Biolog技术监测淡豆豉发酵炮制过程中微生物种类动态变化

目的:监测淡豆豉发酵炮制过程中微生物种类的动态变化,为揭示淡豆豉炮制机制提供参考。方法:采用Biolog微生物自动鉴定系统对从不同发酵时间点淡豆豉样品中分离出的优势细菌、酵母菌和霉菌进行鉴定。结果:在整个发酵炮制过程中,枯草芽孢杆菌为主要优势细菌。发酵第3天优势细菌以枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌为主,优势霉菌为黄曲霉、寄生曲霉,优势酵母菌是汉氏德巴利氏酵母。发酵第6天细菌种类增多,出现了枯草芽孢杆菌、松鼠葡萄球菌、抗辐射不动杆菌、铅黄肠球菌,霉菌为寄生曲霉,酵母菌为汉氏德巴利氏酵母、瘦果红酵母和白吉利丝孢酵母A。"再闷"3 d优势细菌为枯草芽孢杆菌、赫氏埃希菌,优势霉菌为黑曲霉,优势酵母菌为瘦果红酵母。"再闷"15 d优势细菌为枯草芽孢杆菌和产酸克雷伯菌,未见霉菌出现,酵母菌以海隐球酵母和罗伦隐球酵母占优势。结论:淡豆豉发酵炮制过程中出现了微生物菌群此消彼长的动态变化,枯草芽胞杆菌作为优势菌种始终参与。     

半夏曲炮制过程中优势微生物的鉴定

研究半夏曲不同发酵时间点的微生物种类、数量变化以及优势菌种的分离鉴定,为探讨半夏曲炮制机制奠定基础。用选择性培养基对半夏曲发酵过程中5个时间点(0,18,36,54,72 h)样品中的细菌、霉菌、酵母菌分别进行培养、菌落计数、分离纯化优势菌种;采用16S rDNA,26S rDNA序列分别对优势细菌、优势真菌进行鉴定。结果表明,半夏曲发酵过程中细菌数量少、变化平缓,而酵母菌和霉菌数量发酵至54 h时迅速增加,至发酵结束时达1×10~7CFU·mL~(-1)以上;通过NCBI同源性比对及构建系统发育树,鉴定出半夏曲炮制过程中的优势细菌为Streptomyces sp.,Bacillus pumilus,B.subtilis,B.aryabhattai,Bacillus sp.;优势酵母菌为Meyerozyma guilliermondii;优势霉菌为Paecilomyces variotii,Byssochlamys spectabilis,Aspergillus niger。提示半夏曲的发酵过程涉及多种微生物共同参与,其中以酵母菌和霉菌为主。M.guilliermondii,P.variotii,P.variotii,A.niger和Bacillus sp.等优势菌种可能在半夏曲炮制中起重要作用。     

PCR-DGGE技术研究淡豆豉炮制过程中微生物菌群的动态变化

目的采用PCR-变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术研究淡豆豉Sojae Semen Praeparatum炮制过程中微生物菌群的动态变化,为揭示其炮制机制奠定基础。方法运用PCR-DGGE技术研究淡豆豉炮制不同时间的样本中细菌、真菌菌群种类和数量的动态变化,通过非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)聚类分析各炮制时间点的菌系差异。结果发酵至"黄衣上遍"过程中细菌种类丰富,真菌以曲霉菌为主;再闷过程中细菌以乳杆菌为主,真菌以隐球菌为主。发酵第1天恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌占优势;发酵第3天嗜麦芽寡养单胞菌、鞘氨醇杆菌属和米曲霉为优势菌种;发酵第6天解淀粉芽孢杆菌、曲霉菌和丝孢酵母为优势菌种;再闷第3天以枯草芽孢杆菌、丝孢酵母和黑曲霉占优势;再闷第9天以枯草芽孢杆菌、那须乳杆菌、弧形乳杆菌和隐球菌为优势菌株;再闷第15天以枯草芽孢杆菌、弧形乳杆菌、隐球菌、丝孢酵母属和2株不可培养真菌为优势菌。整个炮制过程中,产酸克雷伯氏菌、枯草芽孢杆菌、弧形乳杆菌作为优势菌种始终参与。"黄衣上遍"阶段与再闷阶段的微生物群落结构差异大。发酵第3天与第6天的细菌、真菌群落结构相似度最高,分别达76.4%和66.1%;而发酵第3、6天与再闷第9天的细菌群落结构相似度均最低,仅为24.5%,发酵第3天与再闷第15天真菌群落结构相似度最低,仅11.2%。结论炮制过程中微生物群落结构的动态变化和独特的微生物种类可能决定了淡豆豉特有的性味、功能,同时也从微生物学角度印证了再闷的重要性。     

