实时定量PCR检测外周血中的巨细胞病毒

目的建立定量检测外周血中巨细胞病毒的实时定量PCR方法,并对骨髓移植病人进行巨细胞感染监测。方法构建基于LightCycler-TaqMan探针的实时定量PCR方法,对其进行方法学评价,并抽提外周血DNA,检测正常人与骨髓移植病人巨细胞病毒感染状况。结果经反应条件的优化,该方法的敏感性在10个拷贝数以上,批内与批间差异分别控制在较小范围,对骨髓移植病人巨细胞病毒感染的监测发现病毒拷贝数与病程进展和恢复呈较好的相关关系。结论实时定量PCR方法检测巨细胞病毒感染可为临床对移植患者的感染提供一种有效的监测手段。     

Development of a quadriplex polymerase chain reaction for human cytomegalovirus detection

The development of a quadriplex PCR method with amplification of HCMV in a single‐step procedure using primers taken from four different regions of the viral genome is described. Different concentrations of dNTPs and MgCl₂ were assayed in order to optimize the constitution of the buffer for the multiplex PCR. The specificity of the PCR was tested with 100ng, 10ng, and 1ng of genomic MRC‐5 cell DNA infected with CMV in the presence of 10μg of uninfected MRC‐5 cell DNA. The sensitivity of the PCR was evaluated by the amplification of various amounts (100ng, 10ng, 1ng, and 0.1ng) of genomic MRC‐5 cell DNA infected with CMV. The specificity and sensitivity assays were performed for each pair of primers and for the combined four primer pairs in the multiplex PCR. CMV was consistently detected from 10ng of genomic MRC‐5 cell DNA with each primer pair. When all four sets of primers were combined in a single reaction tube, the sensitivity of the assay was equivalent to 10ng of genomic MRC‐5 cell DNA, whereas amplification from 1ng genomic MRC‐5 cell DNA produced only a subset of the amplimers. By amplifying four target‐sequences of HCMV simultaneously with minimum incubation time at each temperature, a quadriplex, highly sensitive PCR assay was performed. The use of four primer sets designed in different genomic regions of HCMV allowed the detection of variants and achieved maximal sensitivity and specificity which are essential for a diagnostic utilization. J. Clin. Lab. Anal. 13:99–105, 1999. © 1999 Wiley‐Liss, Inc.     

FQ-PCR检测造血干细胞移植受者HCMV感染及与淋巴细胞免疫表型变化的关系

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测人巨细胞病毒（HCMV）DNA含量在异基因外周血造血干细胞移植（allo-PBSCT）受者HCMV激活感染中的诊断价值和淋巴细胞免疫表型变化与HCMV激活感染的关系。方法应用FQ-PCR和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测allo-PBSCT后受者HCMV DNA和抗HC-MV lgM抗体;用流式细胞仪测定淋巴细胞亚群。结果39例allo-PBSCT受者中19例检出HCMV DNA（〈30 d的有5例,2-3个月的13例,〉100 d的1例）。HCMV感染后血清HCMV、IgM阳性检出率非常低（4/19）,且出现时间较晚。移植后早期HCMV DNA阳性组与阴性组及健康组比较CD4^＋细胞、CD19^＋细胞及CD4/CD8比值显著下降,CD8^＋细胞和CD16＋56^＋细胞升高。HCMV阳性患者CD4/CD8比值在感染前后比较差异也有统计学意义。结论allo-PBSCT后HCMV活动性感染易发生于allo-PBSCT后早、中期,高峰期在移植后30-60 d;HC-MV活动性感染与细胞免疫功能紊乱互为因果,加重病情。     

