HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验研究

目的 :建立HBV阳性血清体外感染HepG2细胞的实验方法 .方法 :培养HepG2细胞传至 6孔板中 1 2h后 ,加2 0mL·L-1 DMSO继续孵育 1 2h .而后进行HBV阳性血清体外感染HepG2的实验 .感染组用HBV阳性血清 ,阴性对照组用HBV阴性血清 ,空白对照组用DMEM培养基 .实验开始后HepG2细胞在 2 0mL·L-1 DMSO的浓度下继续孵育 2 4h ,而后用PBS清洗 ,洗 8次 ,PBS洗后每隔 1 2h收集一次细胞培养上清 .ELISA检测细胞培养上清中的HBsAg.PCR检测细胞培养上清和HepG2细胞中的HBVDNA .结果 :HBV阳性血清感染组 ,在PBS洗后 1 2h的细胞培养上清中ELISA检测到HBsAg阳性 (A =0 .8) .PCR检测显示HBV阳性血清感染组细胞培养上清和HepG2细胞中HBVDNA阳性 ,阴性对照组和空白对照组HBVDNA阴性 .结论 :在一定条件下用HBV阳性血清进行HBV感染体外培养的HepG2细胞是可行的     

HBV前C／C基因EB病毒载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的 研究HBV前C/C区基因变异的生物学意义。方法 构建HBV前C/C区基因EB病毒表达载体,采用脂质体介导方法将重组质粒转染到HepG2细胞,并表达HBeAg。结果 重组质粒经PCR和酶切鉴定均阳性,转染的细胞目的DNA和表达蛋白检测均阳性。结论 采用EB病毒载体构建HBV前C/C基因的表达载体。能在HepG2细胞中稳定表达目的蛋白,由于EB病毒载体以附着体的形式复制,不整合于缩主染色体基因中,拷贝数稳定,适合于体外研究HBVC/C基因变异的生物学意义。     

医用臭氧对肝癌细胞HepG2生物学行为的实验研究

目的探讨使用医用臭氧(O3)在体外对肝癌HepG2细胞的作用。方法获取人肝癌HepG2细胞在体外增殖、传代、对数生长期的细胞,将细胞分为对照组和实验组,实验组采用含浓度为0.5μg/ml的医用臭氧水的培养液处理细胞,对比两组试验的细胞形态学变化,细胞生长曲线、细胞凋亡情况、细胞迁移能力变化。结果体外实验结果显示,含臭氧的培养基中细胞数量明显减少,肿瘤细胞膜破裂,核固缩甚至裂解,臭氧对细胞的生长有抑制作用,同时CCK-8的检测结果显示O3能抑制肝癌细胞的增殖(P<0.01),Transwell迁移实验显示O3能抑制肿瘤细胞的迁移(P<0.01)。结论臭氧能直接杀死肝癌HepG2细胞,能在体外抑制肝癌HepG2细胞的增殖和迁移。     

HBV感染胎盘滋养细胞的体外研究

目的：对早孕绒毛的滋养细胞进行原代培养,利用HBV感染血清对滋养细胞进行体外感染,探讨细胞在体外培养条件下对HBV的感染率及HBV在细胞中的复制状态．方法：利用胰蛋白酶和胶原酶联合消化培养法原代培养早孕胎盘中的滋养细胞,并进行免疫组化鉴定,获得纯度较高的滋养细胞后进行体外的HBV感染,通过细胞免疫化学染色、ELISA及PCR法分别检测细胞上清中的HBsAg,细胞中的HBVDNA及cccDNA．结果：原代培养的滋养细胞,细胞生长良好,特异性角蛋白一7阳性,纯度高．原代滋养细胞在与HBV阳性血清共同孵育后均未出现明显的细胞病变,感染后24h和48h在滋养层细胞细胞浆中可见HBsAg的阳性表达,被感染细胞呈散在分布．感染后48h起可检测到弱阳性的HBsAg及HBVDNA,感染后细胞内未检测出cccDNA．结论：利用联合酶消化法建立了胎盘中滋养细胞的体外培养系统．HBV能够在体外感染原代培养的滋养细胞,对被感染细胞的生长无明显影响．HBV可能不在滋养细胞中复制．     

