胃癌单克隆抗体-蓖麻毒素A链结合物的制备及其对肿瘤靶细胞的杀伤作用

作者报道胃癌McAb MGb_2(本室制备)与蓖麻毒素A链(RTA)交联物的制备。交联物对胃癌细胞具有强大的选择性杀伤怍用,胃癌McAbMGb_2对RAT具有导向能力。     

聚合物修饰的蓖麻毒蛋白A链在荷瘤大鼠体内分布的研究

目的 研究两种不同相对分子质量的单甲氧聚乙二醇(monomethoxy polyethylene glycol,mPEG)与蓖麻毒蛋白A链(ricin A chajn,RTA)偶联后在荷瘤大鼠体内分布情况,探讨聚合物修饰的RTA靶向治疗肿瘤的可能性.方法 荷瘤大鼠动物模型分3组,分别尾静脉注射125I-RTA,125I-RTA-mPEG-MAL和125I-RTA-mPEG-OPSS后,在不同时间点分批处死大鼠,行组织分布测定,并相互比较.结果 RTA-mPEG偶联物的生物半衰期较RTA有明显延长,且随时间的延长RTA-mPEG偶联物的瘤/非瘤组织的放射性比值与RTA比显著增大.在肝、脾脏组织,注射后1 h测得RTA摄取率大于RTA-mPEG偶联物.结论 通过聚乙二醇的修饰,使RTA生物半衰期大大延长,且修饰后能避免肝脏、脾脏的摄取,并靶向到肿瘤组织.     

抗人B细胞MAb—737与蓖麻毒蛋白偶联物对肿瘤细胞选择性杀伤

具有针对B细胞类la抗原特异反应性MAb—737与蓖麻毒蛋白通过二硫键连接成免疫毒素ricin—737体外0.1M乳糖存在时,此免疫毒素对含B细胞抗原的Burkitt＇s淋巴瘤细胞系Raji细胞表现出选择性地强力杀伤,半数杀伤浓度(IC50)为5×10-~11M。同样条件,对不含靶抗原的对照细胞K562没有显著杀伤,lC50为10-(~8)M,毒性比前者低500倍。游离毒蛋白IC50为5×10-~8M,比免疫毒素毒性低1000倍,动力学研究表明,免疫毒素作用1小时就可抑制靶细胞的增殖,并随处理时间延长,杀伤更趋显著。结果提示,免疫毒素ricin—737具有强烈地选择性杀伤靶     

重组蓖麻毒素A链的表达及其对肿瘤细胞的毒性研究

目的探讨重组蓖麻毒素A链(pKK22.3-RTA)在原核系统中D的表达,以及它对肿瘤细胞HeLa、SKOV3、HEPG2及K562、YAC-1的毒性。方法将构建好的pKK223.3-RTA在大肠杆菌JM109中进行表达,并将表达出的RTA蛋白进行亲和层析。用Bradford法测定蛋白的含量;用MTT法分别测定RTA对肿瘤细胞HeLa、SKOV3、HEPG2及K562、YAC-1的杀伤作用。结果在37℃表达3h情况下得到较多的可溶性RTA。经亲和层析纯化后,对HeLa、SKOV3等肿瘤细胞具有不同的毒性。结论在原核系统中可表达出较多可溶性RTA。在低浓度时,不同肿瘤细胞对RTA的敏感性不同;在高浓度时,对肿瘤细胞的毒性比较相近。     

半乳糖结合位点封闭式免疫毒素的制备及其特性

近年来发现蓖麻毒素中B链除具有细胞结合作用外,还有促进A链杀伤效应的功能。作者用完整蓖麻毒素制备B链半乳糖基结合位点封闭的胃癌McAb免疫毒素,发现这种免疫毒素对胃癌细胞具有高度选择性杀伤作用;由于这种免疫毒素的作用较A链免毒疫素增强,故认为免疫毒素中B链的存在有助于增强A链的细胞杀伤作用。     

溶酶体参与蓖麻毒素A链降解途径的研究

目的:研究溶酶体在蓖麻毒素A链(RTA)细胞内转运过程中的作用.方法:用DNA重组技术,将溶酶体的靶向信号肽KFERQ连接在RTA的羧基端;将构建好的重组质粒pKK223.3-RTA和pKK223.3-RTA-KFERQ转化感受态大肠杆菌JM109,经IPTG诱导表达RTA和RTA-KFERQ蛋白;重组蛋白质用Blue-Sepharose6B亲和柱纯化,以MTT法分别测定纯化后的RTA与RTA-KFERQ蛋白对体外培养的HEPG2(人肝癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、A549(人肺癌细胞)3种细胞的毒性作用.结果:在大肠杆菌中成功表达了RTA和RTA-KFERQ.与RTA相比较,纯化的重组蛋白在体外有相似的蛋白质合成抑制活性,RTA-KFERQ对HEPG2、Hela和A549细胞的毒性分别减少了约49.87%、54.18%、88.68%.结论:RTA不能完全被溶酶体灭活,RTA可能存在溶酶体外的降解途径.     