半夏曲炮制过程中微生物数量动态变化的初步分析

目的:检测半夏曲炮制过程中细菌、酵母菌、霉菌的菌落数量并定量分析其中4种优势微生物数量的动态变化,为研究半夏曲炮制机制提供实验依据。方法:参照《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》(第十册)制备半夏曲,取半夏曲炮制过程中0,30,60,90,120 h共5个不同时间点样品,分别用选择性培养基进行细菌、霉菌、酵母菌的培养和分离纯化,并进行菌落计数;应用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis,宛氏拟青霉Paecilomyces variotii,丝衣霉菌Byssochlamys spectabilis,黑曲霉Aspergillus niger进行绝对定量,分别以枯草芽孢杆菌、宛氏拟青霉、丝衣霉菌、黑曲霉重组质粒为对照品,经倍比稀释后制作标准曲线,对半夏曲炮制至5个不同时间点(0,30,60,90,120 h)样品中的4种微生物进行定量分析。结果:半夏曲炮制过程中细菌数量少且变化平缓,而酵母菌和霉菌数量至发酵后期时迅速增加,至发酵结束时均 1×106CFU·m L~(-1)。枯草芽孢杆菌5个不同时间点样品中的拷贝数分别为3. 53×10~5,7. 56×10~4,1. 58×10~5,1. 90×10~6,1. 85×10~6copies·g~(-1);宛氏拟青霉的拷贝数为0,0,0,3. 45×10~7,4. 15×10~8copies·g~(-1);丝衣霉菌的拷贝数为0,0,0,1. 04×10~8,2. 28×10~8copies·g~(-1);黑曲霉的拷贝数为0,0,9. 48×10~5,1. 47×10~6,7. 56×10~6copies·g~(-1)。结论:半夏曲炮制过程中微生物菌群变化趋势可以用4种优势微生物的动态变化来反映,霉菌在半夏曲炮制中可能起重要作用。荧光定量PCR技术具有快速灵敏、重复性好和特异性高的优点,适用于半夏曲的炮制机制研究。     

炮天雄传统炮制过程中微生物的分离与初步鉴定

目的:揭示炮天雄传统炮制过程中的微生物菌群。方法:应用经典微生物分离纯化方法,结合形态学考察和16S rDNA或18S rDNA基因序列分析,对炮天雄传统炮制过程中样品进行微生物的分离及菌种初步分类鉴定。结果:共分离获得细菌14株、酵母菌11株、丝状真菌2株。14种细菌分别为克雷伯氏菌属菌、肠杆菌属菌、节杆菌属、蜡样芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、形赖氨酸芽孢杆菌、伯格菌属、短黄杆菌、棒状杆菌属、嗜盐球菌、巨大芽孢杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌、食窦魏斯式菌;11种酵母菌分别为浅白色隐球酵母菌、胶红酵母菌、葡萄牙棒孢酵母、热带念珠菌、克鲁维毕赤酵母、毛孢子菌属菌、半乳糖霉菌、地丝菌属、巴氏毕赤酵母、假丝酵母属、白地霉菌;2种丝状真菌分别为产黄青霉菌、卷枝毛霉菌。结论:炮天雄传统发酵炮制工艺涉及多种微生物共同参与发酵过程,这一发现为研究炮天雄现代炮制工艺奠定了微生物菌种基础。     