乙型肝炎病毒对HepG2细胞表达TLR3的影响

目的 乙肝病毒全基因组体外扩增,构建质粒并测序,酶切后瞬时转染HePG2细胞,观察对HBV抗原分泌,病原识别受体Toll样受体3(TLR3)的表达及细胞增殖的影响.方法 长片段PCR法扩增HBV DNA全长,构建pBlueScript-HBV质粒并转化宿主菌,摇菌后提取质粒经测序,用Sap Ⅰ酶切,获得HBV 3.2 kb基因组,采用脂质体瞬时转染HepG2细胞株,IMX检测HBV所分泌抗原,台盼蓝计数检测细胞增殖活性,直接免疫荧光流式细胞术(FCM)检测表达TLR3的阳性细胞百分率,并与空白对照组对比.结果 HBsAg和HBeAg的分泌随着转染HBV DNA量的增加而升高,除4 μg和6 μg组两组间比较的表面抗原外,差异均有显著性(P＜0.05).TLR3在转染后均有上调,除4 μg与6 μg组间比较外,各组间差异有显著性(P＜0.05).台盼蓝拒染法示细胞存活随转染剂量的升高而减少(P＜0.05),但4 μg和6 μg两组间比较差异无显著意义(P＞0.05).而各转染剂量组HBsAg和e抗原的分泌及细胞的存活数均与TLR3的表达呈显著正相关(P＜0.01).结论 本研究初步表明乙肝病毒可能直接引起HepG2细胞TLR3的上调,而且上调可能启动了细胞的凋亡或坏死机制,成为HBV损伤细胞的非免疫细胞介导机制.     

乙型肝炎病毒核壳蛋白对HepG2细胞凋亡的影响

目的初步探讨乙型肝炎病毒野生型核壳蛋白和L60V、I97L变异核壳蛋白影响HepG2细胞凋亡的分子机制。方法将构建的野生型核壳蛋白融合表达载体(pEGFP-WT),L60V变异核壳蛋白(pEGFP-V60)和I97L变异核壳蛋白(pEGFP-L97)表达载体HepG2阳性细胞株复苏培养;Western blot检测各核壳蛋白表达;TNF-α、Act-D诱导各种HepG2细胞株凋亡,48h采用流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测NF-κB信号传导通路中IKK-α、IκB-α、NF-κBP65蛋白表达与caspase-8、caspase-3蛋白表达情况。结果Western blot检测pEGFP-WT组、pEGFP-V60组和pEGFP-L97组核壳蛋白表达基本相同;流式细胞术检测显示,与pEGFP-C1细胞株相比,48h时pEGFP-WT、pEGFP-V60和pEGFP-L97表达细胞株的细胞凋亡率均明显偏低(P<0.01);4组细胞株IKK-α、IκB-α、NF-κBP65蛋白表达水平无明显差异,而pEGFP-WT组caspase-8、caspase-3蛋白表达水平明显低于pEGFP-V60和...     

HIV合并HBV感染的抗病毒治疗进展

人类免疫缺陷病毒(HIV)与乙型肝炎病毒(HBV)有着相似的传播途径,HIV合并HBV感染情况比较常见,这些混合感染,增加了治疗的难度。当HBV感染需要治疗而HIV感染不需要时,应考虑选用对HIV无作用的药物,如干扰素(IFN)或阿德福韦(ADV);当HIV和HBV同时符合治疗标准时,首选包括TDF+LAM或TDF+FTC的HAART方案,如果上述HAART基础上仍出现LAM或FTC耐药,可以加用ETV或ADV挽救治疗。对HIV/HBV合并感染患者而言,不需要HAART时不建议应用ETV、LDT抗HBV治疗。     

墓头回提取物对HepG2细胞作用的初步研究

目的研究墓头回提取物体外对HepG2细胞毒作用，探讨其抑癌作用机理。方法用MTF法检测墓头回提取物对HepG2细胞毒作用；透射电镜观察细胞超微结构变化；流式细胞仪P1染色观察墓头回对HepG2细胞的促凋亡活性。结果墓头回提取物对HepG2细胞增殖具有明显的抑制作用；流式细胞仪结果显示，实验组细胞凋亡率明显高于对照组；透射电镜观察可见细胞体积缩小，微绒毛减少或消失，核固缩，核染色质浓缩边集。结论墓头回提取物对HepG2细胞具有良好的抗肿瘤活性，其作用机制与诱导细胞凋亡有关。     

