10-23 脱氧核酶的生物催化功能研究进展

10-23脱氧核酶是利用体外筛选技术得到的一种具有催化功能的单链DNA片段,具有高效的催化活性及特异的序列识别能力,能催化RNA特定部位的切割反应,从mRNA水平上抑制基因表达,具有潜在的治疗应用价值。     

10-23脱氧核酶对新生大鼠心肌细胞ET-1mRNA表达的影响

目的:将体外筛选具有切割内皮素-1(endothelin-1,ET-1)mRNA的10-23脱氧核酶转染原代培养新生大鼠心肌细胞,观察其对心肌细胞ET-1 mRNA的影响.方法:体外转录ET-1全长RNA底物,设计并合成5条ET-1 10-23脱氧核酶(DZ1～DZ5),其5‘及3‘端各有2个核苷酸硫代修饰,体外切割ET-1 RNA底物,筛选有效脱氧核酶;5‘标记荧光素FAM的10-23脱氧核酶瞬间转染新生大鼠心肌细胞以观察对10-23脱氧核酶的摄取;采用半定量RT-PCR检测ET-1基因的表达.结果:DZ2、DZ3、DZ4及DZ5在体外均可切割RNA底物,其中DZ4两侧结合区结合自由能之差最大,其切割效率最高,达83.5%,而DZ3两侧结合区结合自由能之差最小,其切割效率亦最低(47.3%);瞬间转染新生大鼠心肌细胞24h,心肌细胞内可见10-23脱氧核酶的分布,半定量RT-PCR结果显示转染24h后的DZ4(0.2μmol/L)可减少血清诱导肥大心肌细胞ET-1mRNA及细胞总蛋白,降低细胞活力与蛋白质合成速率(P＜0.05).结论:本研究设计的10-23脱氧核酶能切割体外转录的ET-1全长RNA底物,转染心肌细胞后,可抑制ET-1 mRNA的表达,减缓血清诱导心肌细胞肥大,10-23脱氧核酶两侧结合区自由能的差值与切割效率有关.     

针对Egr-1mRNA的10-23脱氧核酶抑制大鼠动脉损伤后内膜增生的研究

目的探讨针对Egr-1mRNA的10-23脱氧核酶对大鼠动脉损伤后内膜增生的影响和可能的机制。方法制备大鼠颈动脉球囊损伤模型,96只大鼠随机分为4组,A组为假手术组;B组为1mmol/LMgCl2对照组;C组为FuGENE6对照组;D组为FuGENE6介导的ED5转染组;每组再按术后3,7,14和21d,分为4个亚组,每组6只。术后3、7、14、21d各处死每组动物6只,分别应用RT-PCR和Western-blot技术检测血管组织Egr-1mRNA水平及蛋白合成情况;HE染色观察损伤血管内膜的增生情况;免疫组织化学染色观察PCNA的表达。结果与B组和C组比较,D组各时间点血管内膜、中膜的厚度和管腔的狭窄率均显著减小(P<0.01);正常血管组织有微量Egr-1表达,术后Egr-1mRNA和蛋白水平逐渐增高,而D组血管组织E-gr-1mRNA和蛋白水平较B组和C组均降低(P<0.01);免疫组织化学染色显示,术后3dPCNA表达开始增加,7d达高峰,14d开始下降,D组血管壁PCNA阳性细胞百分比明显低于B组和C组(P<0.01)。B组和C组之间相比较,以上各指标差异均无显著性(P>0.05)。结论ED5可能通过抑制Egr-1和PCNA的表达,而减轻血管损伤后内膜增生。     

10-23脱氧核酶及其应用进展

1023脱氧核酶是近年来利用体外分子进化技术筛选得到的一种具有催化功能的单链DNA片段,具有高效的催化活性及特异的序列识别能力,能催化RNA特定部位的切割反应,从mRNA水平上抑制基因表达,从而调控相应蛋白的表达,可能成为治疗肿瘤、病毒感染等疾病的新型工具。     

