表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞接触性共培养方法的建立

目的研究表皮黑素细胞与毛囊角质形成细胞在接触性共培养体系中的相互作用。方法胰酶消化游离毛囊和包皮的表皮，分别获取纯化的角质形成细胞和黑素细胞，第3代毛囊角质形成细胞接种于6孔板中，48h后以表皮黑素细胞：毛囊角质形成细胞为1：2、1：10和1：20的比例接种黑素细胞。在1：10接种体系中，加α-黑素细胞刺激素和烟酰胺，干预6d后，NKI／beteb单抗染色。结果毛囊角质形成细胞定植后接种黑素细胞，两种细胞均增殖迅速。以1：10比例接种更能模拟生理状态。1：20接种可清晰观察到黑素细胞树突与角质形成细胞的接触方式。1：2接种可获大量黑素细胞。在单纯黑素细胞和共培养体系中，α-黑素细胞刺激素对黑素细胞增殖无明显影响，但树突明显增多、伸长。烟酰胺对单纯黑素细胞培养无影响，共培养状态下，黑素细胞树突收缩，黑素体聚集在胞体周围。结论毛囊角质形成细胞与皮黑素细胞接触性共培养．适用于人色素系统的研究。     

喜树碱对人原代角质形成细胞自噬的影响

目的 探讨喜树碱对人原代角质形成细胞（HPK）自噬的影响。方法 取健康男性包皮组织,采用两步消化法分离提取HPK,取第3代细胞用于实验。将HPK分为实验组和对照组,实验组用200 nmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L喜树碱处理,对照组用0.1%二甲基亚砜（DMSO）处理。处理24、48 h后,采用CCK8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测药物作用24 h后细胞凋亡;免疫印迹法检测微管相关蛋白1轻链3（LC3）、p62变化。选取2 μmol/L喜树碱作用HPK 24 h,间接免疫荧光法检测LC3蛋白变化,透射电镜观察自噬体超微结构,进一步确认喜树碱对自噬的诱导效应。结果 随着喜树碱浓度的增加,对HPK的增殖抑制作用逐渐增强,各组24 h增殖抑制率总体差异有统计学意义（F = 152.9,P < 0.01）,其中2、6 μmol/L组高于对照组,差异有统计学意义（t = 12.09、18.76,均P < 0.01）,200 nmol/L组与对照组差异无统计学意义（t = 2.24,P > 0.05）。48 h时各组增殖抑制率总体差异有统计学意义（F = 123.8,P < 0.01）,实验组均高于对照组（均P < 0.01）。对照组和200 nmol/L、2 μmol/L、6 μmol/L喜树碱组24 h细胞凋亡率分别为（2.30 ± 1.68）%、（15.90 ± 2.14）%、（29.33 ± 3.51）%、（35.28 ± 3.05）%,差异有统计学意义（F = 89.57,P < 0.01）,各实验组与对照组比较差异均有统计学意义（均P < 0.01）。2、6 μmol/L喜树碱处理细胞24 h后,LC3Ⅱ蛋白显著上调,p62蛋白表达下调。间接免疫荧光检测显示,2 μmol/L喜树碱组与对照组自噬体阳性细胞比例分别为（60.16 ± 8.78）%、（38.96 ± 13.12）%,差异有统计学意义（t = 3.003,P < 0.05）。透射电镜观察到2 μmol/L喜树碱作用细胞24 h后细胞内形成自噬体和自噬溶酶体。结论 2、6 μmol/L喜树碱可诱导HPK自噬水平升高,同时抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。     

人角质形成细胞株HaCaT细胞表皮生长因子受体内化和下调的研究

目的 了解表皮生长因子受体（EGFR）信号转导与负反馈调节的分子生物学机制。方法 采用免疫沉淀、免疫印迹、间接免疫荧光结合激光扫描共聚焦显微镜等技术，研究HaCaT和CHOwt细胞株中多种配体诱导的EGFR内化和下调情况。结果 免疫印迹检测表明，表皮生长因子（EGF）与肝素结合的EGF（HB-EGF）可引起EGFR总量的快速下调，转化生长因子α（TGFα）及Heregulin则未明显促进受体的降解。EGF、HB-EGF和TGFα处理HaCaT细胞较长时间后活化型受体数量亦不同程度减少。间接免疫荧光染色显示，未处理细胞的EGFR主要分布在胞膜，胞质亦见少量分布。经10 min EGF处理后EGFR聚集成斑状结构（HaCaT细胞明显），并形成内吞体（CHOwt细胞明显），而此时EGFR总量尚未发生明显改变。经过4 h EGF处理后，HaCaT和CHOwt细胞内EGFR信号明显减弱，说明此时受体已经下调。结论 不同配体对HaCaT细胞的EGFR总量及活化型受体的下调作用不同。HaCaT和CHOwt细胞EGFR内化和下调的信号转导机制可能存在差异。     