乙型肝炎病毒197L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响

目的研究197L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响。方法构建EGFP-野毒株核壳蛋白、197L变异核壳蛋白融合表达载体（pEGFP—WT和pEGFP—L97）,酶切和测序鉴定;将pEGFP—WT、pEGFP—L97和对照质粒分别转染HepG2细胞．筛选阳性细胞株;荧光显微镜观察阳性克隆细胞荧光蛋白表达,Western—blot检测核壳蛋白表达：以TNF-α、Act-D诱导HepG2细胞株凋亡,0、16、32和48h采用流式细胞术检测细胞凋亡,32h时采用共聚焦检测细胞凋亡比例。结果成功建立了融合表达蛋白表达载体;荧光显微镜显示各细胞克隆有较好的荧光蛋白表达,Western-blot检测各细胞系核壳蛋白表达没有差异;16、32、48h时,pEGFP-WT、pEGFP-L97表达细胞株凋亡率均明显低于pEGFP-C1细胞株（P〈0．05）;32h和48h时,pEGFP-L97细胞株凋亡率明显高于pEGFP-WT细胞株（P〈0．05）;32h时激光共聚焦检测结果与流式细胞术检测结果一致。结论乙型肝炎病毒197L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响与野毒株核壳蛋白不同,与野毒株核壳蛋白相比,197L变异核壳蛋白对凋亡因素可能更敏感。     

乙型肝炎病毒I97L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响

目的研究I97L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响。方法构建EGFP-野毒株核壳蛋白、I97L变异核壳蛋白融合表达载体(pEGFP-WT和pEGFP-L97),酶切和测序鉴定;将pEGFP-WT、pEGFP-L97和对照质粒分别转染HepG2细胞,筛选阳性细胞株;荧光显微镜观察阳性克隆细胞荧光蛋白表达,Western-blot检测核壳蛋白表达;以TNF-α、Act-D诱导HepG2细胞株凋亡,0、16、32和48h采用流式细胞术检测细胞凋亡,32h时采用共聚焦检测细胞凋亡比例。结果成功建立了融合表达蛋白表达载体;荧光显微镜显示各细胞克隆有较好的荧光蛋白表达,Western-blot检测各细胞系核壳蛋白表达没有差异;16、32、48h时,pEGFP-WT、pEGFP-L97表达细胞株凋亡率均明显低于pEGFP-C1细胞株(P<0.05);32h和48h时,pEGFP-L97细胞株凋亡率明显高于pEGFP-WT细胞株(P<0.05);32h时激光共聚焦检测结果与流式细胞术检测结果一致。结论乙型肝炎病毒I97L变异核壳蛋白对诱导HepG2细胞凋亡的影响与野毒株核壳蛋白不同,与野毒株核壳蛋白相比,I97L变异核壳蛋白对凋亡因素可能更敏感。     

胺碘酮对人肝癌HepG2细胞增殖的影响及其临床意义

目的:研究胺碘酮在体外对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响及细胞周期分布的特点,并探讨其可能的作用机制。方法:应用噻唑蓝比色法(MTT)法检测经不同浓度的胺碘酮或5-氟尿嘧啶(5-Fu)作用后,HepG2细胞的吸光度值(A)、增殖抑制率,并应用PI单染流式细胞检测技术测定HepG2细胞周期分布的特点,总结胺碘酮对HepG2细胞增殖及细胞周期分布的影响。结果:HepG2细胞经胺碘酮(浓度0.5-4.5 mg/L)作用48 h后,细胞逐渐变小、折光率减弱,漂浮细胞逐渐增多,细胞生长受到明显抑制,并呈现明显的剂量依赖效应关系和时间依赖效应关系。在抑制率及细胞周期分布特点参数上,胺碘酮组与空白对照组相比有显著的统计学差异(P<0.01),而与5-Fu干预组相比,二者之间无统计学差异(P>0.05)。同时胺碘酮使细胞周期分布发生明显变化,表现为S期细胞比例下降,G0/G1期和G2/M期细胞比例上升;与5-Fu干预组呈现出相似的趋势。结论:胺碘酮能抑制肝癌HepG2细胞的增殖,并呈现出明显的剂量和时间依赖效应关系。胺碘酮可望为肝癌的新的辅助化疗特别是合并心律失常的肝癌患者的化疗提供新的思路。     