百药煎传统炮制过程中微生物的分离与初步鉴定及其鞣质水解能力测定

目的:揭示百药煎传统炮制过程中的微生物菌群,同时初步考察所分离菌株鞣质水解能力。方法:应用经典微生物分离纯化方法,结合形态学考察和16S r DNA或18S r DNA基因序列分析,对百药煎炮制过程中样品进行微生物的分离及菌种初步分类鉴定。采用含单宁酸的固体培养基初步筛选具有鞣质降解能力的菌株。结果:共分离获得细菌7株、酵母菌7株、丝状真菌3株。7种细菌分别为枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌、黄海芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌菌株、同温层芽孢杆菌、其他芽孢杆菌;7种酵母菌分别为伯顿丝孢毕赤酵母、2株克鲁维酵母菌株、弗比恩酵母菌、奥默柯达菌、异常威克汉姆酵母菌、异常毕赤酵母菌;3株丝状真菌分别为青霉菌、卷枝毛霉菌、黑曲霉菌。除枯草芽孢杆菌、黄海芽孢杆菌、芽孢杆菌、克鲁维酵母菌HMY3、弗比恩酵母菌外,其余菌株均具有鞣质降解能力。结论:百药煎传统发酵炮制工艺涉及多种微生物共同参与混合发酵过程,初步筛选证明5株细菌、5株酵母菌和3株丝状真菌具有鞣质降解能力,这一发现为研究百药煎现代炮制工艺奠定了微生物菌种基础。     

六神曲炮制过程中微生物的分离与鉴定

目的:揭示中药饮片六神曲传统发酵炮制工艺中有益微生物种群。方法:应用经典的微生物分离纯化方法,结合形态学考察和16S rRNA或18S rRNA基因序列分析,对六神曲发酵炮制过程中样品进行微生物的分离及初步菌种分类鉴定。结果:共分离获得细菌8株、酵母菌3株、丝状真菌4株。8种细菌分别为成团泛菌、溶血葡萄球菌、阿氏肠杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌、戊糖片球菌;3种酵母菌分别为伯顿生丝毕赤酵母、汉氏德巴利氏酵母、库德里阿兹威氏毕赤酵母;4种丝状真菌分别为卷枝毛霉、总状毛霉、尔青霉、亮白曲霉。结论:六神曲传统发酵炮制工艺涉及多种微生物共同参与发酵过程,为后续建立六神曲现代发酵炮制工艺奠定了菌种基础。     

淡豆豉发酵过程总黄酮和多糖含量动态分析

目的:对淡豆豉发酵过程不同发酵阶段总黄酮和多糖的含量进行动态分析,为淡豆豉炮制原理和炮制工艺研究提供参考。方法:以染料木苷为对照品,采用紫外分光光度法测定淡豆豉发酵过程中不同阶段总黄酮的含量;以葡萄糖为对照品,用苯酚-硫酸法显色,采用可见分光光度法测定淡豆豉发酵过程中不同阶段多糖含量。结果:淡豆豉发酵过程,总黄酮含量随发酵时间累积呈上升趋势,闷制9 d时,总黄酮含量达到峰值,闷制9～15 d总黄酮含量变化不明显;多糖含量在发酵前期随着发酵时间延长呈上升趋势,发酵后期随发酵时间延长呈先降后升的变化趋势。多糖含量在发酵至13 d时多糖含量达到最高值,闷制1～3 d多糖含量逐渐下降,闷制3～15 d多糖逐渐升高,闷制15 d时多糖含量达到最高值,与发酵13 d时的多糖含量接近。结论:淡豆豉发酵过程的闷制发酵有助于总黄酮的累积,闷制与否对淡豆豉多糖含量影响不明显。综合总黄酮和多糖含量的动态分析,淡豆豉发酵过程闷制环节是必要过程。     

咽炎清丸微生物限度检查方法的研究

目的:研究咽炎清丸的微生物限度检查方法。方法:按照《中国药典》微生物限度检查法的规定,采用平皿法(1 mL/皿)对咽炎清丸细菌数、霉菌和酵母菌数进行测定;采用直接接种法对咽炎清丸控制菌进行测定。结果:采用平皿法对细菌、霉菌和酵母菌进行检查,细菌回收率均大于70%;采用直接接种法对控制菌(大肠埃希菌、大肠菌群)进行检查,试验组、阳性对照组均验出控制菌;阴性对照组未检出试验菌。结论:可采用平皿法(1 mL/皿)进行细菌、霉菌和酵母菌数检查;采用直接接种法进行控制菌(大肠埃希菌、大肠菌群)检查。     

