as few as 10,000 organisms. Specific T. gondii gene amplification by PCR using the primers 5'CACACGGTTGTATGTCGGTTTCGCT3' and 5'TCAAGGAGCTCAATGTTACAGCCT3' followed by oligonucleotide hybridization using 5'GCGGTCATTCTCACACCGACGGAGAACCACTTCACTCTCA3' allowed detection of T. gondii in the tissue of mice by day 2 after infection and in the blood of mice by day 5 after infection with RH strain T. gondii. This technique could detect as few as 10 organisms. Thus, these techniques may be useful in the diagnosis of toxoplasmosis.     

弓形虫巢式PCR体系的建立及其对人、鼠弓形虫病的检测

本文根据弓形虫主要表面抗原基因的序列，自行设计合成了两对寡聚脱氧核糖核苷酸片段，构建了弓形虫特异的ＰＣＲ检测体系。经对弓形虫ＤＮＡ及人、鼠弓形虫病的初步检测，证明本ＰＣＲ体系具有敏感性高、特异性强、适用面广等特点。     

敏感性PCR检测猪肉弓形虫方法的建立与应用

目的建立一种敏感快速的猪肉弓形虫PCR检测方法,并用来检测市售猪肉弓形虫的感染情况。方法采用不同数量的弓形虫模拟感染猪肉样本,分别以529 bp重复序列、B1基因、SAG1、SAG2、SAG3作为目标检测基因,对其敏感性进行评价,在此基础上运用敏感的靶标检测100份市售猪肉样本中弓形虫的感染情况。结果 529 bp重复序列的敏感性最高,用此靶标检测合肥市售猪肉,弓形虫阳性率为17%。结论 529 bp重复序列基因是一个可用于肉制品中弓形虫PCR检测的理想靶标。     

Discrimination between patients with acquired toxoplasmosis and congenital toxoplasmosis on the basis of the immune response to parasite antigens

Many persons infected with Toxoplasma gondii develop ocular lesions. Immunologic parameters in the response to T. gondii were evaluated in infected persons with and without ocular lesions and in noninfected controls. Subjects were divided into groups on the basis of presence of serum antibodies to T. gondii, presence of ocular lesions, and clinical history. Production of interleukin-2 and interferon-gamma by peripheral blood mononuclear cells from patients with probable congenital toxoplasmosis was decreased, compared with that in persons with presumed acquired infection. Cell proliferation and delayed-type skin reaction induced by soluble toxoplasma tachyzoite antigen followed the same pattern. Asymptomatic persons showed high levels of interleukin-12 and interferon-gamma, whereas persons with ocular lesions had high interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha responses toward soluble toxoplasma tachyzoite antigen. These data suggest that patients with ocular disease due to congenital infection show tolerance toward the parasite. Furthermore, susceptibility to ocular lesions after acquired toxoplasmosis is associated with high levels of interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha, whereas resistance is associated with high levels of interleukin-12 and interferon-gamma.     

弓形虫对猪小肠IEL数量与细胞因子表达的影响

目的研究弓形虫对猪小肠上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocytes,IEL）数量、IL-10、IFN-γ和IL-12表达水平的影响。方法对疑似患弓形虫病的家猪,经临床观察、弓形虫血清学检测、病理剖检检查和病理组织学观察诊断,确诊5头弓形虫感染猪（感染组）和5头正常猪（对照组）;采用HE染色检测小肠IEL数量和免疫组织化学方法检测IL-10、IFN-γ和IL-12的表达。结果弓形虫血清学检测阳性,且在病变组织观察到弓形虫速殖子或假包囊,确诊病猪所患为弓形虫病;与对照组比较,感染组猪的空肠、回肠IEL数量明显增加（P〈0．01）,十二指肠IL-10、十二指肠和空肠IFN-γ、十二指肠和回肠IL-12的表达降低（P〈0．01）,回肠IL-10和1FN-γ的表达亦降低（P〈0．05）。结论弓形虫感染猪小肠IEL数量增多,Th2型细胞因子IL-10和Th1型细胞因子IFN-γ、IL-12表达均降低,推测弓形虫调控IEL及其细胞因子,引起肠道黏膜免疫抑制,弓形虫入侵后维持肠道内环境平衡,说明IEL在抗弓形虫感染中并未起到积极作用。     

用多聚酶链反应诊断弓形虫病

根据本实验室筛选出的弓形虫(ZS_2株)特异DNA克隆片段的部分顺序分析的数据,设计并合成特异的寡核苷酸引物对,建立多聚酶链反应诊断弓形虫病的方法。不同来源的弓形虫株和7例畸形胎儿DNA经体外基因扩增,扩增产物经电泳检测,均出现特异的扩增条带。对42例肝炎综合症的婴儿和33例不良生育史的孕妇的外周血白细胞DNA检测,分别为6例和4例阳性。50例正常人外周血白细胞DNA检测均为阴性。对扩增产物进行Southern印迹分析,以~(32)P标记克隆的弓形虫特异DNA片段为探针,能与阳性病例特异的扩增条带杂交,而不与阴性样品的扩增产物杂交。本法并与其它检测方法的结果相比较,具高度特异、敏感且快速的优点。