维拉帕米对肝癌细胞株HepG2细胞增殖及迁移的影响

目的 探讨钙离子通道阻滞剂维拉帕米(VR)对人肝痛细胞株HepG2细胞增殖、DNA合成及细胞迁移的影响.方法 在HepG2细胞培养液中加入不同浓度的VR(0、1、5、10、1 5、20 μg/mL),采用甲基四唑蓝(MTT)法测定VR对HepG2细胞增殖的影响;5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'...     

Recombinant Adenovirus with Human IDO and HBV preS was Constructed and Expressed in HepG2 cell

BACKGROUNDS. Indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO) is proven to suppress HBV specific immune response and depletion of IDO may be a useful approach for HBV therapy. To test this concept, we constructed recombinant adenovirus with human IDO and HBV preS, which would form the basis for future in vivo experiments. METHODS The fragment of human IDO and HBVpreS cDNA were subcloned into multiple cloning sites in an adenoviral vector system containing two CMV promoters. Recombination was conducted in the Escherichia coli BJ5183. The recombinant adenovirus containing hIDO gene and HBVpreS genes was packaged and amplified in 293T cells. Integration was confirmed by PCR analysis as well as the quantification of viral titers. HepG2 cells were infected with the recombinant adenovirus and mRNA and protein specific for hIDO and HBVpreS was detected by RT- PCR and Western blot respectively. RESULTS The recombinant adenovirus was produced successfully. Its titer was 2.5×109 efu/ml. IDO and HBVpreS mRNA as well as the encoded proteins could be found in transfected HepG2 cells, but not in control HepG2 cells. CONCLUSIONS The transfer of hIDO-HBVpreS with double-promoter adenoviral vector was efficient. The recombinant adenovirus with human IDO and HBV preS would provide the experimental basis for future studies.     

APOBEC3G真核表达载体的构建及其对HBV复制表达的影响

目的:构建APOBEC3G真核表达载体,在体外初步探讨APOBEC3G对HBV复制表达的影响。方法:应用RT-PCR法从人PBMC细胞中扩增APOBEC3G基因,分子克隆法构建表达APOBEC3G蛋白的真核表达载体pcDNA3.1-APOBEC3G,并脂质体法转染HepG22.2.15细胞。Western-blot鉴定细胞中APOBEC3G蛋白的表达。ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg水平,实时定量PCR检测HBVDNA和HBV mRNA水平。结果:经酶切鉴定及测序证实APOBEC3G真核表达载体被成功构建,APOBEC3G蛋白可在HepG22.2.15细胞中表达。转染APOBEC3G重组质粒的HepG22.2.15细胞的HBsAg、HBeAg、HBVDNA及HBV mRNA水平均明显低于未转染重组质粒的HepG22.2.15细胞。结论:APOBEC3G明显抑制了HepG22.2.15细胞中HBV的复制与表达,成功构建APOBEC3G真核表达载体,为深入研究APOBEC3G抗HBV的作用机制奠定实验基础。     

田基黄不同提取部位对人肝癌细胞HepG2生长的抑制作用

目的 探讨田基黄不同提取部位对人肝癌细胞HepG2生长的抑制作用.方法 田基黄以不同极性的有机溶剂进行较系统的分级萃取得到不同的提取部位.体外培养人肝癌细胞HepG2细胞株,用倒王相差显微镜观察细胞在田基黄不同提取部位的作用后在形态学变化,用MTT法检测在不同的作用时间下,不同提取部位对人肝癌细胞HepG2生长的抑制作用,计算细胞存活率.结果 一定浓度的石油醚提取部位,二氯甲烷提取部位,乙酸乙酯提取部位,正丁醇提取部位均会抑制肝癌细胞H叩G2的生长,且呈剂量依赖性.结论 四种田基黄提取部位能有效的抑制人肝癌细胞HepG2的生长.     

