阳离子脂质体DOTAP介导报道基因转染骨关节病滑膜细胞的实验研究

目的：探索阳离子脂质体ＤＯＴＡＰ介导目的基因转染骨关节病滑膜细胞的最佳条件。方法：分离培养骨关节病滑膜细胞,使用荧光质粒pＥＧＦＰ－Ｃ３作为报道基因,与阳离子脂质体ＤＯＰＡＰ一起转染骨关节病滑膜细胞;通过设立不同转染时间组、不同表达时间组以及不同ＤＯＴＡＰ剂量组,观察绿色荧光蛋白的表达。结果：使用阳离子脂质体ＤＯＴＡＰ介导荧光质粒转染骨关节病滑膜细胞,转染时间在 ６ｈ左右, ＤＯＴＡＰ（μｌ）／ＤＮＡ（μｇ）比值在 ７：１左右,可于转染后４８ｈ左右表达出的蛋白量最大。结论：阳离子脂质体ＤＯＴＡＰ介导荧光质粒转染骨关节病滑膜细胞转染条件的优化,为今后骨关节病滑膜细胞非病毒基因转移的研究提供实验依据。     

体外诱导负载TGF-β1基因的兔关节滑膜细胞向软骨细胞分化

目的 探讨体外诱导负载TGF-β1基因的兔关节滑膜细胞向透明软骨细胞分化的可行性,为组织工程学修复关节软骨损伤提供体外实验依据.方法 体外培养扩增B型滑膜细胞并纯化,构建pcDNA3.1-TGF-β1,用Lipofectamine 2000法转染,转染pcDNA3.1-TGF-β1组为实验组,转染pcDNA3.1(+)空质粒组为对照组,未转染组为空白组.转染后48 h行G418筛选,RT-PCR检测TGF-β1的瞬时表达,同时取阳性细胞爬片,行抗TGF-β1免疫组织化学染色;G418维持筛选,每2 d取部分细胞计数,连续12 d,绘制生长曲线,转染后3周,每周取部分细胞爬片行抗TGF-β1和抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色.图像分析采用Image-Pro Plus V6.0软件分析处理,实验数据采用SPSS 13.0行统计学处理,组间两两比较采用方差分析.结果 实验组转染后转染率为18%,转染后生长曲线显示细胞早期生长活性下降,细胞数量在转染后第4天降低到3.6×104/ml,第3天RT-PCR检测到TGF-β1阳性片段,抗TGF-β1免疫组织化学染色见细胞内阳性颗粒,对照组及空白组均为阴性;细胞转染后第3周,实验组抗TGF-β1及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色仍见细胞内阳性颗粒,对照组及空白组为阴性;图像分析结果表明,转染后第7天实验组抗TGF-β1的PU值为(19.04±1.26),对照组及空白组PU值分别为(4.07±0.65)和(3.23±0.56),差异有统计学意义(P<0.05);转染后14 d实验组抗Ⅱ型胶原的PU值为(13.74±1.27),对照组及空白组PU值分别为(4.62±0.56)和(3.93±0.38),差异有统计学意义(P<0.05).结论 脂质体法重组pcDNA3.1-TGF-β1基因可成功转染兔关节滑膜细胞,转染后细胞成功表达TGF-β1,并分泌Ⅱ型胶原蛋白,表现出透明软骨细胞样生理特征,滑膜细胞有望成为一种良好的软骨组织工程的种子细胞.     

过氧化氢体外诱导人关节软骨细胞外基质降解研究

目的:研究人关节软骨细胞在体外模型中,氧分压增高对关节软骨细胞的影响。方法:建立过氧化氢诱导人软骨细胞损伤模型,采用CCK-8试剂检测过氧化氢刺激关节软骨细胞后的细胞活力,并通过RT-PCR和Western Blot测定关节软骨细胞中Ⅱ型胶原(COLⅡ)、粘多糖(ACAN)、金属蛋白酶13(MMP13)和含血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5(ADAMTS5)等软骨基质相关基因的表达水平。结果:一定量浓度的过氧化氢体外刺激人关节软骨细胞后,在12 h时,细胞活力升高,在24 h时,细胞活力下降;过氧化氢刺激软骨细胞24 h后检测COLⅡ和ACAN,其表达水平下降(P<0.05),而MMP13和ADAMTS5表达水平升高(P>0.05)。结论:过氧化氢模拟的软骨细胞外活性氧浓度增高会影响软骨细胞基质的合成与降解。     