针对Egr-1mRNA的10—23脱氧核酶抑制大鼠动脉损伤后内膜增生的研究书

目的 探讨针对Egr-1mRNA的10—23脱氧核酶对大鼠动脉损伤后内膜增生的影响和可能的机制。方法 制备大鼠颈动脉球囊损伤模型，96只大鼠随机分为4组。A组为假手术组；B组为1mmol／L MgCl：对照组；C组为FuGENE6对照组；D组为FuGENE6介导的ED5转染组；每组再按术后3，7，14和21d。分为4个亚组，每组6只。术后3、7、14、21d各处死每组动物6只，分别应用RT-PCR和Western—blot技术检测血管组织Egr-1mRNA水平及蛋白合成情况；HE染色观察损伤血管内膜的增生情况；免疫组织化学染色观察PCNA的表达。结果 与B组和C组比较，D组各时间点血管内腱、中膜的犀度和管腔的狭窄率均显著减小（P〈0.01）；正常血管组织有微量Egr-1表达，术后Egr-1mR．NA和蛋白水平逐渐增高，而D组血管组织Egr-1mRNA和蛋白水平较B组和C组均降低（P〈0．01）；免疫组织化学染色显示，术后3dPCNA表达开始增加，7d达高峰。14d开始下降，D组血管壁PCNA阳性细胞百分比明显低于B组和C组（P〈0．01）。B组和C组之间相比较，以上各指标差异均无显著性（P〉0．05）。结论 ED5可能通过抑制Egr-1和PCNA的表达，而减轻血管损伤后内膜增生。     

IFN-γ抗结核分枝杆菌感染的实验观察

目的　观察IFN -γ抗结核分枝杆菌感染的作用。方法　将BALB/c小鼠制成结核分枝杆菌感染模型 ,随机分为 4组 ,分别以IFN -γ、LVFX、IFN -γ +LVFX及PBS治疗 ,检测重要脏器菌落数 ,观察小鼠平均生存时间。结果　各治疗组肝、脾、肺组织菌落数均显著低于对照组 ,尤其IFN -γ +LVFX治疗组效果更为明显 ;治疗组小鼠平均生存期均显著高于对照组 (P <0 .0 1)。结论　外源性IFN -γ可减少肝、脾、肺组织中结核分枝杆菌菌落数 ,延长动物生存时间 ,促进Th1细胞的免疫应答 ,在抗结核分枝杆菌感染中起着重要作用。     

10-23脱氧核酶对CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶的抑制作用

目的:探讨10-23脱氧核酶(10-23DRz)抑制CTX-M-38型ESBLs的可行性.方法:依据CTX-M-38型ESBLs序列及其mRNA构象特征,设计针对其mRNA结构的10-23DRz脱氧核酸序列及反义核酸序列;采用氯化钙法对10-23DRz及反义核酸进行转化;依据转化菌在平板上菌落形成状况及菌液吸光度选择10-23DRz应用量;采用K-B法体外药敏试验检测耐药活性.结果:45 nmol 10-23DRz用量时转化菌菌落形成量及菌液吸光度较为理想.除哌拉西林、头孢噻肟及亚胺培南外,其他抗菌药物10-23DRz组与反义核酸组抑菌环直径间差异有统计学意义(P均<0.001).结论:10-23DRz可抑制CTX-M-38型ESBLs的表达.     

减毒结核分枝杆菌H37 Ra感染小鼠模型的实验研究

目的：：研究减毒结核分枝杆菌(M. tb)H37Ra 感染小鼠模型及其病理损伤的机制。方法：将清洁级Balb/c小鼠分为对照组和M. tb模型组,各3只。将H37Ra按照每只小鼠1×106 CFU的剂量,经尾静脉注射感染小鼠,分别于感染7、14和21 d后,无菌操作取小鼠肺和脾脏组织,测量肺和脾脏的脏器系数,匀浆后行活菌培养;肺和脾脏组织冷冻切片,行HE染色观察病理损伤情况。结果：小鼠感染M. tb 14和21 d后,脾脏脏器系数均较感染7 d后显著升高(P<0.01和P<0.05)。感染7 d后,肺和脾脏组织匀浆均可检出活菌,脾脏组织H37Ra活菌量明显高于肺脏,并随感染时间逐渐增加;感染14 d后,肺组织病理观察可见明显感染性病变损伤。结论：M. tb H37Ra 经尾静脉注射感染小鼠模型可造成部分结核病样病理性损伤。     