HBV X蛋白对HepG2细胞凋亡的影响

目的:初步探讨HBV X蛋白表达对转染X基因HepG2细胞的影响。方法:磷酸钙沉淀法转染真核表达质粒pCDNA3.1(+)/x到人肝癌细胞株HepG2;72 h后,Western-blot检测X蛋白表达;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率;MTT法测定细胞活力。结果:磷酸钙沉淀法能有效的导入X基因且Western-blot能检测到X蛋白表达;MTT法、流式细胞术结果显示X蛋白表达组细胞活力受抑制(P<0.01),凋亡率增加(P<0.01)。结论:HBV感染及其相关慢性肝病中,X蛋白的表达可能与肝细胞凋亡,炎症活性相关。     

蜂房提取物体外抗人肝癌细胞株HepG2细胞作用的实验研究

目的观察不同蜂房提取物体外抗HepG2细胞的作用。方法用不同溶剂从蜂房中提取有效成分(A～G样品),通过3H-TdR渗入法观察各提取物体外对HepG2细胞的抑制作用,确定抑瘤效果最好的蜂房提取物。结果各蜂房提取物对HepG2细胞均有很好的抑制作用,其中蜂房醇浸石油醚提取物(F样品)与蜂房醇浸乙酸乙酯提取物(G样品)的抑制作用最明显,抑制率分别为38.6%～99.6%、21.4%～98.7%,并且具有较好的量效关系。结论蜂房提取物体外具有较强的抗肿瘤作用。     

古抑菌素A对人肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的 探讨去乙酰化转移酶抑制剂古抑菌素A(TSA)对人肝癌细胞株HepG2增殖及凋亡的影响.方法 体外培养人肝癌细胞株HepG2,以不同浓度的TSA(5、50、250、500、1 000、2 000 nmol/L)处理24 h后在倒置显微镜和透射电镜下观察HepG2形态的变化,用CCK-8法检测细胞增殖活性.用TUNEL法检测对照组(加等量DMSO)和500 nmol/L TSA组的细胞凋亡率,用免疫细胞化学法检测两组增殖凋亡调控相关基因caspase-3、bax和bcl-2的蛋白表达.结果 倒置显微镜下,经TSA处理的细胞增殖速度显著减慢;透射电镜下,HepG2出现凋亡早期改变.CCK-8法测定结果显示,对照组和不同浓度TSA(5、50、250、500、1 000、2 000 nmol/L)组HepG2的增殖活性分别为(0.637±0.032)、(0.552±0.016)、(0.499±0.031)、(0.393±0.007)、(0.321±0.026)、(0.277±0.010)和(0.275±0.015),组间比较差异有统计学意义(P＜0.01);且不同浓度的TSA对HepG2的增殖抑制作用有明显的剂量依赖关系.500 nmol/L TSA组细胞凋亡率显著高于对照组,且其凋亡相关蛋白caspase-3和bax的表达较对照组显著增强,差异有统计学意义(P＜0.05);而两组bcl-2的蛋白表达间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TSA可通过增加caspase-3、bax的蛋白表达,诱导细胞凋亡而对人肝癌细胞株HepG2具有增殖抑制作用.     

HBV对肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15中MMP-2及MMP-9的表达影响

目的研究基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9在肝细胞癌(HCC)细胞系HepG2和HepG2.2.15中的表达情况,探讨乙型肝炎病毒(HBV)对肝癌细胞系(HepG2,HepG2.2.15)中MMP-2、MMP-9表达的影响及其与癌细胞侵袭转移之间的关系。方法用明胶酶谱法检测HepG2细胞和稳定转染了HBV质粒的HepG2.2.15细胞中MMP-2和MMP-9的表达情况,观察两种细胞的某些生物学活性,用细胞生长曲线检测两者的生长速度。结果明胶酶谱法检测HepG2细胞中MMP-9的表达水平高于HepG2.2.15细胞(P<0.05),而两者MMP-2的表达差异不显著(P>0.05)。细胞生长曲线显示HepG2细胞的生长速度快于HepG2.2.15细胞。结论通过体外鉴定肝细胞癌细胞系HepG2细胞和HepG2.2.15细胞生长状态的差异,揭示了HBV的细胞内感染过程中HBV对肝细胞癌的生长具有一定的影响。HBV可影响明胶酶MMP-2和MMP-9的分泌及活性,进而对肿瘤的侵袭转移产生一定的影响。