套式PCR用于海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1和2的分型研究

目的了解海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(pfMSP1)和表面蛋白2(pfMSP2)等位基因型的分型特征。方法采用套式PCR法分别扩增pfMSP1基因第2区与第3区部分片段和pfMSP2基因的中间可变区(第3区)，对海南省恶性疟原虫分离株进行基因分型。结果 55份血样中有52份恶性疟疾患扩增pfMSP1基因片段，以MAD20型为主导型(84.6％)，K1型为次要型，未检出RO33型，两种不同等位基因混合感染率为15．4％。同时，55份血样中有53份恶性疟疾患扩增出pfMSP2基因片段，以3D7型为主导型(83％)，FC27型为次要型，混合感染率为17％。结论 海南省恶性疟原虫的MSPl存在MAD20型和K1型两种等位基因型，以MAD20型为优势虫株；其MSP2存在3D7型和FC27型两种等位基因型，以3D7等位基因家族为主。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1羧基端片段基因核酸疫苗的构建

核酸疫苗能引起明显的细胞免疫反应,在体内为真核天然表达,不需体外表达、纯化等繁琐工作;已有相当数量的试验表明其可引起明显的免疫保护.目前疟原虫仅有关鼠疟约氏疟红前期核酸疫苗的报道[Sedegah M et al.ProcNatl Acad Sci USA,1994;91:9866]我们选择了恶性疟原     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-2 DNA疫苗诱导小鼠T淋巴细胞的增殖

目的 探讨疟原虫FCC-1／HN株泉殖子表面蛋白-2(MSP-2)DNA疫苗在小鼠体内诱导免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法 将重组真核表达质粒PBK／MSP-2经骨骼肌注射BALB／c小鼠。小鼠经DNA疫苗免疫8周后，用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化，并体外培养脾脏细胞，用夹心ELISA法测定IFN-γ和IL-2的产生。结果 与对照组相比，疫苗组CD4^ CD8^ 淋巴细胞有显著性的增高，体外培养的脾脏细胞IFN-γ有高浓度的分泌。结论 恶性疟原虫FCC-1／HN MSP-2 DNA疫苗诱导了一个TH1的免疫疫答类型。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白基因在减毒伤寒杆菌诱导株中的表达

目的 用含ＰＬｔｅｔＯ启动子的ｐＺＥ１１质粒在减毒伤寒杆菌ＣＶＤ９０８疫苗株中表达恶性疟原虫主要裂殖子表面蛋白。方法 将克隆有恶性疟原虫裂殖子表面蛋白Ｃ末端基因（ＭＳＰ１－４２）的重组ｐＺＥ１１质粒用电穿孔转化法转化入减毒伤寒杆菌ＣＶＤ９０８／ｔｅｔＲ疫苗株中,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹反应和免疫荧光反应检测ＭＳＰ１－４２在ＣＶＤ９０８／ｔｅｔＲ株中的体内外四环素诱导表达。结果 构建了ＣＶＤ０８     

恶性疟原虫3D7株主要裂殖子表面抗原C—末端基因的全合成及其表达

目的：在毕赤酵母表达系统中获得大量构象正确的3D7／MSP1－42重组蛋白进行疫苗有效性试验。方法：采用不对称PCR法拼接合成了3D7／mps1-42基因（1202bp),用电穿孔法将合成基因导入毕赤酵母并进行诱导表达,用免疫印迹法检测表达产物。结果：按毕赤酵母密码子使用频率重新设计并全合成了3D7/msp1-42基因序列,该合成基因在毕赤酵母系统（Pichia pastoris)中得到高水平分泌表达,产生全长重组蛋白。识别构象表位的特异性单克隆抗体能与该重组蛋白反应。结论：重新设计的基因能在毕赤酵母中高水平分泌表达,并产生构象正确的重组蛋白,从而解决了该天然基因在毕赤酵母中不表达的问题。     