人胰岛素样生长因子1基因转染关节软骨细胞及其稳定表达

目的　研究人胰岛素样生长因子 1 (hIGF 1 )基因转染关节软骨细胞获得稳定表达的可行性。方法　用脂质体转染法将含有hIGF 1cDNA的真核表达载体转染兔关节软骨细胞 ,经G4 1 8筛选 ,形成阳性细胞克隆。继续培养 4周 ,原位杂交检测hIGF 1的表达 ,免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原的表达。结果　G4 1 8筛选后所获得的阳性细胞克隆 ,原位杂交检测表明hIGF 1基因得到稳定表达 ,免疫细胞化学检测显示转染后的软骨细胞仍表达Ⅱ型胶原。结论　外源性hIGF 1基因能够在软骨细胞内获得稳定表达 ,而转染后的软骨细胞仍能稳定表达Ⅱ型胶原     

SHIP基因真核表达载体的构建、鉴定及对白血病细胞系K562的抑制作用

目的 构建真核表达质粒pCAC-IRESSHIP-GFP,并观察其在K562细胞中的表达. 方法 将SHIP基因的RT-PCR产物克隆入载体pCAG-IRES-GFP,经酶切、鉴定及测序分析,构建pCAG-IRESSHIP-GFP重组真核表达质粒.实验设置3个组:K562组(未转染)、K562/IRES组(转染宅载体pCAG-IRGA-GFP),K562/SHIP)组(转染重组质粒pCAC-IRES-SHIP-GFP).荧光显微镜和流式术榆测重组质粒的转染效率;Western blotting检测各组SHIP蛋白的表达及Akt磷酸化水平变化;MIT法和流式术分析SHIP基凶转染对细胞增殖的影响. 结果 重组质粒pCAG-IRESSHIP-GFP已成功载人SHIP的全长编码基凶,序列测定的结果与预期设计完全一致.荧光显微镜在K562/SHIP组町见绿色荧光,转染效率为4&2%±6.6%.Westem blotting显示K562/SHIP组有明显的SHIP蛋白表达,且p-Akt-308和p-Akt-473的水平(分别为0.182和0.381)较K562/IRES组(0.361和0.716)和K562组(0.365和0.725)明显下降(P＜0.01).流式术分析显示K562/SHIP组细胞生长减慢,G0/G1期细胞增多、G2/M期细胞减少,增殖指数降低. 结论 成功构建了3 585bp的SHIP基因真核表达质粒pCAG-IRES-SHIP-GFP,并在K562细胞中表达.外源性SHIP基因转染能使K562细胞增殖受抑,原因可能与Akt的磷酸化下调有关.     

腺病毒介导神经营养素-3基因转染施万细胞

目的：构建神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)基因转染的施万细胞。方法：NT-3基因重组腺病毒(AdvNT-3)扩增、纯化和测定后,转染体外培养的施万细胞(Schwann cell,SCs)。用免疫组化和ELISA方法,分别检测NT-3基因转染SCs的NT-3表达及培养液中NT-3的含量。结果：实验中获得得AdvNT-3中外源基因序列与大鼠NT-3的DNA序列完全一致,与未基因转染SCs相比,NT-3基因转染SCs的NT-3阳性增强,培养液中NT-3含量增高。     