RTA—RA3是B220特异性的有潜力的抗自身免疫的免疫毒素

将抗B220单克隆抗体分泌克隆RA3注射至SCID小鼠腹腔以获取腹水，抗体经proteinA亲和层析柱提纯，再经SPDP双功能交联剂修饰后，与还原的去糖基蓖麻毒蛋白A链反应生成免疫毒素RTA-RA3．SephadexG150柱层析分离纯化此免疫毒素，在还原状态下可见到免疫球蛋白重链、轻链及另一条带RTA．免疫毒素体内注射，研究MRL/＋和MRL/lpr小鼠脾细胞的淋巴细胞标志．实验表明：RTA－RA3对脾B220＋细胞有显著抑制作用．提示这一免疫毒素可用于治疗自身免疫性疾病。     

蓖麻毒素的提取及其抗肿瘤作用研究

目的:研究蓖麻毒素的提取方法和对肿瘤细胞的杀伤作用.方法:根据Nicolson和Blaustein的方法稍加改良,通过PBS提取、硫酸铵分段盐析、Sephrose 4B亲和层析和Sephadex G100凝胶过滤等步骤,从去壳蓖麻籽中提取天然蓖麻毒素;采用细胞培养,以MTT法分析不同浓度蓖麻毒素对肿瘤细胞的杀伤作用.结果:用亲和层析和凝胶过滤等步骤提纯的蓖麻毒素,分子量为63 kD,由2个亚基组成.细胞毒性分析:蓖麻毒素在高浓度下(5×10-8mol/L～5×10-10mol/L)对正常细胞和结肠癌细胞的杀伤效率无差异(P>0.05),而在低浓度下(5×10-11mol/L～5×10-13mol/L)两者有显著性差异(P<0.01);各种浓度蓖麻毒素对白血病细胞K562和大肠癌细胞SW480的杀伤作用无统计学上的差别(P>0.05).结论:蓖麻毒素在低浓度下对肿瘤细胞的杀伤有选择性,对白血病细胞K562和大肠癌细胞SW480的杀伤作用在各种浓度下无选择性.     

LDH法检测新城疫病毒野生株与疫苗株对大肠癌的体外杀伤作用

目的比较新分离的新城疫病毒野生株(NDV7793、NDVD817)与疫苗株Lasota对大肠癌的体外杀伤作用。方法3株病毒作用于大肠癌细胞株LS174T和LOVO,用乳酸脱氢酶微量释放法测定病毒的杀瘤活性并通过测定培养上清液的血凝效价来检测病毒的增殖能力。结果3株新城疫病毒均可杀伤大肠癌细胞并可在其复制增殖,对正常大肠细胞无明显细胞毒性。而对正常大肠组织细胞未见明显影响(P<0.05);野生株对癌细胞的杀伤作用较强,72h后对LOVO细胞株的杀伤效应>90%;LOVO大肠癌细胞对NDV敏感性强于LS174T大肠癌细胞。结论3株NDV对大肠癌细胞均有选择性杀伤作用,野生株病毒的抑瘤效应强于疫苗株,对正常大肠组织无细胞毒性。     

亲和层析法制备蓖麻毒蛋白

目的研究蓖麻毒蛋白的提取纯化工艺,为制备抗癌生物导弹和生物农药提供原料。方法以琼脂糖凝胶为载体,D-半乳糖为特异性配基,采用亲和层析法纯化蓖麻毒蛋白;并用高效液相色谱法鉴定其纯度。结果该法制备的蓖麻毒蛋白纯度高,收得率好。结论该方法特异性强,制备效率高,可作为制备蓖麻毒蛋白纯品的一种有效方法 。     

抗ricin中和性单抗4C13单链抗体的真核表达及生物活性检测

目的:实现基于中和性单抗4C13单链抗体的真核表达,并对其生物学活性进行评价.方法:用TRIzol提取抗ricin中和性单抗杂交瘤细胞4C13总RNA,扩增其轻、重链可变区基因,登陆GenBank;用Linker(GGGGS)3将VH和VL连接,用重叠延伸PCR克隆入真核表达载体pCDNA 3.1,用脂质体转染293T细胞,对瞬时表达产物进行生物学活性检测.结果:中和性单抗杂交瘤细胞4C13轻、重链可变区基因在GenBank中的登录号为DQ389248和DQ389245,ScFv与ricin可特异性结合,培养上清原液和2倍稀释液的抑制率分别为33.7%和29%;ScFv在ricin浓度为0.01～0.005 ng/mL时可中和ricin 对SP2/0细胞的细胞毒,随着ricin浓度逐渐增大,细胞存活率逐渐减低.结论:研究结果为研制基于中和性单抗的其他ricin拮抗剂奠定了重要的理论和实践基础.     