血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应研究北大核心CSCD

目的研究血清饥饿处理对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬的调控效应,初步分析其分子机制。方法采用血清饥饿处理体外培养的HaCaT细胞诱导自噬,分析血清饥饿对细胞形态和细胞活力（MTr法）的影响。透射电镜观察自噬体囊泡形成,使用Western印迹法进行自噬标志性分子LC3-I-Lc3Ⅱ转化分析和自噬关键基因Atg7的表达以及MDC染色标记自噬体囊泡。对mTOR的蛋白表达及其ser2448和ser2481位点磷酸化产物水平进行分析。结果血清饥饿HaCaT细胞活力上升,电镜观察和MDC染色发现,血清饥饿处理的HaCaT细胞中有自噬体囊泡形成。Western印迹显示,血清饥饿细胞LC3-I—LC3Ⅱ转化（LC3-Ⅱ,LC3-I比率为3．5084-0．415）较正常培养的细胞（0．538±0．038）显著上调（两组比较,t=13．32,P〈0．01）;自噬关键基因Atg7表达上调（对照细胞和血清饥饿细胞Atg7／GAPDH分别为0．021±0．006和0．048-4-0．011,t=7．27,P〈0．05）。血清饥饿处理的细胞中,roTOR的ser2448位点、ser2481位点磷酸化产物水平显著降低（对照细胞和血清饥饿细胞间的磷酸化mTORser2448／mTOR比率分别为0．762±0．108和0．394±0．048,t=7．58,P〈0．05;磷酸化mTORser248I／mTOR的比率分别为0．263±0．039和0．111±0．020,t=13．77,P〈0．01）。结论血清饥饿处理可以诱导HaCaT细胞发生自噬,并且导致细胞活力上升。这种自噬的诱导可能与自噬调控关键元件mTOR蛋白活化抑制相关。     

左旋维生素C导入联合外用烟酰胺凝胶治疗黄褐斑疗效观察

目的观察左旋维生素C超声波导入联合外用烟酰胺凝胶治疗黄褐斑的疗效。方法60例患者随机分成两组,连续治疗3个月,每两周随访1次。治疗组30例,左旋维生素C超声波导入,每周2次,外搽烟酰胺凝胶2次／d。对照组30例,外搽烟酰胺凝胶2次／d。观察两组的疗效差异,治疗组不同治疗次数与疗效之间的关系以及不良反应。结果治疗组疗效优于对照组,随着治疗次数的增加效果更明显。结论左旋维生素C超声波导入联合外用烟酰胺凝胶治疗黄褐斑疗效确切,不良反应较少,值得在临床应用。     

中药白芨促进角质形成细胞的游走

目的　探讨中药白芨对角质形成细胞游走的影响及其对创伤愈合的作用机制。方法　采用皮肤器官培养法 (浮游法 )培养SD小鼠皮片 ,比较观察了含不同浓度白芨的培养基对角质形成细胞游走的影响及培养时间与游走长度的关系。结果　发现白芨浓度为 2× 10 -2 mg/mL及 2× 10 -3 mg/mL时 ,角质形成细胞游走比对照组显著地快和长。含白芨组更早地显示游走迹象 ,较对照组早 4h。培养48h内 ,白芨组及对照组中培养时间与游走长度皆呈直线正相关 ,白芨组的促游走作用显著地优于对照组。结论　提示白芨有明显的促进角质形成细胞游走作用 ,这种促游走作用可能对治疗皮肤创伤早期愈合有重要影响。     

UVB对角质形成细胞产生细胞因子的影响

角质形成细胞可产生多种细胞因子，这些细胞因子除介导炎症和免疫反应外，还参与组织细胞的生长和分化。UVB照射影响了角质形成细胞合成、分泌细胞因子，并影响细胞因子对角质形成细胞的作用及细胞因子之间的相互作用。概述角质形成细胞产生各种细胞因子的生物学效应。     