FQ-PCR检测造血干细胞移植受者HCMV感染及与淋巴细胞免疫表型变化的关系

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测人巨细胞病毒(HCMV)DNA含量在异基因外周血造血干细胞移植(allo-PBSCT)受者HCMV激活感染中的诊断价值和淋巴细胞免疫表型变化与HCMV激活感染的关系。方法应用FQ-PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测allo-PBSCT后受者HCMV DNA和抗HC-MV lgM抗体;用流式细胞仪测定淋巴细胞亚群。结果39例allo-PBSCT受者中19例检出HCMV DNA(<30 d的有5例,2~3个月的13例,>100 d的1例)。HCMV感染后血清HCMV、IgM阳性检出率非常低(4/19),且出现时间较晚。移植后早期HCMV DNA阳性组与阴性组及健康组比较CD4 细胞、CD19 细胞及CD4/CD8比值显著下降,CD8 细胞和CD16 56 细胞升高。HCMV阳性患者CD4/CD8比值在感染前后比较差异也有统计学意义。结论allo-PBSCT后HCMV活动性感染易发生于allo-PBSCT后早、中期,高峰期在移植后30~60 d;HC-MV活动性感染与细胞免疫功能紊乱互为因果,加重病情。     

实时定量聚合酶链反应检测巨细胞病毒在同种异基因造血干细胞移植术后监测中的意义

目的:探讨同种异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)中巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)激活情况及激活相关因素。方法:52例接受allo-HSCT的患者为研究对象,所有患者及其供者移植前均为CMV携带者,即为CMV血清型阳性。所有移植术后患者应用实时定量聚合酶链反应(PCR)方法对CMVDNA进行定量检测。结果:移植后100d内,52例患者中28例检测到CMVDNA复制。造血干细胞移植(HSCT)供者类型和移植物抗宿主反应(graft versus host disease,GVHD)的发生与CMV激活明显相关(P值分别为0.018和0.039)。在44例可评估患者中,allo-HSCT100d后仅7例检测到CMVDNA复制,其发生率与移植后发生GVHD且接受激素治疗(P=0.0009)、人类白细胞抗原(HLA)全相合无关供者移植或者HLA部分相合同胞供者移植有关(P=0.037)。应用实时定量PCR检测发现,CMV对更昔洛韦抢先治疗的应答存在2种动力学模式(快速型和缓慢型),其中表现为缓慢型的患者CMV最高负载量较快速型高10倍以上,其病毒衰减时间也要延长3～4周,多数发生在因出现GVHD而接受激素治疗以及接受HLA全相合无关供者和HLA部分相合同胞供者干细胞移植的患者。结论:移植前CMV血清型阳性患者接受allo-HSCT后100d内出现CMV激活是常见并发症。移植100d之后,对于未发生GVHD而未使用激素治疗者或以HLA全相合同胞为供体的患者,CMV激活概率低,无需进行常规频繁监测。     

烧伤患者巨细胞病毒复发感染及其对患者预后的评估价值

目的观察烧伤病人巨细胞病毒（humancytomegalovirus,HCMV）复发感染情况及对预后的影响。方法对96例烧伤总体表面积（totalbodysurfacearea,TBSA）〉15％的患者进行动态观察。试验分组：（1）按烧伤面积将患者分为三组：Ⅰ组39例（TBSA15％-49％）,Ⅱ组32例（TBSA50％-69％）,Ⅲ组25例（TBSA70％-99％）;（2）根据脓毒血症诊断标准,将患者进一步分为脓毒症组（33例）和非脓毒症组（63例）;（3）根据脓毒症组患者的预后情况,将其分为死亡组（11例）和生存组（22例）。人院24h内采集患者外周静脉血筛查抗HCMVIgG及HCMV—DNA,而后每隔1周左右采集病人血清标本,采用实时荧光定量PCR方法检测血清中HCMV—DNA水平。结果（1）I组、Ⅱ组和Ⅲ组的HCMV复发感染率分别为53．8％、50．0％和80．0％,Ⅲ组与其他两组之间差异有统计学意义（x^2=6．069,P〈O．05）。（2）三组烧伤患者HCMV首次复发时间及每次复发持续时间差异无统计学意义（P〉0．05）。HC—MV平均首次复发时间为入院后第14天,每次复发持续时间约为12天。（3）脓毒症组HCMV的复发感染率明显高于非脓毒症组（x^2=4．431,P％0．05）,HCMV复发感染率与死亡率不相关（x^2=0．688,P〉0．05）。结论烧伤患者HCMV复发感染率高,HCMV复发感染可能对烧伤后脓毒症的发生具有一定影响。     