人关节软骨细胞的永生化及其表型的诱导

目的 用基因转染技术使人关节软骨细胞（HACs)向永生化转化，通过诱导使永生化软骨细胞的表型得到维持。方法 利用编码人类乳头瘤病毒16型E7基因片段（HPV16E7）的逆转录病毒表达载体pLXSN转染HACs，挑取转化细胞克隆并扩大增殖，继用核型分析，克隆形成实验，裸鼠致瘤实验检测转化特性，Nutridoma-sp及抗坏血酸盐无血清诱导培养基诱导并维持转化软骨细胞的Ⅱ型胶原表型。结果 HACs被HPV16E7成功转化，目前传代已达50代，转化的HACs为良性转化，诱导培养基能够使转化软骨细胞的Ⅱ型胶原合成增加并维持在正常水平。结论 HPV16E7能够使HACs良性转化并长期培养经诱导后转化软骨细胞的Ⅱ型胶原表型能够得到很好维持。     

病患关节软骨中肥大软骨细胞的生物学特性的研究

利用原位杂交、Northern blot 及免疫组化等方法检测了X型胶原、胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)及转换生长因子（TGF-β     

同种异体关节软骨细胞分离体外培养再移植修复关节软骨缺损实验研究

目的关节软骨一旦缺损，其修复能力有限。本实验通过移植同种异体兔软骨细胞，修复关节软骨缺损。方法软骨细胞取自出生后３周雄性新西兰幼兔，体外培养，移植于成年雌性新西兰兔膝关节。股骨内髁缺损区为移植细胞组，左股骨外髁缺损为移植胶原凝胶组，右股骨外缺损为空白对照组。术后所有动物不加外固定任意自由活动，于术后４，８，１２周处死，进行肉眼、组织学、透射电镜观察，标本用带有Ｙ染色体的Ｓｅｘ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ－ｒｅｇｉｏｎ－Ｙ（ＳＲＹ）基因进行杂交。结果移植软骨细胞组术后股骨内髁缺损区得到修复，而移植胶原凝胶组和空白对照组术后股骨外髁缺损未得到修复。ＳＲＹ基因性别鉴定也证明了以上结果。结论关节软骨的缺损及骨性关节炎通过软骨细胞移植方法进行治疗，可再生出新的透明软骨。     

体外培养骺板、关节及肋软骨细胞外基质中糖胺多糖含量的检测和比较

目的　建立定量检测体外培养软骨细胞外基质中糖胺多糖 (GAG)含量的方法 ,以评价体外培养骺板、关节及肋软骨细胞的生物学功能活性。　方法　改进的二甲基亚甲蓝 (DMB)比色法测定细胞外基质的糖胺多糖含量 ,细胞 -玻片甲苯胺蓝 (TB)染色光镜观察。　结果　原代软骨细胞具有最高的GAG分泌活性 ,骺板 (70 .12± 7.72 ) μg cm2 ,关节 (92 .0 0± 10 .15 ) μg cm2 ,肋软骨(80 .61± 11.40 ) μg cm2 ,至第三代则出现了非常明显的下降 ,骺板 (5 3 .2 7± 9.5 0 ) μg cm2 ,关节 (63 .88± 11.92 ) μg cm2 ,肋软骨 (5 8.94± 8.2 1) μg cm2 ;TB染色结果与GAG含量变化相一致。三种软骨细胞间比较差异无显著性意义。　结论　在体外培养过程中 ,软骨细胞随传代次数的增加而其功能活性逐渐降低 ,第三代以后的软骨细胞不适于作为组织工程种子细胞。DMB比色法准确、灵敏 ,可作为一种用于评价体外培养软骨细胞功能活性的有效分析方法。     

脐带全层源间充质干细胞分离培养及向成软骨细胞分化的实验研究

目的从人脐带全层中分离培养间充质干细胞(MSCs),并进行成软骨诱导分化,为组织工程软骨和软骨损伤后修复提供种子细胞。方法采用胶原酶消化法从脐带全层中分离培养间充质干细胞,显微镜下观察细胞形态,细胞计数法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞表型,采用微团细胞培养在软骨诱导液中向软骨细胞分化,阿尔辛蓝及甲苯胺蓝染色检测细胞分化情况,RT-PCR法检测诱导后细胞表达聚集蛋白聚糖(ACAN)基因情况。结果人脐带全层来源的MSCs呈成纤维样形态漩涡状贴壁生长,细胞高表达HLA-I类分子、CD73、CD90、CD166及CD105,不表达CD34、CD45、CD14、CD31、CD80、CD86及HLA-DR。细胞诱导分化21d后,阿尔辛兰及甲苯胺蓝染色阳性;RT-PCR检测诱导后的细胞表达ACAN,而对照组无表达。结论人脐带全层为成体MSCs提供一种新而方便的来源,人脐带间充质干细胞(hucMSCs)体外培养能够向软骨细胞分化。     