淡豆豉炮制过程中拮抗菌对黄曲霉毒素B_1的拮抗能力考察

目的考察从淡豆豉炮制过程中分离鉴定的枯草芽孢杆菌、鲑色锁掷酵母菌、黑曲霉菌、屎肠球菌、鸟肠球菌5株菌对产毒黄曲霉菌的拮抗能力,为探讨淡豆豉炮制过程中黄曲霉毒素的消长机制奠定基础。方法通过平板对峙法与十字交叉法检测5株菌及其代谢产物对产毒黄曲霉菌生长的影响;使用液质联用技术(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)考察5株菌对黄曲霉毒素B_1(aflatoxinB_1,AFB_1)的降解效果。结果 AFB_1在10～200ng/m L线性关系良好,r为0.999,低、中、高质量浓度的加样回收率为92.4%～97.2%,RSD为1.48%～2.35%(n=3)。其中鲑色锁掷酵母菌降解AFB_1效果最好,达43.65%,对产毒黄曲霉菌生长抑制作用最强的是鲑色锁掷酵母菌,达64.29%,发酵上清液对产毒黄曲霉菌生长抑制作用最强的是屎肠球菌,为29.63%。结论淡豆豉炮制过程中存在多种AFB_1拮抗微生物。     

再闷过程影响淡豆豉炮制工艺研究

目的 优化淡豆豉的发酵炮制工艺,明确再闷过程是淡豆豉发酵炮制中不可缺少的重要环节。方法 按《中国药典》2010年版制法结合古法炮制,以总异黄酮及大豆苷元和染料木素质量分数为考察指标,结合成品性状（色泽、气味、皱缩程度以及断面和硬度）为感官指标,优化炮制过程中再闷前（包括蒸煮时间、发酵温度、发酵时间）和再闷过程（包括再闷温度、再闷时间）的炮制工艺参数。结果 优化的炮制工艺为黑大豆在吸尽药液后蒸煮1.5 h,（30±2）℃条件下发酵6～8 d至黄衣上遍;洗去黄衣后,置于容器内,用水密封,进入再闷过程：置于温度为（30±2）℃的培养箱内再闷12～15 d。再闷期间每3天倒出,翻动,稍晾干,反复4～5次,最后略蒸,干燥。经过再闷的淡豆豉其品质较未经再闷过程的淡豆豉具有明显优势,其成品具有芳香气味,色泽光亮,质地柔软,断面为棕黑色,表皮皱缩;总异黄酮及大豆苷元和染料木素质量分数也达到最高值。结论 再闷过程是淡豆豉发酵炮制中不可缺少的重要环节,是影响淡豆豉主要化学成分量和成品性状改变的关键因素,优化后的淡豆豉炮制工艺将为指导淡豆豉规范化生产、研究淡豆豉的发酵炮制机制奠定基础。     

淡豆豉炮制过程中产γ-氨基丁酸微生物的筛选和鉴定

课题组前期发现淡豆豉中存在较高含量的γ-氨基丁酸(GABA),该研究对淡豆豉炮制过程中不同时间点的样本进行产GABA微生物的筛选和鉴定,为研究淡豆豉炮制机制奠定基础。按2010年版《中国药典》制备淡豆豉,获取淡豆豉炮制过程中不同时间点的样本;用选择性培养基分别对不同时间点样本中的细菌、真菌进行培养、分离纯化,挑选优势菌种;将各优势菌分别接种在指定的液体培养基中进行培养,制备各优势菌发酵液;采用薄层色谱法对各菌株发酵液GABA进行定性初筛,对初筛中有GABA斑点的发酵液采用该实验室已建立的柱前在线衍生-高效液相色谱法进行定量检测,从优势菌中筛选产GABA的微生物;应用16S rDNA,18S rDNA序列分别对产GABA的细菌和真菌进行PCR扩增、对扩增产物进行测序,测序结果通过NCBI同源性比对、MEGA 7.0软件构建系统发育树进行分子生物学鉴定。该实验筛选并鉴定出9种产GABA微生物,分别是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis,屎肠球菌Enterococcus faecium,鸟肠球菌Enterococcus avium,溜曲霉Aspergillus tamarii,黄曲霉Aspergillus flavus,黑曲霉Aspergillus niger,极细支孢霉Cladosporium tenuissimum,桔青霉Penicillium citrinum,白腐菌Phanerochaete sordida。该研究首次从淡豆豉中筛选出9种产GABA微生物,多种产GABA的优势微生物在淡豆豉GABA的形成中可能起重要作用。     

