野生型DNA聚合酶β在肺腺癌细胞中的表达研究

目的研究人野生型DNA聚合酶β基因编码的蛋白质在肺腺癌A549细胞株内的表达。方法将人重组的携带野生型的DNA聚合酶β基因真核绿色荧光表达载体pEGFP-C3-polβ用脂质体介导的方法转染A549细胞株,用荧光倒置显微镜观察转染细胞,RT-PCR检测其在核酸水平的表达。结果野生型的DNA聚合酶β基因转染细胞后主要定位于细胞核内,而不含DNA聚合酶β基因的空质粒转染细胞后则主要表达在胞浆中,RT-PCR证实转染细胞中的野生型的DNA聚合酶β比未转染细胞表达量高。结论野生型的DNA聚合酶β基因在A549细胞中表达,且定位于胞核内,这对进一步研究肺癌的发生发展奠定了基础。     

人野生型DNA聚合酶β在NIH3T3细胞中的定位

目的：研究人野生型DNA聚合酶β(wtDNA polβ)在NIH3T3细胞内的定位。方法：将携带人wtDNA polβ的真核绿色荧光表达载体pEGFP—C3—polβ,用脂质体介导的方法转染NIH3T3细胞株,用荧光倒置显微镜观察转染细胞,观察wtpEGFP—C3—polβ融合基因表达。以转染空质粒pEGFP—C3的NIH3T3细胞为对照。结果：转染细胞均有GFP表达,说明转染成功,转染pEGFP—C3—polβ的细胞胞核荧光强度较胞浆强,而空质粒转染细胞胞浆胞核荧光强度无差别。结论：wtDNA polβ在NIH3T3细胞中定位于胞核内。     

稳定表达野生型DNA聚合酶β的细胞系的建立

目的建立稳定表达野生型DNA聚合酶β的细胞系。方法将已构建的野生型DNA聚合酶β的真核表达载体用脂质体法转染中国仓鼠卵巢细胞,经G418筛选后得到稳定转染的细胞株,用免疫印记方法鉴定野生型DNA聚合酶β蛋白水平的表达。结果成功转染和筛选出表达外源性DNA聚合酶β基因的中国仓鼠卵巢细胞株,并检测到该基因蛋白水平的高表达。结论建立稳定表达DNA聚合酶β的细胞株,为进一步研究DNA聚合酶β高表达对细胞生物学特性的影响奠定基础。     

不同类型的DNA聚合酶β基因对CHO细胞的影响

目的:比较野生型和突变型(58 bp缺失)DNA聚合酶β(polβ)基因对真核细胞生长特性的影响. 方法:将表达人野生型和缺失型DNA polβ的中国仓鼠卵巢细胞株(CHO),用RT-PCR方法鉴定野生型和缺失型DNA polβ mRNA水平的表达,MTT法测生长曲线、流式细胞术测细胞周期. 结果:转染野生型和突变型DNA polβ的CHO细胞株中,都有外源基因mRNA水平的表达;转染突变型(58 bp缺失)polβ基因的细胞增殖速度和S期比例增高均高于未转染组细胞,差异有统计学意义(P<0.05). 而转染野生型polβ基因对细胞增殖速度和细胞周期无明显影响(P>0.05). 结论:高表达外源性野生型和突变型DNA polβ,对CHO细胞生长具有不同的影响.     

细胞膜上稳定表达融合蛋白CRT/vGPCR A549细胞株的建立

目的 将人钙网蛋白(calreticulin,CRT)基因与病毒G蛋白偶联受体(virus G-protein couple receptor,vGPCR)基因进行基因重组,用此重组基因建立细胞膜上稳定高表达CRT/vGPCR融合蛋白的人肺癌A549细胞株.方法 从pSG5-vGPCR质粒中获得全长vGPCR基因片段并与CRT全长编码序列的3′端连接形成融合基因,然后将融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中.用此质粒转染人A549肺癌细胞,通过G418筛选建立稳定转染的A549细胞株,用RT-PCR检测重组融合基因的表达,用细胞免疫荧光分析鉴定融合蛋白的表达及其在细胞膜上的定位.结果 成功获得重组融合质粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR,经DNA序列测定证实融合基因两阅读框(ORF)对接无误.将上述质粒转染A549细胞后,建立了稳定转染CRT/vGPCR的A549细胞株,融合基因在A549细胞中表达并定位到细胞膜上.结论 通过与CRT基因融合重组,具有膜定位能力的vGPCR能将CRT蛋白高效包被到肿瘤细胞膜上.     