抗角蛋白自身抗体对角质形成细胞凋亡的影响

目的 探讨抗角蛋白自身抗体(AK auto Ab)对角质形成细胞凋亡的影响。方法 以不同浓度AK auto Ab作用体外培养人角质形成细胞后,用光镜及透射电镜观察细胞形态变化、用流式细胞仪分析细胞周期变化以及提取角质形成细胞DNA作电泳特征分析。结果 AK auto Ab作用后培养的角质形成细胞光镜、电镜下形态发生凋亡特有的改变,出现核固缩、染色质凝聚,并形成凋亡小体;细胞周期分析图中出现凋亡峰;DNA电泳呈有一定间隔的梯状条带。结论 AK auto Ab对角质形成细胞的凋亡具有诱导作用。     

UVB与钙离子对体外培养人角质形成细胞表达天疱疮抗原的影响

目的 研究中波紫外线(UVB)照射以及不同钙离子浓度对角质形成细胞表达天疱疮抗原的影响.方法 通过改变培养基中的钙离子浓度以及采用不同剂量UVB照射体外培养的人角质形成细胞,在不同时间段以寻常型天疱疮(PV)或落叶型天疱疮(PF)血清作为一抗进行免疫荧光检测,观察寻常型天疱疮抗原(PVA)和落叶型天疱疮抗原(PFA)的表达情况;提取细胞或皮肤表皮组织蛋白质,用PV和PF血清进行免疫印迹检测.结果 无论是否增加钙离子浓度,体外培养人角质形成细胞间隙均可以检测到PV血清特异性着色.只有增加培养基中钙离子浓度后,形成的复层化角质形成细胞间隙才可以检测到PF血清特异性荧光着色.不同剂量UVB照射后的角质形成细胞均不产生PF血清的特异性着色.PF血清与160000条带反应,PV血清可与130000和160000两条带反应.结论 体外培养的单层或复层角质形成细胞均可以表达PVA,提高培养基中钙离子浓度可以诱导培养人角质形成细胞复层化并表达PFA,而UVB照射不能促使人角质形成细胞在体外培养条件下表达PFA.     

白念珠菌与培养人角质形成细胞的相互作用及其分子机理

目的 研究白念珠菌与培养人角质形成细胞直接作用的形态学、生物学反应及其分子机理。方法 （1）将白念珠菌孢子（或煮沸灭活的白念珠菌孢子,直径3.2μm的乳胶颗粒）加入角质形成细胞培养系统中定时用扫描和透射电镜观察;（2）用荧光法和计数法测定白念珠菌等与角质形成细胞共同培养上清液对角质形成细胞生长的影响;（3）用ELISA法测定白念珠菌或乳胶颗粒与角质形成细胞共同培养上清液和角质形成细胞内液中细胞因子的含量。结果 （1）发现与角质形成细胞粘附的白念珠菌随时间经过而增加。灭活的白念珠菌几乎不发生粘附,乳胶颗粒与角质形成细胞粘附后被吞噬,角质形成细胞伸出很多纤维样结构与菌体或乳胶颗粒粘附;92）白念珠菌与角质形成细胞共同培养液在50%浓度下可显著促进角质形成细胞增殖,灭活的白念珠菌或乳胶颗粒与角质形成细胞共同培养液对角质形成细胞增殖有一定的促进作用;（3）白介素1α在白念珠菌或乳胶颗粒与角质形成细胞共同培养液对角质形成细胞增殖有一定的促进作用。（3）白介素1α在白念珠菌与角质形成细胞共同培养上清液中增高,但细胞内液中下降,转化生长因子-α和碱性成纤维细胞生长因子在上清液及细胞内液中水平均增高。结论 角质形成细胞具有非特异性吞噬功能,白念珠菌与角质形成细胞作用可刺激角质形成细胞释放细胞因子,引起炎症反应和细胞生长。     