浙江省衢州市应用聚合酶链反应检测钩端螺旋体效果评价

目的 建立聚合酶链反应(PCR)检测钩端螺旋体的快速方法,应用于宿主动物钩端螺旋体的快速检测,同时比较PCR方法和常规检测的效果.方法 根据中国疾病预防控制中心提供的引物,以致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、溶藻弧菌、沙门菌、霍乱弧菌、痢疾志贺菌、非O1、O139霍乱弧菌、副溶血性弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7为对照,建立PCR检测钩端螺旋体的快速方法,用于钩端螺旋体的快速检测.结果 衢州市2006年分离钩体菌株进行PCR鉴定结果与血清学鉴定结果相符.100只鼠和100只蛙肝、脾、肾标本进行PCR检测,PCR检测阳性率10%,钩体菌株培养分离率仅为1%,二者差异有统计学意义(2=16.05,P0.005).结论 PCR检测钩端螺旋体灵敏度高、特异性强,可用于钩端螺旋体的快速检测.     

荧光定量PCR法在检测246例小儿巨细胞病毒感染中的应用

目的探讨FQ-PCR在诊断小儿巨细胞病毒感染的临床应用价值。方法分别应用血清抗体检测和荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）的方法对患者进行血液和尿液病毒的检测，并对确诊的患者进行母乳CMV病毒的检测。结果在怀疑为活动性CMV感染的169例患儿中，PCR法的阳性检出率为75．1％，血清IgM法为52．1％，两种方法的阳性符合率为86．4％；18例尿液CMV-DNA阳性的患者查出母亲乳汁中CMV-DNA，含量为1．7×10～4．5×10^3copies／ml。结论FQ-PCR可以准确检测患儿体液及血液中的CMV含量，提示体内复制情况，对于临床的诊断和治疗有一定的指导意义。     

荧光定量PCR检测婴幼儿巨细胞病毒感染情况分析

目的探讨荧光定量PCR(FQ-PCR)方法检测婴幼儿尿液人巨细胞病毒(HCMV)在HCMV感染诊断中的意义。方法采用FQ-PCR检测148例临床疑似HCMV感染婴幼儿尿液中HCMV-DNA水平。同时采用ELISA法检测婴幼儿血清HCMV-IgM抗体。在尿液HCMV-DNA检测阳性患儿中比较血清HCMV-IgM抗体阳性与阴性患儿尿液中HCMV-DNA拷贝数差异。结果 FQ-PCR检测尿液HCMV-DNA的阳性率为35.14%,ELISA检测婴儿血清HCMV-IgM的阳性率为15.54%。两种方法对HCMV感染诊断的阳性率差异有统计学意义(P<0.01)。在尿液HCMV-DNA检测阳性患儿中,IgM抗体阳性组尿液HCMV-DNA拷贝数显著高于阴性组(P<0.01)。结论 FQ-PCR检测尿液HCMV-DNA是早期诊断婴幼儿HCMV感染的敏感有效的方法。     

血清中HBV-DNA的两种定量PCR方法的比较

目的 比较乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)定量测定的两种方法:聚合酶链式反应-酶联免疫吸附测定(PCR-ELISA)法和荧光定量-聚合酶链式反应(FQ-PCR)法。方法 检测了两种方法的灵敏度、批内批间可信度和特异性。结果 PCR-ELISA法和FQ-PCR法在特异性和批内批间可信度方面相似。在85个HBV表面抗原阳性的病人血清中两种方法的检测结果96％保持一致,HBV-DNA血清阳性率分别为84％和80％,其结果取对数后有一定线性关系(r=0.588 9)。PCR-ELISA法的灵敏度比FQ-PCR法高出一个稀释度,PCR-ELISA的最小检测限7.6×10~3拷贝/ml,而FQ-PCR为2.1×10~4拷贝/ml。但FQ-PCR法的技术复杂性要简单得多,分析时间(2 h)比PCR-ELISA(8 h)要短得多。结论 两种方法各有优缺点,每个实验室都应根据各自的需求加以选择。     