RNA干扰介导的人肺腺癌A549细胞FasL基因沉默及意义

目的构建针对肿瘤凋亡基因FasL的小干扰RNA（siRNA）表达质粒,研究RNA干扰技术对人肺腺癌A549细胞FasLmRNA表达的抑制作用,探索Fas／FasI途径在肺癌转移中的作用机制。方法依据siRNA靶序列的设计原则,以FasLmRNA为靶基因,合成2对编码短发夹结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至siRNA表达质粒pSilencer2．0中,转化后进行PCR鉴定和DNA序列测定。用脂质体介导转染入人肺腺癌A549细胞株,采用实时荧光定量PCR检测细胞FasL mRNA水平的变化。结果成功构建发卡样FasLsiRNA真核表达载体,转染人肺腺癌A549细胞后,FasLmRNA的表达水平显著下降。结论成功构建的FasL基因siRNA真核表达载体pSi2．0-FasL能显著抑制人肺腺癌A549细胞FasLmRNA的表达。     

RAD18基因敲除增强肺腺癌细胞对顺铂的敏感性

目的:研究敲除E3泛素连接酶RAD18基因后,人肺腺癌A549细胞株和顺铂耐药A549(A549/DDP)细胞株FA/BRCA途径DNA修复功能的变化及其对顺铂敏感性的改变。方法:合成针对RAD18基因的siRNA(RAD18-siRNA),通过脂质体将其分别转染人A549和A549/DDP细胞株。蛋白质印迹法检测经顺铂处理的两种细胞株转染siRNA前后RAD18蛋白表达及FANCD2单泛素化水平;CCK-8法测定经顺铂处理的两种细胞株转染siRNA前后细胞增殖率的变化;免疫荧光测定胞核内FANCD2核聚小体的形成;Annexin V/PI流式细胞术测定转染前后细胞凋亡率。结果:与转染RAD18-siRNA前相比,转染后经顺铂处理的A549和A549/DDP细胞株RAD18表达均明显降低;FANCD2蛋白单泛素化水平下调和核聚小体形成减少;同时细胞增殖率明显降低,细胞凋亡率则明显增加。结论:应用RNA干扰技术敲除RAD18基因可通过抑制A549和A549/DDP细胞株FA/BRCA途径的DNA损伤修复功能,增加这两种细胞株对顺铂的敏感性。     

RNA干扰A549细胞核干细胞因子基因表达

目的探讨A549细胞株NS基因的表达干扰后,A549细胞株的mRNA表达水平及细胞增殖变化。方法构建NSshRNA真核表达载体,转染A549细胞,G418筛选稳定表达细胞克隆,RT-PCR检测NS基因沉默,MTT检测细胞增殖情况。结果构建的NSshRNA真核表达载体经菌落PCR和测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。RT-PCR检测显示构建的shRNA表达载体转染A549细胞后可显著降低NSmRNA的表达;M1vr结果显示干扰后细胞增殖速率明显减低。结论成功构建了一组针对NS基因的shRNA真核表达载体,转染A549细胞后NS基因表达被特异性沉默,且细胞增殖受到明显抑制,通过RNAi技术实现NS基因沉默可能是一种较有前景的肿瘤治疗方法。     