STAT3 siRNA引起U251细胞凋亡的研究

目的:观察利用siRNA技术下调人脑胶质母细胞瘤细胞(U251)STAT3表达后对细胞凋亡的影响. 方法:分离培养并间接免疫荧光鉴定大鼠原代星形胶质细胞(NA),用STAT3干涉质粒载体(pSilence2.1-STAT3)及对照载体(pSilence2.1-GFP)转染U251细胞及NA细胞,用Hoechst 33258染色观察凋亡的形态学改变,用Annexin-V试剂盒定量检测凋亡.结果:分离培养了符合实验要求的NA细胞,转染pSilence2.1-STAT3后,U251细胞出现了明显的时间依赖性细胞凋亡,而NA细胞无显著凋亡发生.结论:pSilence2.1-STAT3能诱导U251细胞凋亡,而对正常细胞无显著影响.     

重组逆转录病毒介导成肌细胞中人神经营养素3的基因转移

用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导质粒ｐＬＸＳＮ和人神经营养素３（ｈＮＴ－３）的重组质粒ｐＬｈＮＴ－３ＳＮ专杂ＰＡ３１７细胞，获得了较高滴度的重组逆转录病毒，感染成肌细胞后用ＰＣＲ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交方法检测出ｎｅｏ基因与ｈＮＴ－３的ｍＲＮＡ。获得高表达工程细胞的着急在于培养基因温度的选择。     

逆转录病毒介导的对原代培养成年大鼠成肌细胞基因转染的研究

目的　探索成年大鼠成肌细胞的原代培养方法以及逆转录病毒对其的基因转染。方法　取成年SD大鼠的胸大肌 ,利用组织块法进行培养 ,并对培养细胞进行形态学研究和免疫细胞化学鉴定。以逆转录病毒为载体 ,将绿色荧光蛋白基因导入成年大鼠成肌细胞 ,利用倒置荧光显微镜及流式细胞仪对转染细胞进行观察。结果　采用组织块培养法 ,2周后成肌细胞的密度可达 10 7/ml,免疫细胞化学分析显示 90 %以上的细胞呈骨骼肌特异的myogenin抗体染色阳性。荧光显微镜和流式细胞仪检测发现eGFP基因可在成年大鼠成肌细胞中有效地表达 ,其转染效率约为 12 82 %。结论　利用组织块法成功培养成年大鼠原代成肌细胞 ,该方法实用性强 ,所得成肌细胞纯度高 ;逆转录病毒可介导成肌细胞的基因转导 ,为深入研究心肌梗死瘢痕中转基因成肌细胞自体移植奠定了基础。     

人钠/碘同向转运体基因转染胶质瘤细胞介导放射性碘治疗的研究

目的 在体外细胞实验中证明转染人钠/碘同向转运体(hNIS)基因介导放射性碘治疗胶质瘤是有效的.方法 以脂质体转染法、用重组质粒将hNIS基因转染至人胶质瘤细胞株U251中.经过G418硫酸盐筛选获得稳定表达hNIS的细胞株(hNIS-U251),然后进行体外摄125I实验、NaClO4抑制实验、体外125I外流和内流实验,并绘制时间-放射性曲线.对经3700 MBq/L 131I处理的hNIS-U251细胞进行四甲基偶氮唑蓝(MTY)分析和流式细胞仪测定分析.两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较用单因素方差分析(LSD法).结果 hNIS-U251细胞株可以摄取碘,其摄碘能力较U251细胞提高117倍左右[2种细胞所摄取125I分别为(50 469.88±997.29)和(432.92±89.28)计数·min-1].经131I处理后,hNIS-U251细胞株的细胞增殖活性低于U251细胞株,两者S期细胞比率(SPF)差异有统计学意义(t=35.5,P＜0.001);增殖指数(PI)差异有统计学意义(t=6.33,P＜0.05).结论 131I可以被hNIS-U251细胞摄取,而且可以有效地杀伤胶质瘤细胞.     