恶性疟P190抗原双态区三肽重复序列基因的缺失

恶性疟P190(亦称裂殖子表而抗原1,MSA1)是疟原虫红内期裂殖体产生的一种塘蛋白,分子量约190 kD。由于该抗原在疟疚病人和实验动物中均能诱生很强的保护性免疫力,因而已将它列入重要的疟疾疫苗候选抗原。P190存在株间抗原差异,但该变异属于等位基因双态变异。至今经序列分析鉴定的虫株中只发现两种变异类型序列,MAD20型和Kl型。比较不同虫株该基因序列可将该分子划分为保守区、双态区和多态区。近来研究提示,双态区可能是该分子重要保护性免疫控制区。我们克隆了我国恶性疟FCC1/HN株该双态区的基因。方法为设计和合成一对引物,在引物的5’端设有     

恶性疟FCC1/HN株P190基因3端发生遗传重组

恶性疟原虫P190抗原是疟疾疫苗重要的候选抗原。但该抗原存在明显的株间差异。因此了解和弄清这种变异的本质对P190疫苗研究具有重要意义。免疫学分析和基因序列测定结果均显示该分子存在保守区和变异区。但变异是有限的,至今只发现两种变异类型,K1和MAD20型。这两类序列差异主要表现在双态区。Tanabe等经研究后提出,P190是由一对双态等位基因编码的,这对等位基因在疟原虫有性生殖期(在蚊体内进行)可发生有限的基因间重组。近来研究结果亦显示,在P190基因5′端确实存在基因间同源重组现象,并且这种重组是导致该抗原变异的重要因素,但至今尚未在3′端发现这种重组现象。我们克隆了我国恶性疟FCC1/HN株P190双态区和近3′端保守区的2个基因     

在减毒伤寒杆菌CVD908疫苗株中四环素诱导表达恶性疟原虫MSP1-31片段基因

目的:用含PLtetO启动子的pZE11质粒在减毒伤寒杆菌CVD908疫苗株中表达恶性疟原虫MSP1-31片段基因.方法:构建受四环素诱导调控的重组质粒pZE11/MSP1-31,将该重组质粒用电穿孔转化法转化入减毒伤寒杆菌CVD908/tetR疫苗株中,用免疫印迹反应检测MSP1-31在CVD908/tetR株中的四环素诱导表达.结果:构建了重组的pZE11/MSP1-31质粒,免疫印迹反应显示该MSP1-31基因在CVD908/tetR株中得到有效表达,且依赖于四环素的存在.结论:成功地构建了由四环素诱导的、表达恶性疟原虫MSP1-31的减毒伤寒杆菌疫苗株.     

恶性疟MSP-2、CSP多价DNA疫苗免疫小鼠应答类型研究

目的：探讨恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面蛋白-2(MPS-2)和环子孢子蛋白(CSP)组成的DNA多价疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法：将重组真核表达质粒pBK/CSP和pBK/MSP-2经骨骼肌注射BALB/c小鼠，小鼠经多价疫苗免疫8wk后，用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化，并体外培养脾脏细胞，用夹心ELISA法测定IFN-γ和IL-2的产生；用血清学方法测定免疫鼠IgG抗体的动态变化。结果：与对照组相比，疫苗组CD^4 cd^8 淋巴细胞有显的增高，体外培养的脾脏细胞IFN-γ有一个高浓度的分泌。同时，免疫鼠血清对疟原虫抗原都表现了一个较高水平的IgG类抗体反应。结论：恶性疟原虫FCC-1/HN，pBK/MSP-2和pBK/CSP多价疫苗诱导了一个以细胞免疫为主的免疫应答类型。     

恶性疟原虫顶端膜抗原1基因转染伯氏疟原虫模型的建立

目的：建立恶性疟原虫顶端膜抗原1（AMA-1）基因转染伯氏疟原虫的模型．方法：将含有恶性疟原虫AMA-1基因的重组转染质粒pDB.DTm. DB./AB. AF. DB．用Bgl Ⅰ酶切线性化．伯氏疟原虫经体外培养和分离后进行电转化,转化的原虫经药物筛选后进行PCR检测．结果：PCR检测显示转染伯氏疟原虫存在恶性疟原虫AMA-1基因．结论：成功建立了恶性疟原虫AMA-1基因转染伯氏疟原虫的模型,为进一步研究提供了基础．     

恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 了解恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）谷氨酸脱氢酶（GDH）基因全编码区核苷酸序列变异情况。方法 PCR扩增恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH基因全编码区,产物经EcoRI SalI酶切后,定向克隆至pGEX-4T-1质粒,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序,与其它生物GDH进行同源性分析。结果 成功扩增了恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH编码基因,大小为1410bp,无内含子,与Thailand株GDH基因相比,两有2个碱基不同,推导的氨基酸序列完全相同;与蓝氏贾第鞭毛虫,克鲁氏锥虫和梭状芽孢杆菌GDH的同源性分别为57.90%(260/449),56.51%(243/430),42.05%(164/390);与人的GDH-1,GDH-2的同源性分别为29.02%（101/348）,28.73%(100/348)。结论 FCC1/HN株与Thailand株GDH高度同源,疟原虫GDH明显不同于其它生物GDH。     

重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶的纯化及免疫活性测定

目的:研究恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)重组蛋白纯化和复性的最佳条件。方法:重组质粒PGEX-4T-1-LDH在E.coli BL21中表达，表达产物用酶裂解法洗涤、变性、复性、Q-Sepharose High Performance离子交换层析方法纯化。结果:获得具有生物活性的蛋白，其纯度达到95％。结论:此方法操作简便，纯化效果好。     

恶性疟原虫子孢子表面蛋白2基因的克隆与序列分析

目的：克隆恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)子孢子表面蛋白2(PfSSP2)基因，并进行序列分析。方法：根据PfSSP2基因已知序列设计合成一对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出PfSSP2基因，并克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测序，用DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN株PfSSP2基因序列，酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-PfSSP2重组质粒。测序表明，所克隆的PfSSP2基因大小为1680bp，编码559个氨基酸残基。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、DD2、FCR3、HB3A、K1、Thai814、Thai838、Thai842、Thai947及7G8株PfSSP2的氨基酸序列在33个位点存在氨基酸替代，1处氨基酸序列增加；各株间PfSSP2的氨基酸序列同源性都在95.7％以上。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株PfSSP2基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫不同分离株间有高度的同源性。     

HRPII双抗夹心ELISA检测恶性疟原虫体外敏感性研究

目的验证富组蛋白2双抗夹心酶联免疫吸附法（Histidine—Rich Protein 2 Double—Site Sandwich Enzyme—Linked Immunosorbent Assay,HRPII—ELISA）在恶性疟原虫体外敏感性检测中的适用性。方法运用HRPII-ELISA测定氯喹、咯萘啶、青蒿琥酯、蒿甲醚及双氢青蒿素等五种抗疟药物对体外培养的恶性疟原虫氯喹敏感株与氯喹抗性株的体外敏感性,并对所测得的量效曲线（dose-response curves）及50％有效抑制浓度（IC50）与WHO推荐的Rieklnann体外微量法比较。结果HRPH—ELISA法测定的五种药物对恶性疟原虫氯喹敏感株的IC50值依次为4．7nmol/L、2．90nmol／L、3．38nmol／L、4．64nmol／L、2．72nmol／L,对恶性疟原虫氯喹抗性株的IC50值依次为110．4nmol／L、3．85nmol／L、4．39nmol／L、3．90nmol／L、3．27nmol／L;同时,将上述结果与体外微量法所得的结果进行相关性分析,R2=0．96,P〈0．001,两种方法结果基本一致。结论HRPII—ELISA法可用于恶性疟原虫对抗疟药物的体外敏感性检测。     

恶性疟原虫基因组文库的构建及未知抗原cDNA片段的筛选

恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA经Sau3AⅠ部分酶切，取14－23kb片段连接入GEW-11λ噬菌体置换型载体构建基因组文库。所得重组体数目为7.3×104pfu，近达构建完整恶性疟原虫基因组文库理论值的10倍。随机挑取该库10个噬菌斑，抽提λDNA，用XhoⅠ酶切，得到14－23kb的插入片段和载体双臂，符合建库要求．以抗体筛选恶性疟原虫cDNA表达文库所获得的未知抗原cDNA片段为探针，在其中筛选到了阳性克隆，为阐明该未知cDNA对应的基因奠定了基础．