人核因子κBp65核定位信号缺失突变对A549细胞恶性表型的影响

目的鉴定人核因子κB(NF-κB)p65核定位信号(NLS)缺失突变质粒即pc DNA3.1(+)-NF-κBp65ΔNLS(简称NF-κBp65ΔNLS)的表达功能,以及其对低表达NF-κBp65的A549细胞株即A549/NF-κBp65 shRNA细胞增殖、迁移和粘附能力的影响。方法培养人A549/NF-κBp65 shRNA细胞株,分为对照组、转染pc DNA3.1(+)组、转染NF-κBp65ΔNLS组。应用间接免疫荧光、实时荧光定量-PCR和Western blot技术检测NF-κBp65的细胞内定位及mRNA、蛋白表达水平的变化;应用MTT、Transwell和细胞粘附实验分析转染NF-κBp65ΔNLS质粒对A549/NF-κBp65 shRNA细胞增殖、迁移、粘附能力的影响。结果成功构建人NF-κBp65ΔNLS真核表达质粒。转染NF-κBp65ΔNLS质粒的A549/NF-κBp65 shRNA细胞与对照组及转染pc DNA3.1(+)组比较,NF-κBp65 mRNA表达水平明显上调(10.63±0.84比1.04±0.21和1.23±0.22,P0.01),NF-κBp65蛋白表达水平明显升高(1.07±0.06比0.53±0.02和0.59±0.04,P0.01),且NF-κBp65蛋白主要位于细胞浆内,在肿瘤坏死因子α刺激后NF-κBp65蛋白并未明显进入细胞核。与对照组及转染pc DNA3.1(+)组比较,转染NF-κBp65ΔNLS质粒的A549/NF-κBp65 shRNA细胞的增殖、迁移和粘附能力均有不同程度增强。结论通过基因突变技术构建无NLS的NF-κBp65真核表达质粒,可明显增强A549/NF-κBp65shRNA细胞株内NF-κBp65 mRNA和蛋白的表达水平,并使NF-κBp65蛋白定位于细胞浆内;同时,细胞浆内过表达NF-κBp65ΔNLS蛋白可明显增强A549/NF-κBp65 shRNA细胞的增殖、迁移和粘附能力,提示滞留于细胞浆内的NF-κBp65仍可通过影响NF-κB信号通路相关蛋白参与调节肺癌细胞的生物学行为。     

稳定表达缺失型DNA聚合酶β的CHO细胞系的建立

目的：建立稳定表达缺失型DNA聚合酶β（polβ）的细胞系。方法：将已构建的缺失型polβ的真核表达载体pcDNA3．1-polβ用脂质体法转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO），经G418筛选后得到稳定转染的细胞株，用RT—PCR方法鉴定细胞缺失型polβmRNA的表达。结果与结论：成功转染和筛选出表达缺失型polβ细胞株CHO—polβ，建立了稳定表达缺失型polβ的CHO细胞株。     

β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒的构建及表达

目的构建β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒，为进一步研究β-catenin在神经细胞内与其它蛋白质如tau、PSI的相互作用以及在阿尔茨海默病发病机制中的作用提供一种有用的工具。方法用亚克隆的方法将β-连环素基因插入到真核表达栽体pEGFP-C1，重组质粒pEGFP-cat瞬时转染野生型鼠成神经瘤细胞株．并在荧光倒置显微镜下观察转染效率。结果酶切鉴定和测序结果证实编码β-catenin的重组质粒构建成功，免疫荧光技术和免疫印记结果显示β-catenin-GFP融合蛋白在真核细胞中获得表达。结论成功构建β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒，并在鼠成神经瘤细胞中表达了β-catenin—GFP融合蛋白。     

人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建

目的 克隆人类DNA聚合酶（pol-β)基因全长cDNA，构建该基因的真核高铲表达载体。方法 抽提人胚肺纤维细胞HLF总RNA进行RT－PCR扩增，用pGEM-T载体经T／A克隆，DNA测序确定后，用双酶切将pol-β全长cDNA定向克隆到绿色荧光蛋白表达载体EGFP-Cl，转染大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆，双酶切鉴定重组质粒。结果 经RT－PCR获得1.03kb的产物，经DNA顺序，确定所扩增片段为人类pol-β基因全长cDNA，进而成功筛选出真核表达载体pEGFP-Cl-β。结论 成功构建人pol-β基因全长cDNA真核表达载体，为进一步建立该基因的高表达细胞株提供基础。     

核糖体蛋白L39-L在肺癌1549细胞耐药机制中的作用

目的探讨核糖体蛋白L39-L在肺癌A549细胞对阿霉素类药物耐药机制中的作用。方法以体外培养的阿霉素耐药和敏感人肺癌A549细胞株，啊z01法提取总RNA，LightCyclerRNA扩增法进行荧光定量RT-PCR，检测阿霉素耐药A549细胞株、敏感细胞株之间的RPL39--L基因表达差异。经对人肺癌A549敏感细胞株体外培养、稳定转染RPL39-L基因后，3H—TdR掺人法进行生存率检测分析核糖体蛋白L39-L转染A549细胞、载体转染A549细胞和空细胞株对阿霉素的耐药性差异。结果荧光定量RT-PCR结果显示，耐药性人肺癌A549细胞株比敏感的A549细胞核糖体蛋白L39-L转录水平高7．3倍。1H1TdR掺入测定生存率显示，与质粒载体转染细胞或空细胞相比，转染核糖体蛋白L39-L的细胞表现出增强的阿霉素耐药性。结论核糖体蛋白L39-L基因可育旨在肺癌A549细胞的耐药机制形成机制中有作用。     