Effect of vitamin A acid on cyclic nucleotides of cultured keratinocytes

Summary Primary cultures of guinea pig ear keratinocytes were treated with vitamin A acid at plating, or at 14 h or 14 days after plating. The intracellular content of the cyclic nucleotides cAMP and cGMP was determined by radioimmunoassay at intervals during a period of 50 h after treatment. When added at plating, vitamin A acid produced a wave of DNA synthesis and increase in DNA which was at maximum between 30 and 40 h after plating, and coincided with decreased cAMP levels. This may represent a subpopulation of keratinocytes in S phase. Treatment with vitamin A acid at 14 h or 14 days after plating resulted in an immediate but temporary fall in cAMP and cGMP, and a wave of thymidine uptake but no increase in DNA per dish. Thus, a single treatment with vitamin A acid is mitogenic only when applied at plating. At other times, it can cause changes in cyclic nucleotide content without any observable cell proliferation.Supported by United States Public Health Service Grant AM 15107     

HaCaT细胞对红色毛癣菌生长的抑制作用

目的 探讨角质形成细胞对红色毛癣菌生长的抑制作用.方法 将HaCaT细胞采用含10%小牛血清的DMEM培养液,5%CO2环境下,37 ℃孵育至80%融合时,弃去培养液,加入用无血清DMEM配制的菌丝段悬液共孵育(浓度0.1×105/mL～1.0×105/mL),并以菌丝段悬液作为阴性对照.分别于4 h、8 h、16 h和24 h制备共孵育后的菌丝段悬液,进行台盼蓝染色计数和菌落计数,对真菌生长状况进行评价并计算真菌生长抑制率.结果 在细胞和菌丝段共孵育4 h、8 h、16 h和24 h,台盼蓝染色法测得的菌生长抑制百分数分别为46.8%±8.0%、64.0%±5.5%、76.3%±7.7%和39.5%±4.9%;菌落计数法测得菌生长抑制百分数分别为39.7%±4.9%、58.0%±8.9%、68.3%±7.4%和39.9%±5.5%.结论 HaCaT细胞对体外培养的红色毛癣菌有一定的抑制作用.     

Incorporation of linoleic acid by cultured human keratinocytes

Abstract Linoleic acid is required for the formation and maintenance of the epidermal barrier, but most of the current in vitro keratinocyte culture systems are linoleic acid-deficient. The aim of the present study was to examine the efficiency of linoleic acid uptake in human keratinocyte cultures grown under submerged and air-exposed conditions in serum-free medium. The water-insoluble linoleic acid was bound to carrier molecules (cyclodextrin or bovine serum albumin). Comparable results were obtained with home-made and commercially available linoleic acid complexes. In the submerged cultures, the increase of the linoleic acid medium concentration (ranging from 0 to 20 μg/ml) resulted in a gradual increase in the linoleic acid cellular content, which exceeded 1.4 times the value found in native epidermis when the highest concentration of linoleic acid was used. The addition of linoleic acid did not alter the profile of the other epidermal fatty acids, with the exception of oleic acid, which decreased in parallel with the increasing linoleic acid content. While the content of linoleic acid found in phospholipids was similar to that in native epidermis, a large excess of linoleic acid was detected in triglycerides, the synthesis of which was markedly increased in cultures grown submerged in medium containing higher concentrations of linoleic acid. Under air-exposed conditions, the dermal substrate used seemed to be the most limiting factor for efficient linoleic acid supplementation. A low linoleic acid cellular content was detected when an inert filter was used. De-epidermized dermis was found to be the most permeable substrate for linoleic acid complexes. The cellular linoleic acid content increased in a parallel with the increasing linoleic acid concentration (ranging from 4 to 30 μg/ml), but the overall amount incorporated was lower than that in submerged cultures. The content of linoleic acid in the phospholipid and ceramide fractions isolated from reconstructed epidermis grown under air-exposed conditions was close to that of native epidermis, but the triglycerides remained abnormally enriched in linoleic acid, indicating persistence of some anomalies in epidermal lipogenesis in vitro. Received: 18 June 1998 / Received after revision: 15 January 1999 / Accepted: 22 January 1999     