流式细胞仪在小鼠造血干细胞基因转移效率测定中的应用

目的探讨流式细胞仪在造血干细胞基因转移效率测定中的应用价值。方法以干细胞因子（ＳＣＦ）、白细胞介素（ＩＬ）３、ＩＬ６单独或联合作用（ＳＣＦ／ＩＬ３、ＳＣＦ／ＩＬ６、ＩＬ３／ＩＬ６、ＳＣＦ／ＩＬ３／ＩＬ６）后的Ｂａｌｂ／ｃ小鼠造血干细胞作为靶细胞,应用含有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因的逆转录病毒载体ＧＣＧＰＸＳＮ介导的基因转移技术实施基因转移,采用ＦＡＣＳ型流式细胞仪测定基因转移效率。结果病毒上清转染的阳性对照组基因转移率为０．０６％,以不同细胞因子作用后基因转移效率提高至００７％～０．２０％,细胞因子作用前后比较,除ＳＣＦ／ＩＬ６组外,差异均有显著或非常显著意义（Ｐ＜００５或Ｐ＜００１）。其中以ＳＣＦ／ＩＬ３组与ＳＣＦ／ＩＬ３／ＩＬ６组的提高最为明显,均达０２０％,与其他各细胞因子组比较,差异也有非常显著意义（Ｐ＜００１）。结论应用流式细胞仪可测定出ＳＣＦ、ＩＬ３、ＩＬ６单独或联合作用对小鼠造血干细胞基因转移效率的不同影响,具有快速、方便、准确的优点。     

An in vitro investigation into the effects of 10 Hz cyclic loading on tenocyte metabolism

Tendinopathy is a prevalent, highly debilitating condition, with poorly defined etiology. A wide range of clinical treatments has been proposed, with systematic reviews largely supporting shock wave therapy or eccentric exercise. Characterizing these treatments have demonstrated both generate perturbations within tendon at a frequency of approximately 8‐12 Hz. Consequently, it is hypothesized that loading in this frequency range initiates increased anabolic tenocyte behavior, promoting tendon repair. The primary aim of this study was to investigate the effects of 10 Hz perturbations on tenocyte metabolism, comparing gene expression in response to a 10 Hz and 1 Hz loading profile. Tenocytes from healthy and tendinopathic human tendons were seeded into 3D collagen gels and subjected to 15 minutes cyclic strain at 10 Hz or 1 Hz. Tenocytes from healthy tendon showed increased expression of all analyzed genes in response to loading, with significantly increased expression of inflammatory and degradative genes with 10 Hz, relative to 1 Hz loading. By contrast, whilst the response of tenocytes from tendinopathy tendon also increased with 10 Hz loading, the overall response profile was more varied and less intense, possibly indicative of an altered healing response. Through inhibition of the pathway, IL1 was shown to be involved in the degradative and catabolic response of cells to high‐frequency loading, abrogating the loading response. This study has demonstrated for the first time that loading at a frequency of 10 Hz may enhance the metabolic response of tenocytes by initiating an immediate degradatory and inflammatory cell response through the IL1 pathway, perhaps as an initial stage of tendon healing.     

二氧化钍及铁矿粉尘体外诱发金黄地鼠胚胎细胞恶性转化的研究

在初步研究了含二氧化钍的稀土混合矿尘体外诱发金黄地鼠胚胎细胞恶性转化之后。作者进一步观察了二氧化钍及铁矿粉尘诱发金黄地鼠胚胎细胞的恶性转化, 并进一步完善了生物学观察指标。实验结果表明, 不仅二氧化钍和铁矿粉尘混合组, 二氧化钍组细胞发生了恶性转化, 而且铁矿粉组细胞也发生了恶性转化。