DNA氧化损伤修复基因hOGG1高表达细胞株的建立

目的联合pcDNA3.1(+)/Myc-HisA-hOGG1和pGL3promoter荧光质粒稳定转染人肺腺癌A549细胞获得hOGG1基因高表达细胞株,并初步探讨转染细胞生物学特性的变化。方法成功构建pcDNA3.1(+)/Myc-His A载体后,大量抽提阳性重组子并在Fu GENE6的介导下联合pGL3promoter荧光质粒转染A549细胞(转染组),同时设空白对照组(A549)和阴性对照组[PGL3+pcDNA3.1(+)/Myc-HisA转染的A549细胞]。生物荧光检测转染细胞hOGG1mRNA表达的改变,蛋白质免疫印迹法检测转染细胞hOGG1蛋白表达水平。将3组细胞于不同高氧条件下培养,相差显微镜观察形态学变化,彗星试验比较各组细胞对抗损伤和修复能力的情况,同时测定DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的变化。结果转染细胞荧光素酶稳定表达,蛋白印迹检测转染组hOGG1蛋白明显高于两对照组细胞,提示hOGG1基因高表达细胞株建立成功。相同高氧条件下,转染组形态学变化明显减轻,彗星细胞率和olive tail moment明显低于空白组和阴性对照组,修复完成率高,修复时间缩短(P<0...     

重组表达载体plRES Rb94的构建及其对肺腺癌A549细胞株中SphK表达的影响

目的构建真核表达质粒pIRES Rb94,观察Rb94基因对鞘氨醇激酶（SphK）表达的影响。方法根据Rb94基因序列设计、合成引物,构建以内部核糖体进入位点（IRES）相连的Rb94基因的真核表达质粒pIRES Rb94,经脂质体转染A549细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。采用Real time RT PCR和Western boltting法检测Rb94基因并观察其对人肺腺癌A549细胞株SphK表达的影响。结果成功构建重组表达质粒pIRES Rb94,转染A549细胞后获得稳定转染细胞株pIRES Rb94 A549,该细胞株中Rb94基因高效表达;SphK1表达下调而SphK2表达上调。结论真核表达质粒pIRES Rb94构建成功并可有效转染A549细胞,Rb94基因抑制SphK1的表达,增强SphK2的表达。     

siRNA沉默FANCD2基因增加肺癌A549/DDP细胞对顺铂化疗的敏感性

目的: 研究siRNA沉默FANCD2基因后人肺腺癌A549/DDP耐药细胞株对顺铂(DDP)耐药性的变化。方法:合成针对FANCD2基因的siRNA(FANCD2 siRNA),采用脂质体将其分别转染肺癌A549细胞株和A549/DDP耐药细胞株。CCK-8法测定经DDP处理的A549和A549/DDP细胞株转染siRNA前后的细胞增殖率变化;免疫印迹法测定2种细胞株转染siRNA前后FANCD2蛋白单泛素化水平;免疫荧光测定胞核中FANCD2蛋白核聚小体的形成。结果：经DDP处理的A549/DDP细胞增殖率,FANCD2蛋白单泛素化水平及核聚小体形成程度明显高于A549细胞。转染FANCD2-siRNA后,A549和A549/DDP细胞的FANCD2蛋白单泛素化水平和核聚小体形成明显降低,细胞增殖率显著下降。结论： 应用siRNA转染技术沉默FANCD2基因可抑制FA/BRCA途径的DNA修复功能,从而增加肺癌细胞对DDP的敏感性,部分逆转耐药肺癌细胞株对DDP的耐药性。     