中草药抗结核分枝杆菌的实验研究

目的:在实验条件下观测部分中草药在单味和复方组合下,对结核分枝菌的抗菌活性.方法:采用琼脂绝对浓度法,加入不同浓度的单味或复方中草药,接种结核分枝杆菌(HV37株),在37℃下培养一个月.结果:大蒜液1:10;百部液1:5;夏枯草液1:5有抑制结核茵生长作用;而大蒜百部混合液1:20;夏枯草大蒜混合液1:20;夏枯草百部混合液1:10;大蒜夏枯草百部混合液1:40均有抑制结核分枝杆菌生长的作用.结论:三种中草药在实验条件下均有抗结核分枝茵的作用,联合药效比单药的作用强.     

结核分枝杆菌感染实验模型

结核分枝杆菌是引起人结核病的主要病原,全世界约有1/3人口感染结核分枝杆菌.尽管该病原可感染并引起许多动物疾病,但人类是其中心宿主.为研究结核分枝杆菌的致病机理及宿主对本病原的保护性和免疫病理学反应,选择合适的动物模型非常必要.本文阐述了结核病研究中常用的实验模型及各种模型的优缺点.实验模型的合理应用将促进我们对结核病的认识,从中获取的资料将有助于我们发现更好的预防和治疗方案.     

计算机辅助设计抗MRSA耐药基因mecR1的10-23型脱氧核酶

应用Primer Premier 5.0和RNA structure 4.6两种软件设计和筛选有效抗mecR1的10-23型脱氧核酶（DRz）,采用电转化的方法将其导入细菌体内,实时PCR的方法定量检测其对mecR1转录的影响,并通过平板克隆形成实验观察脱氧核酶抑制细菌生长的情况。结果表明,计算机辅助设计合成的5条抗MRSA耐药调控基因mecR1的10-23型脱氧核酶,它们能不同程度的降低mecR1的转录水平,有效抑制临床耐药菌MRSA080309的生长,其中DRz6抑制效果最显著。说明联合应用这两种计算机软件设计抗mecR1的10-23型脱氧核酶,是一种经济实用而有效的方法,能够大大缩短有效反义药物的筛选时间。     

重组结核分枝杆菌CFP10的克隆与表达

目的:克隆和表达结核分枝杆菌CFP10,并分析其免疫学活性。方法:自结核分枝杆菌标准株H37Rv提取基因组DNA,PCR扩增cfp10基因,克隆至T载体pMD18T,转化入大肠杆菌JM109,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的pMD18-cfp10的cfp10基因亚克隆至表达载体PQE30,构建重组质粒PQE30-cfp10,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,PCR和双酶切鉴定阳性重组体,IPTG诱导CFP10表达,亲和层析纯化,western-blot分析其免疫活性。结果:成功构建PQE30-cfp10重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约10kDa的CFP10,并能被结核病人血清识别。结论:克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌CFP10。     

“10～23”型脱氧核酶的研究进展

脱氧核酶是利用体外分子进化技术获得的一种具有酶活性的单链DNA分子。迄今为止，利用该技术已筛选出多种具有催化功能的脱氧核酶分子，其中研究最多的是具有RNA切割活性的脱氧核酶，尤其是10～23型脱氧核酶，该酶能催化RNA特定部位的切割反应，从mRNA水平使基因灭活，从而调控蛋白质的表达，在抗肿瘤、抗病毒等基因治疗领域具有广阔的应用前景。     