实时荧光定量PCR技术在肾移植术后巨细胞病毒性肺炎诊断中的应用

目的探讨实时荧光定量PCR检测巨细胞病毒在肾移植术后肺部感染诊断中的应用价值。方法应用实时荧光定量PCR检测2002年1月至2006年1月在本院行肾移植术后肺部感染患者39例,健康自愿者50人的血清CMV DNA载量,应用SPSS10 0软件对检测结果进行统计学分析。结果肺部感染患者组39份样本中,19份可以检测到数值(阳性率为49%),其病毒拷贝数值介于1.05×103~4.26×105之间,平均为2.23×104;对照组中仅一份检测到数值(阳性率为2%),且CMV DNA小于104,其余49份均低于检测下限,实时荧光定量PCR检测CMV结果对病情发展有预测价值。结论实时荧光定量PCR技术为肾移植术后巨细胞病毒性肺炎的早期诊断提供了有效的试验手段,从而大大提高了肾移植术后巨细胞病毒性肺炎的治愈率。     

标本扩增效率的计算及其对HBV DNA定量结果的影响

目的建立分析标本扩增效率的方法，分析其对HBV DNA定量结果的影响。方法应用分析软件提供的样点拟合法及对数荧光一循环数坐标图，计算得到Ct，HBV DNA拷贝数以及每一标本的扩增效率。分析40个HBV DNA拷贝数在10^4-10^8／ml的标本的扩增效率，井用得到的标本实际扩增效率加以校正。结果4个标准的扩增效率分别为0．80，0．80，0．84和0．85。标本的扩增效率在0．59—0．85之问，其中30份（75％）在0．7—0．85之间，8份（20％）在0．65，0．70之问，其余2份在0．65以下。部分校正后的HBV DNA定量结果比校正前高一个数量级。结论标本与标准的扩增效率不一定相同，标本扩增效率的降低导致标准曲线定量结果偏低，有必要用标本的实际扩增效率对结果进行校正。     

巨细胞病毒定量PCR与pp65抗原测定监测异基因造血干细胞移植巨细胞病毒感染的比较

本研究比较巨细胞病毒（CMV）定量PCR检测和CMV—pp65抗原检测在异基因造血干细胞移植CMV感染中的诊断价值。以84例异基因造血干细胞移植患者为研究对象,自预处理开始每周对患者EDTA抗凝外周血血标本进行CMV—pp65抗原及cMV定量PCR动态检测,直至出院,比较观察两者在诊断CMV感染中的作用。结果表明：84例移植患者的732份系列血标本中,26例移植后检出CMV定量PCR阳性,检出率30．95％,其中9例为cMV血症,13例为cMV病,检出中位时间为37．1（7—105）天;22例CMVpp65抗原检测阳性,检出率26．19％,检出中位时间为46．6（10—128）天;所有CMV—pp65抗原检测阳性患者CMV定量PCR均为阳性,4例CMV定量PCR阳性但CMV—pp65抗原检测阴性患者均未发展为CMV病。CMV病多出现于CMV定量PCR中等至高拷贝数或中等至高水平病毒血症（CMV—pp65抗原）病例中。治疗后CMV定量PCR转阴中位时间为17．5（11—28）天。CMV—pp65抗原转阴中位时间为10．0（7—21）天。结论：CMV定量PCR和CMV—pv65抗原检测均能作为异基因造血干细胞移植CMV感染早期诊断的有效手段,CMV定量PCR更敏感,CMV—pp65抗原检测更特异,两者同时使用能更有效地提高CMV感染诊断水平,监控其发生发展。     

2项对诊断儿童人巨细胞病毒活动性感染的比较

目的比较血清人巨细胞病毒(HCMV)-IgM抗体(以下简称IgM抗体)与HCMV pp65抗原(以下简称pp65)两种方法对HCMV活动性感染诊断检测的实用意义。方法采集临床疑似HMCV活动性感染儿童血标本91份,分离血浆和多形白细胞,分别用于IgM抗体检测和pp65抗原检测,同时用聚合酶链反应(PCR)检测HCMV DNA,与pp65抗原作平行比较。结果 pp65抗原检测的结果与IgM抗体检测的符合率为70.3%,与HC-MV DNA检测相比,pp65抗原检测的符合率、特异性和敏感度分别为85.5%、70.6%和75.6%,而且高pp65抗原血症与患者临床症状密切相关。结论 pp65抗原血症反映该病毒活动状况,可监测HCMV活动性感染。     