端粒酶逆转录酶基因hTERT突变表达载体在膀胱癌细胞T24中的表达

目的 构建端粒酶逆转录酶基因（hTERT）缺失突变的真核表达载体pEGFP-hTERT，并转孜膀胱癌细胞株T24中，观察其稳定表达，探讨其对端粒酶性调控机制及成为膀胱肿瘤基因治疗新靶点的可能性，方法 将PCR扩增的hTERT缺失突变体片段用EcoRⅠ与SalⅠ酶切，并连接到真核表达载体pEGFP-C1上，构建成hTERT缺失突变的真核表达载体pEGFP-hTERT；利用DNA－磷酸钙共沉淀法将pEGFP-hTERT导入膀胱癌细胞株T24中，应用荧光显微镜、与衰老相关的β－半乳糖苷酶染色等方法观察转染细胞中hTERT-GFP融合蛋白定位表达及对膀胱癌细胞生长的影响。结果 酶切鉴定证实hTERT缺失突变体体已克隆到pEGFP-C1的EcoRⅠ与SalⅠ位点之间，在转染细胞中观察到与其融合的绿色荧光蛋白的稳定表达，定位于细胞核内；转染细胞2wk后与衰老相关β－半乳糖苷酶表达增加，细胞生长受抑制。结论 构建的端粒酶逆转录酶基因hTERT缺失突变真核表达载体pEGFP-hTERT可在膀胱癌细胞T24中稳定表达。突变型hTERT蛋白可入细胞核中竞争性影响端粒酶的功能，进而抑制膀胱癌细胞的生长。     

稳定表达外源野生型p53基因人胆囊癌细胞系的建立和鉴定

目的：建立稳定表达外源野生型p53（wtp53）基因的人胆囊癌细胞系。方法：在脂质体lipofectamine^TM 2000介导下，将含有wtp53的真核表达质粒pCMV-p53导入胆囊癌细胞系GBC—SD中。经G418筛选抗性克隆，扩大培养，建立转染克隆细胞系。用聚合酶链反应（PCR）证实外源野生型p53基因的整合，用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白印迹法分析目的基因及其蛋白表达。结果：野生型p53基因成功地导入胆囊癌细胞系GBC—SD，转染细胞中存在外源p53基因及蛋白的稳定表达。结论：GBC—SD胆囊癌细胞株能稳定表达外源野生型p53基因。     

辐射诱导表达载体pEgr-hTRAIL的构建及其对肿瘤细胞的体外诱导凋亡作用

目的：构建携带人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（hTRAIL）基因的辐射诱导表达载体pEgr-hTRAIL,并研究其在人肺腺癌细胞株A549中的表达及促凋亡作用。 方法：采用常规分子生物学方法构建表达质粒pEgr-hTRAIL,体外通过脂质体转染A549细胞,经G418筛选稳定转染细胞A549-shTRAIL,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测目的基因的表达,采用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞早期凋亡。 结果：经限制性内切酶酶切鉴定pEgr-hTRAIL表达质粒构建正确;稳定转染细胞A549-shTRAIL的hTRAIL mRNA表达量明显增加;稳定转染细胞A549-shTRAIL的凋亡细胞百分数明显增加,是A549细胞的1.8倍（P<0.05）。 结论：成功构建pEgr-hTRAIL表达质粒,体外稳定转染细胞A549-shTRAIL具有明显诱导凋亡作用。     

外源性人分化抑制因子3在A549／DDP细胞中的表达及意义

目的:Id 蛋白即分化抑制因子(Id),在人类多种肿瘤中异常表达,并参与肿瘤细胞的增生、分化和凋亡等.文中旨在探讨人分化抑制因子3(Id3)基因体外转染在人肺腺癌细胞顺铂耐药株A549/DDP细胞中的表达及意义. 方法:构建人Id3基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达载体Id3/pEGFP,采用脂质体介导的转染技术将Id3融合基因(Id3-EGFP)导入A549/DDP细胞,激光共聚焦显微镜观察细胞内EGFP的表达情况;半定量RT-PCR检测Id3表达的改变;MTT法观察Id3对细胞的增殖抑制情况. 结果:成功构建人Id3/pEGFP真核表达载体并转染A549/DDP细胞,倒置荧光显微镜下转染的A549/DDP细胞发出强绿色荧光,转Id3/pEGFP质粒的细胞其荧光主要表达于细胞核;RT-PCR结果显示Id3 mRNA在转染后的A549/DDP细胞能有效表达;MTT法结果表明,与对照组相比,转染Id3重组质粒的细胞增殖被抑制. 结论:转染的Id3/pEGFP融合基因在A549/DDP细胞能有效表达,外源性Id3基因能抑制该细胞的增殖.