小儿感冒颗粒微生物限度检查方法的建立及验证

目的:建立小儿感冒颗粒微生物限度检查方法。方法:按《中国药典》2010年版一部微生物限度检查方法的要求进行验证试验。结果:小儿感冒颗粒微生物限度检查细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法采用常规法进行验证试验,试验组的菌回收率均不低于70%;控制菌(大肠埃希菌、大肠菌群)检查方法用大肠埃希菌采用常规法(100mL/瓶、10mL/支)进行验证试验,试验组、阳性对照组检出大肠埃希菌,阴性对照组无菌生长。结论:小儿感冒颗粒微生物限度检查细菌数、霉菌和酵母菌数测定方法可用常规法(1mL/皿)测定,控制菌(大肠埃希菌、大肠菌群)检查方法可用常规法(100mL/瓶、10mL/支)进行检查。     

保鲜巴戟天细菌和霉菌的分离与鉴定

目的:为了筛选对巴戟天有明显抑菌作用保鲜剂,对其表面微生物数量进行测定,并对细菌、霉菌的种类进行分离与鉴定。方法:应用细菌和霉菌分类鉴定法。结果:经10 g牛蒡低聚果糖,20 g壳聚糖和0.5 g山梨酸钾的组合保鲜剂处理60 d后,巴戟天表面细菌总数为3.0×104cfu/g,霉菌总数为1.5×104cfu/g,保鲜效果优于其他处理。结论:巴戟天表面常见的优势菌群分别为明串球菌属、气球菌属和青霉属。     

淡豆豉炮制过程中不产毒黄曲霉菌的分布特征及其对产毒菌的拮抗作用

目的 明确淡豆豉Sojae Semen Praeparatum炮制中不产毒黄曲霉菌Aspergillus flavus的分布特征及其拮抗能力。方法 按实验室前期已建立的规范炮制工艺制备淡豆豉,获取淡豆豉炮制中9个不同时间点的样本,各样本用氯硝胺18%甘油培养基（DG-18）进行培养、分离纯化,经形态学初筛、分子生物学鉴定为黄曲霉菌。通过紫外荧光法初筛和超高效液相色谱-串联质谱法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS）测定黄曲霉菌产毒能力,确定为不产毒黄曲霉菌（简称：不产毒菌）。用平板对峙法检测不产毒菌及其代谢产物对产毒黄曲霉菌标准株（产毒菌）生长的影响。结果 从淡豆豉炮制过程中共筛选出21株不产毒菌,其中“黄衣上遍”过程中的第3、6天分别筛选出3、6株,“再闷”过程中的第3、6、9天分别筛选出2、7、3株,再闷第6天筛选到的不产毒菌最多。不产毒菌对产毒菌的生长抑制率在26.75%～36.69%,抑制效果最好的是F6-L8（指第1批在“黄衣上遍”阶段的发酵第6天样品中筛选到的...     