不同标本巨细胞病毒检测在诊断小儿人巨细胞病毒感染中的应用

目的：探讨尿液、淋巴细胞和母乳的 HCMV-DNA 检测以及血清 HCMV-IgM 检测在小儿人巨细胞病毒（HCMV）感染诊断中的意义。方法用实时荧光定量 PCR检测189例疑似HCMV感染患儿尿液、淋巴细胞和母乳的HCMV-DNA ,用化学发光法检测其血清HCMV-IgM ,并分年龄分性别对其阳性率进行分析比较。结果新生儿组母乳HCMV-DNA阳性检出率（60.3％）显著高于尿液（5.2％, P〈0.001）和淋巴细胞（12.1％,P〈0.001）,也显著高于血清 HCMV-IgM 阳性率（3.4％,P〈0.001）;婴儿组母乳（48.1％）与尿液（55.0％）HCMV-DNA 阳性率差异无统计学意义（P〉0.05）,但两者均显著高于淋巴细胞 HCMV-DNA 阳性率（22.1％, P〈0.001）和血清 HCMV-IgM 阳性率（24.4％, P〈0.001）;婴儿组的尿液 HCMV-DNA、血清 HCMV-IgM 阳性率均显著高于新生儿组（ P〈0.01）;两组各指标男女阳性率差异均无统计学意义（ P〉0.05）;母乳 HCMV-DNA 阳性率与尿液、淋巴细胞 HCMV-DNA 阳性率及血清 HCMV-IgM 阳性率均呈显著正相关（r ＝0.630,P ＝0.000;r ＝0.413,P ＝0.000;r ＝0.341,P ＝0.000）。结论联合尿液、淋巴细胞HCMV-DNA 和血清HCMV-IgM 检测有助于患儿HCMV 感染的辅助诊断;在无法联合检测的条件下,婴儿首选尿液 HCMV-DNA 检测可获得较高检出率;母乳 HCMV-DNA检测并正确喂养有助于预防HCMV感染。     

母乳及婴儿血液、尿液人巨细胞病毒DNA检测在婴儿HCMV感染中的应用

目的探讨荧光定量PCR（FQ-PCR）技术检测巨细胞病毒（HCMV）DNA在诊断孕妇及婴幼儿感染的价值。方法采用FQ-PCR技术检测106例母乳喂养的疑似HCMV感染患儿尿液、血液、配对母乳中HMCV-DNA的水平。结果患儿尿液、血液阳性率分别为57.55%、44.34%,两者比较有显著差异（P〈0.05）。尿检阳性患儿配对母乳的阳性率为88.5%,尿检阴性患儿配对母乳的阳性率为31.1%,两者比较差异有统计学意义（P〈0.05）。血检患儿阳性的配对母乳阳性率为76.6%,血检阴性患儿配对母乳阳性率为54.2%,两者比较具有显著差异（P〈0.05）。结论 HCMV感染母乳可能是婴儿感染HCMV的主要途径之一[1],FQ-PCR的推广应用对快速检测HCMV感染有着重要意义。     

荧光定量PCR在乙型肝炎患者检测中的临床应用

目的　探讨荧光定量 PCR( fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)定量检测血清HBV-DNA的临床应用价值。方法　采用 FQ-PCR和 ELISA法检测 1 76例乙型肝炎患者血清 HBV DNA含量和 HBV血清学标志物 ,并进行比较分析。结果　 HBs Ag、HBe Ag和抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBe、抗 -HBc三项阳性 ,HBs Ag、HBe Ag两项阳性 ,HBs Ag、抗 -HBc阳性的样品中 ,HBV DNA阳性率分别为 95 .1 %、83 .3 %、1 0 0 .0 %、81 .8% ,DNA拷贝数/ml分别为 2 .2 9× 1 0 7、1 .2 3× 1 0 6 、8.5 1× 1 0 6 、6.61× 1 0 5,其中以抗 -HBc-Ig M阳性组 DNA拷贝数为最高。结论　 FQ-PCR法检测 HBV DNA具有灵敏度高、结果可靠的优点 ,可检测 HBV感染和复制状态 ,对于乙肝的早期诊断、传染性判断和疗效考核具有重要的指导意义。     

Real-time PCR-based testing of saliva for cytomegalovirus at birth

Evaluation of: Boppana SB, Ross SA, Shimamura M et al. Saliva polymerase-chain-reaction assay for cytomegalovirus screening in newborns. N. Engl. J. Med. 364, 2111–2118 (2011).