蓖麻毒素细胞毒性及其中毒小鼠组织病理改变

目的：探讨蓖麻毒素对不同细胞的细胞毒性及小鼠各主要组织脏器毒性的基本病理改变。方法应用MTT法检测不同浓度（1 ng/ml，10 ng/ml，100 ng/ml，1μg/ml）蓖麻毒素给药24 h对不同细胞株（Caco-2，MDCK，MDCK-MDR1，HepG2， H1299）的细胞活性的影响；经灌胃方式使小鼠中毒，中毒24 h观察蓖麻毒素对小鼠脏器的基本病理变化，测定相关生化指标，分析蓖麻毒素对小鼠肝肾损伤。结果不同浓度的蓖麻毒素对Caco-2，MDCK，MDCK-MDR1，HepG2和H1299细胞均有一定的毒性，随着毒素浓度的升高，细胞毒性亦呈上升趋势，有明显量效关系，其中MDCK细胞对蓖麻毒素最为敏感。病理学检测显示蓖麻毒素可致小鼠肾小球出血及部分肾血管内皮细胞缺如，肝细胞水肿、近端肠绒毛损伤、轻度坏死性肺炎并有炎性细胞浸润。血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、甘油三酯（TG）、肌酐（CREA）均升高，表明小鼠中毒3 h内肝功能和肾功能已出现一定程度的损伤。结论蓖麻毒素通过抑制蛋白质合成而导致细胞坏死。不同细胞对蓖麻毒素具有不同的敏感性，表现为蓖麻毒素中毒早期，动物即可出现严重的肝、肾损伤。     

Purification of Ricinus communis agglutinin and its application to research on oligosaccharides in serum of patients with lung cancer

In this report,purified Ricinus communis agglutinin (RCAl) was employed for analysis ofoligosaccharide molecules in serum of patients with lung cancer or benign diseases.By meansof DEAE-Sephadex A-50 and Sephadex G-100 chromatography,RCAl was purified from the ex-tracts of castor beans.After characterizing its bioactivity by means of red blood coagglutination andpurification by SDS-PAGE,RCAl was coupled with CNBr-activated Sepharose 4B.By RCAl af-finity chromatography,the gtycoproteins containing Galβl-4GlcNAc-linked unit at the nonreducingend of the carbohydrate chain were isolated from the gastric cancer tissue.By means of RCAl andthis glycoproteins labelled with horseradish peroxidase,a competitive binding assay was establishedand employed to detect the level of the oligosaccharides defined by RCAl in serum of pateins withlung cancer or benign diseases and of normal persons.The results suggest that expression of theseoligosaccharide molecules is higher in serum of patient with lung cancer than in serum of patientwith a benign disease of the respiratory system and healthy individuals.The positive rates were60.6%(20/33) in serum of patients with lung cancer,21.4% (6/28) with benign diseases and 4.0%(1/25) of normal persons.It is confirmed that detection of these oligosaccharide molecules in serumcan be helpful in the study and diagnosis of lung cancer.     

重建型蓖麻蛋白脂质体的制备、性质及对肝癌细胞的毒性

目的:制备重建型蓖麻蛋白脂质体(RRL),并探讨其毒性作用.方法:通过正交法实验选择配方,并采用冷冻干燥脱水-再水化-囊泡化方法(DRV法)制备RRL;用体外细胞毒性试验和小鼠半数致死量(LD50)试验测定RRL毒性.结果:RRL的包封率可达59.63%(含50 g/L的甘露醇),粒径为0.50～0.79 μm(占90%以上),经4 ℃ 0.5 a贮存,其粒径和粒度分布无明显变化.RRL对7 721人肝癌细胞的半数细胞抑制浓度(IC50)与游离蓖麻蛋白的IC50之比为1∶2.47;RRL的LD50为(55.61±19.71) μg/kg,毒性下降27.66%.结论:本法所得RRL性质稳定,药物包封率较高,并提高了对肝癌细胞的毒性,降低了对小鼠的毒性,为临床研制蓖麻蛋白的新剂型提供了理论依据.     