结核分枝杆菌CFP-10蛋白的克隆及表达

目的通过构建结核分枝杆菌CFP-10蛋白表达载体,在大肠杆菌表达,为探索重组多肽在结核病血清学诊断的应用奠定前期实验基础。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出CFP-10基因片段,连接到表达载体PET30a上,在大肠杆菌中表达;组氨酸标签（His-Tag）镍柱层析纯化重组蛋白。结果构建了含CFP-10重组质粒的大肠杆菌工程菌,发现目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。结论 CFP-10蛋白基因克隆入宿主菌中并表达成功。     

10-23型脱氧核酶对HBV S、C基因体外切割作用研究

目的:探讨10-23脱氧核酶(10-23 DRz)对HBV S基因及C基因体外转录产物的特异性切割作用.方法:分别构建含有HBV S基因或C基因的重组质粒,以线性化的重组质粒为模板,体外转录获得相应HBV S基因RNA及C基因RNA.设计并合成针对HBV S基因的DRz-hbvs-1和针对C基因的DRz-hbvc-1,观察其对靶RNA的体外切割作用.结果:DRz-hbvs-1及DRz-hbvc-1能对各自相应的靶RNA进行有效的特异性切割;无DRz对照组及反义寡核苷酸对照组均未见特异性切割.结论:10-23 DRz能特异性切割HBV S基因及C基因体外转录产物.     

结核分枝杆菌L型感染对结核病患者痰菌阴转率的影响

目的分析深圳市罗湖辖区结核病患者结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB）及其L型（MTB—L）的感染状况,探讨MTB—L感染对结核病患者痰菌阴转率的影响。方法采用抗酸染色法检测辖区内2010—2011年收治的960例结核病确诊患者（初治916例、复治44例）的痰液标本并分析其治疗期间MTB和MTB—L的阳性检出率。计算结核病痰菌涂阳患者2、3月末痰菌阴转率,比较MTB阳性、MTB＋MTB．L阳性以及MTB．L阳性患者痰菌阴转率的差异。结果916例初治患者中MTB阳性患者411例、MTB＋MTB．L阳性患者130例、MTB-L阳性患者129例,初治结核病患者中MTB阳性患者2、3月末痰菌阴转率（90．3％、99．5％）均分别高于MTB＋MTB-L阳性患者（46．9％、89．2％）及MTB-L阳性患者（45．7％、89．1％）,差异均有统计学意义（Pl〈0．05）;而MTB＋MTB-L阳性患者2、3月末痰菌阴转率与MTB-L阳性患者比较差异均无统计学意义（尸〉0．05）。44例复治结核病患者中MTB阳性患者12例、MTB＋MTB-L阳性患者19例、MTB-L阳性患者13例,MTB阳性患者2月末痰菌阴转率（83．3％）分别高于MTB＋MTB-L阳性患者（42．1％）及MTB．L阳性患者（38．5％）,差异均有统计学意义（P〈0．05）;MTB阳性患者3月末痰菌阴转率（91．7％）分别略高于MTB＋MTB-L阳性患者（73．7％）及MTB-L阳性患者（76．9％）,但差异均无统计学意义（P〉O．05）;MTB＋MTB-L阳性患者2、3月末痰菌阴转率与MTB-L阳性患者比较差异均无统计学意义（尸〉0．05）。结论MTB-L感染可能是结核病患者痰菌阴转率低的重要原因．加强MTB-L感染监测是当前结核病防控的重要策略之一．     

结核分枝杆菌CFP10诊断抗原基因的克隆及序列特性分析

目的扩增结核分枝杆菌培养滤液蛋白10基因（CFP10）,并将其克隆至质粒pGEMT中进行核苷酸序列特性分析,为研究结核病候选诊断抗原基因奠定基础。方法以结核菌标准菌株H37Rv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌CFP10抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行酶切鉴定及序列测定和生物信息学分析。结果成功扩增出结核分枝杆菌CFP10抗原基因,测序表明该片段开放阅读框由303bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为100%,推导编码氨基酸序列同源性为100%。结论成功克隆CFP10基因,经DNA测序证实,该片段阅读框完整,为其原核表达及相关研究奠定了基础。