Cytomegalovirus (CMV) commonly causes congenital infection. As such, CMV is a prominent etiology for nongenetic sensori-neural hearing loss. However, screening examination in the perinatal and early infant period fails to identify most children at risk for CMV-produced hearing loss because of the absence of symptoms early in life. Furthermore, generalized screening for congenital CMV infection has yet to be implemented. Currently, newborns are tested via means of a rapid saliva culture but large-scale automation of this test would be difficult. Fortunately, newer potential replacement tests have been created. An important advance includes testing newborns via means of PCR using liquid or dried saliva samples. In a large-scale, prospective, multi-institutional study both types of salivary samples were compared with the gold standard of saliva culture. Of the 34,989 neonates tested, 0.5% or 177 samples tested positive for CMV. Testing of both liquid and dried saliva were sensitive (>97%) as well as specific (>98%) when measured against CMV culture. PCR testing of dried saliva has the potential benefit of adapting to generalized screening of neonates for congenital CMV infection. The advantages of early detection, intervention for and treatment of cases that are not clinically apparent needs to be carefully evaluated before proposing universal newborn screening for CMV infection as a valuable public health strategy.     

婴儿肝炎综合征中人类巨细胞病毒感染检测方法的比较

目的：探讨婴儿肝炎综合征中人类巨细胞病毒(HCMV)感染的检测方法。方法：用HCMV pp65抗原血症法及荧光定量聚会酶链反应(FQ-PCR)法检测24例患儿34份血浆及多形核白细胞(PMNLs)标本。结果：HCMV pp65抗原血症法诊断巨细胞病毒感染所致婴儿肝炎综合征的特异度为100％，灵敏度为90％；FQ-PCR法检测PNNLs的特异度为100％，灵敏度为60％；血浆FQ-PCR法的特异度为100％，灵敏度为50％。同一份血标本其血浆中的HCMVDNA拷贝数低于PMNLs，使得血浆FQ-PCR法在HCMV诊断及疗效观察方面具有滞后现象。动态观察发现HCMV pp65抗原血症法与FQ-PCR法检测的PMNLs结果与婴儿肝炎综合征患儿的治疗过程有较好的符合率。结论：HCMV pp65抗原阳性与HCMV活动性感染密切相关，可作为婴儿肝炎综合征患儿疗效的观察指标。HCMV pp65抗原血症法与FQ-PCR法可作为临床诊断HCMV症状性感染的一种快速、有效的实验室方法。     

荧光定量聚合酶链反应检测移植受者的巨细胞病毒DNA载量

目的评价实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测移植后受者的巨细胞病毒感染情况。方法应用定性PCR检测59例骨髓移植受者和9例肝移植受者的150份外周血标本中的巨细胞病毒DNA,比较外周血白细胞和血浆的检出差异;应用实时荧光定量PCR检测上述150份血浆样本和54份对照血浆中巨细胞病毒DNA载量。结果以实时荧光定量PCR为参照,定性PCR检测白细胞的敏感度和特异度分别为62·5%和95·5%;检测血浆的敏感度和特异度分别为57·5%和99·1%。所检测的150份血浆样本中,定量PCR阳性率为26·7%,阳性者其病毒拷贝数介于5·065×102~3·570×105/ml之间;对照组仅1例阳性,且拷贝数小于103/ml。临床调查显示病毒拷贝数大于5×103的患者具有较高的机会发展为巨细胞病毒病。结论实时荧光定量PCR是一个快速、敏感、特异的,可用于监测移植后患者巨细胞病毒感染的方法,帮助临床及早治疗,缩短治疗时间。