蓖麻毒素及其修饰物在肝癌细胞膜上的分布

目的：探讨３－（α－吡啶二硫基）丙酸Ｎ－羟基琥珀酰亚胺基酯（ＳＰＤＰ）修饰的蓖麻毒素毒癌活性及其机制。方法：用流式细胞仪分析蓖麻毒素及其修饰物在肝癌细胞膜上的分布变化。结果：修饰的蓖麻毒素在肝癌细胞上的分布比未修饰的蓖麻毒素明显增多,结论：ＳＰＤＰ修饰后的蓖麻毒素对肝癌细胞的亲和力增加,提示蓖麻毒素用ＳＰＤＰ修饰可能是改进其抗癌作用的一个有价值的途径。     

蓖麻毒素的毒性作用机制及其在肿瘤治疗中的应用

蓖麻毒素对哺乳动物细胞具有很强的毒性,属于Ⅱ型核糖体失活蛋白。其A链是活性链,可使核糖体失活,从而使蛋白质合成受阻,细胞死亡。基于蓖麻毒素的细胞毒性,人们将蓖麻毒素及其A链应用于肿瘤治疗领域,目的在于特异性杀伤肿瘤细胞,并减小对正常细胞的毒性。本文就蓖麻毒素的分子结构、毒性机制以及近年来在肿瘤治疗领域的研究进展作一综述。     

双抗体夹心酶联免疫法检测不同样品中的蓖麻毒素

目的 应用酶联免疫吸附分析方法（ELISA）检测待测样品中的蓖麻毒素。方法 用蛋白 G亲和层析柱纯化蓖麻毒素单克隆抗体（4C13,3D74,5E4和5H6）,以3D74及辣根过氧化物酶(HRP)标记的4C13建立的双抗体夹心ELISA对含有蓖麻毒素的多种样品进行检测。结果 抗蓖麻毒素的单克隆抗体经亲和层析纯化后具有较高的蛋白纯度,应用HRP标记的4C13与3D74建立双抗体夹心ELISA,对于溶解于磷酸缓冲液中的蓖麻毒素标准品的检测灵敏度可达2.5 μg·L^-1;对于土壤、面粉、牛奶、咸菜汁、雪碧、可乐和腐乳汁中的蓖麻毒素样品检测的灵敏度为2.5～5.0 μg·L^-1;与磷酸缓冲液样品相比较,含有相同浓度蓖麻毒素的小鼠和人血清样品ELISA的阳性结果明显减弱。结论 双抗体夹心酶联免疫法能够有效用于含有蓖麻毒素样品的检测分析。     

蓖麻毒素被修饰前后在小鼠主要脏器的定位比较研究

为探讨引入二硫吡啶硫酮（ＰＤＰ）基团后，蓖麻毒素（ＲＴ）毒性降低和免疫增强的机理，作者将用异型双功能交联剂３－（２－吡淀二硫基）丙酸琥珀酰亚胺酯（ＳＰＤＰ）修饰的蓖麻毒素（ＲＴ－ＰＤＰ）与其修饰的蓖麻毒素注入小鼠腹腔内，然后取小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要脏器进行了免疫组化定位和计算机辅助图像分析。提示ＲＴ－ＰＤＰ对主要脏器组织亲和力和毒性明显降低，且有可能产生一种活化吞噬细胞的新功能，从而为蓖麻     

Effect of Interstitial Chemotherapy with Ricin Temperature-Responsive Gel for Anti-Breast Cancer and Immune Regulation in Rats

Objective:To explore the effect of ricin temperature response gel on breast cancer and its regulatory effect on immune function in rats.Methods:Ricin was purified by chromatography and identified by immunoblotting.The rat subcutaneously transplanted breast cancer model was established.Forty model rats with a tumor diameter of about 3.0 cm were subjected to the study.They were randomized into four groups equally:the model group and three treated groups(blank gel,ricin,ricin-gel) were administered with blank gel, ricin,and ricin temperature response gel via percutaneous intratumor injection,respectively.The tumor was isolated 10 days later for the estimation of tumor inhibition rate(TIR) by weighing,pathologic examination,and detection of tumor apoptosis-associated genes bcl-2 and bax with semiquantitative RT-PCR.Also,peripheral blood was obtained to test T-lymphocyte subsets,the killing function of lymphocytes,and the contents of tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin-2(IL-2).The outcomes were compared between groups.Results:The TIR in the ricin-gel group was 61.8%,with the pathologic examination showing extensive tumor tissue necrosis. Compared with the model group,after ricin temperature response gel treatment,bcl-2 expression was down- regulated,bax expression was up-regulated,CD4~+ lymphocytes and CD4~+/CD8~+ ratio in peripheral blood were increased,the killing function of lymphocytes was enhanced,and the contents of TNF-αand IL-2 were elevated (P<0.05 or P<0.01).Conclusion:Intratumor injection of ricin temperature-responsive gel showed significant antitumor effect on breast cancer and could enhance the immune function in the tumor-bearing rat.