分离筛选淡豆豉发酵菌的培养基优化

目的:优化适用于淡豆豉发酵菌种分离筛选的选择性培养基以达到科学、简便、快速获得淡豆豉优势发酵菌的目的。方法:采用含有桑叶、青蒿煎煮液的药性培养基与另外4种微生物常规培养基包括马铃薯葡萄糖琼脂(PDA),孟加拉红(RA),察氏琼脂(CA),营养琼脂(NA)于(28±2)℃恒温培养淡豆豉发酵菌,比较菌群组成、比例的变化规律。结果:采用含青蒿、桑叶药性选择性培养基分离筛选淡豆豉发酵菌优于其他5种常规培养基,体现出科学、简便、快速、专一的特性。结论:根据不同发酵辅料,确立专属选择性培养基的方法同样可以应用于各种发酵类中药优势发酵菌的分离筛选。     

淡豆豉炮制工艺的优化研究

目的:优化淡豆豉的炮制工艺,明确工艺参数,为淡豆豉的规范化生产和质量控制提供依据。方法:采用单因素试验,以淡豆豉中大豆苷元、染料木素和异黄酮的含量为指标,考察桑叶和青蒿用量比例、药汁拌入大豆时的相对密度、蒸煮时间、发酵温度、发酵时间、再闷时间和略蒸时间;采用正交试验,以总黄酮含量为指标,考察桑叶和青蒿煎煮时间、煎煮次数、加水量,从而规范淡豆豉的炮制工艺。结果:最佳炮制工艺为取桑叶90g、青蒿100g,加入约生药量18倍水煎煮3次,每次1h,药液相对密度为1.10～1.12g/cm3,拌入1kg大豆中,蒸煮1.5h,发酵温度为(30±2)℃,发酵6～8d。结论:优化的炮制工艺适合淡豆豉的炮制加工。     

肉豆蔻饮片微生物计数检查方法研究及其在霉变过程中菌落总数的测定

目的：研究肉豆蔻饮片微生物限度检查的方法,分析不同霉变程度肉豆蔻饮片需氧菌、霉菌及酵母菌菌落总数的变化趋势。方法：参照2015年版《中国药典》四部“通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”进行方法的建立和验证,采用建立的方法对霉变过程中的肉豆蔻饮片进行微生物计数。结果：肉豆蔻饮片对方法适应性验证的5种菌均有抑制作用,需采用培养基稀释法进行检验。随着霉变程度加大,肉豆蔻饮片需氧菌、霉菌、酵母菌菌落总数均呈升高趋势,且加速0-6天时增长缓慢,6-9天呈爆发式增长,9-39天匀速增长。结论：该方法可用于肉豆蔻饮片的微生物计数。建议对易霉变药材肉豆蔻增设需氧菌、霉菌、酵母菌总数限值,以保障用药安全。     

淡豆豉发酵过程中影响因素研究

目的 考察不同后酵温度及时间、直接后酵等炮制方式对淡豆豉质量的影响,以阐释发酵原理,更好地指导生产。方法 使用多因素评价淡豆豉发酵程度。以HPLC法测定黄酮类成分,采用Agilent Zobax SB-C₁₈色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5μm);流动相甲醇-0.5%冰醋酸溶液,梯度洗脱;体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;检测波长260 nm。使用滴定法测定酸值;使用色差仪测定色度。结果 黄酮类成分的后酵温度越接近50～55℃,苷转变为苷元的速度越快,但超过45℃后,苷元总量会随着发酵时间的增加而减少。酸值,除65℃外,后酵温度越接近50℃,第1天酸值增加越多,但对发酵终点酸值影响不大,温度过高会导致酸值下降。色度,后酵温度越接近50～55℃,淡豆豉颜色越呈棕黑色,无前酵过程使颜色变浅。结论 淡豆豉中黄酮苷成分转化的必要条件是酶和水,单独升温对转化率贡献不大,前酵过程是酸值增加和颜色变深的必要步骤,适度提升后酵温度可以有效减少淡豆豉生产周期。     

淡豆豉炮制中黄曲霉毒素产毒株的筛选鉴定和产毒能力测定

目的 对淡豆豉炮制过程中产黄曲霉毒素(aflatoxins,AFTs)的微生物(简称产毒菌)进行筛选鉴定、定量分析和产毒能力测定.方法 运用紫外荧光法初筛淡豆豉炮制中各样本的产毒菌并菌落计数;对初筛菌株的18S rDNA序列进行PCR扩增、测序,测序结果经NCBI同源性比对、MEGA7.0软件构建系统发育树进行分子生物...