鳄梨油和橄榄油对HaCaT细胞增殖和分化的影响

目的 探讨天然植物鳄梨油和橄榄油对HaCaT细胞系增殖及分化的影响。方法 将培养的HaCaT细胞分为鳄梨油组、橄榄油组及对照组。应用MTT实验确定鳄梨油和橄榄油对HaCaT细胞的适用剂量。以免疫细胞化学、免疫斑点印迹技术分别检测各组HaCaT细胞的c-myc原癌基因（c-myc）、有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）、NF-κB、丝聚蛋白、内披蛋白、角蛋白10的表达。结果 对照组c-myc、MAPK、NF-κB免疫化学反应的扫描灰度均值（GSM）分别为101.9 ± 8.9、91.4 ± 5.1、94.3 ± 7.0,鳄梨油组分别为131.4 ± 6.6、136.3 ± 4.5、134.3 ± 5.2,与对照组比较均显著增加（P < 0.05）;橄榄油组分别为121.1 ± 4.5、107.9 ± 7.3、106.4 ± 5.4,与对照组比较均亦显著增加（P < 0.05）;而鳄梨油组与橄榄油组相比,前者各项GSM均高于后者（P < 0.05）。鳄梨油组和橄榄油组丝聚蛋白、内披蛋白、角蛋白10免疫化学反应的GSM均高于对照组（P < 0.05）;而鳄梨油组与橄榄油组相比,后者均高于前者（P < 0.05）。此外,各组各项免疫斑点印迹的GSM与免疫细胞化学的GSM数据基本相符,在鳄梨油组两者呈显著正相关,r = 0.94,P < 0.01;在橄榄油组两者也呈现显著正相关,r = 0.97,P < 0.01。结论 一定浓度鳄梨油和橄榄油,尤其是鳄梨油对HaCaT细胞可呈现显著的促生长、增殖效应;橄榄油和鳄梨油,尤其橄榄油对HaCaT细胞可呈现显著的促分化效应。     

蛋白酶激活受体2在人角质形成细胞中的表达及功能测定

目的 分析人皮肤角质形成细胞中蛋白酶激活受体2（PAR2） 的表达及其生物学功能,探讨其在皮肤屏障中的作用。方法 以体外培养的人皮肤角质形成细胞原代细胞或细胞系N//TERT 细胞为研究对象,通过免疫荧光染色及蛋白印迹分析细胞中PAR2的表达及分布特点,采用荧光标记的钙流释放法测定PAR2的生物学功能,利用PAR2 的天然底物胰蛋白酶或其激活肽、对照肽及拮抗肽诱导PAR2的活化,观察不同作用底物诱导PAR2活化的特点。 结果 在正常培养条件下,PAR2在皮肤角质形成细胞中呈中低水平表达,不同的培养基组成及培养时间对PAR2的表达水平无明显影响。PAR2的作用底物诱导细胞的钙流释放具有时间及浓度依赖性特点,其中使用50 ～ 250 nmol/L胰蛋白酶作用于角质形成细胞后,可以诱导细胞内钙流释放;使用75 ～ 250 μmol/L PAR2特异性激活肽PAR2-AP （H2N-SLIGKV-COOH）处理角质形成细胞后,即可最大程度地诱发PAR2的活化。而在相同浓度PAR2的拮抗肽PAR2-ANTAP （H2N-FSLLRY-COOH）作用下,PAR2的作用底物所诱导的细胞钙流释放明显受到抑制。分析比较相关荧光强度发现,PAR2激活底物诱导的细胞内钙流释放可以在瞬间（0 ～ 250 s）完成,以50 s的作用时间点细胞内钙流释放强度最大。此外,PAR2的激活可以显著增加皮肤角质形成细胞ERK蛋白的磷酸化水平,从而激发细胞内MAPK信号转导通路。结论 皮肤角质形成细胞表面表达有PAR2受体,该受体活化受胰蛋白酶及PAR2的特异性激活肽调控,PAR2的活化可影响角质形成细胞的生理功能,诱导细胞内钙流释放。     

Growth and differentiation of human keratinocytes cultured on eye lens capsules

Summary The efficiency of the outgrowth of human epidermal and hair-follicle-sheath keratinocytes was studied using three different growth substrates: plastic, type-I collagen and bovine eye lens capsules (the Epicult system). It was shown that the eye lens capsule is the best substrate, since a higher percentage of cultures showed outgrowth, and the outgrowth of epidermal keratinocytes was much more rapid. This effect is related to the faster migration (not proliferation) of cells grown on lens capsules as compared to the two other substrates. The view that lens capsules can replace the basement membrane present in vivo was supported by the finding that two basement-membrane components, i.e., laminin and fibronectin, are present on lens capsules. It was shown that, in cultures grown on lens capsules, bullous-pemphigoid antigen is restricted to the basal layer, indicating that the differentiation of these cells is comparable to that of keratinocytes grown on irradiated, non-viable pig dermis.