重组EV71和CVA16型手足口病双价VLP疫苗构建及免疫保护效果评价

目的运用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达EV71和CVA16的病毒样颗粒,并对纯化的重组EV71、CVA16双价病毒样颗粒疫苗进行免疫效果评价。方法构建重组杆状病毒Bacmid-P1-3CD,转染Sf9昆虫细胞,纯化EV71、CVA16的病毒样颗粒并检测其形态和生物特性;通过EV71、CVA16的病毒样颗粒免疫ICR雌鼠后,以EV71、CVA16强毒株腹腔攻击5日龄乳鼠,对重组EV71、CVA16型双价VLP免疫保护性进行评价。结果利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功构建并表达EV71和CVA16病毒样颗粒,颗粒大小约为23~30 nm,存在Mr约39 000 VP1特异性蛋白表达。重组EV71、CVA16双价VLP疫苗免疫接种能够诱导小鼠机体产生高效价的特异性抗体(EV71中和抗体效价为1∶960,CVA16中和抗体效价为1∶624)并发挥优于单价VLP疫苗的有效免疫保护效果。结论重组EV71、CVA16型双价VLP疫苗免疫原性和保护性显著高于单价疫苗,为手足口病疫苗的研发提供了新的思路及实验基础。     

肠道病毒71 VP1基因的原核表达及其抗血清的制备

目的克隆并表达重组肠道病毒71(EV71)VP1基因,进行抗血清的制备并检测抗血清效价。方法利用原核表达系统将PCR获得的VP1片段构建成原核表达载体pET32a(+)-VP1,诱导其表达VP1融合蛋白并利用包涵体纯化方法进行重组蛋白的纯化,将纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备VP1抗血清,ELISA检测抗体效价。同时构建真核表达载体,利用其在真核细胞中的瞬时表达检测抗血清的特异性。结果通过克隆获得VP1原核表达载体,IPTG诱导VP1蛋白表达并纯化,SDS-PAGE结果显示重组蛋白表达且纯化浓度较高,将重组蛋白乳化后免疫新西兰兔3次,取血检测抗血清的效价,ELISA结果显示抗体效价为1∶64 000,利用所构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP1表达VP1对抗血清进行检测,Western blot结果表明抗血清可较好的与VP1特异性结合。结论制备具有免疫原性的VP1蛋白及其效价较高的抗血清,为进一步研究抗EV71诊断方法、血清学诊断试剂盒及抗病毒疫苗的研制奠定基础。     

Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达、纯化及免疫效果评价

目的:利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)进行表达,纯化后评价其免疫效果,以探索HSV-2重组亚单位疫苗的研制。方法:提取HSV-2DNA作为模板,用聚合酶链式反应(PCR)扩增gD2基因,克隆至pFastBac HTA载体中,利用载体中的His基因标记gD2,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达His-gD2融合蛋白,表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot检验,用镍柱进行纯化,免疫小鼠评价其免疫原性。结果:HSV-2gD2在昆虫细胞Sf9中得到特异性表达,纯化后的重组蛋白诱导小鼠体内产生高水平的IgG抗体及中和抗体。结论:gD2基因在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中获得表达,表达产物表现出良好的免疫原性及中和活性,为发展HSV-2亚单位疫苗奠定了基础。     

产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位可有效诱导和增强对肠道病毒71型的黏膜免疫应答

目的研究产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的免疫原性。评价肠道病毒71型(EV71)衣壳蛋白VP1联合LTB的鼻腔免疫效果。方法构建重组质粒pET32a-LTB,表达的6×His-LTB融合蛋白用Ni2+-NTA树脂纯化后免疫新西兰大白兔制备抗血清,ELISA检测抗血清效价。用纯化的EV71 VP1、LTB联合EV71 VP1、生理盐水分别经鼻腔免疫BALB/c小鼠,收集血清、肺和小肠黏膜冲洗液,采用间接ELISA检测IgG和分泌性IgA(sIgA)。结果已成功构建重组质粒pET32a-LTB。表达的6×His-LTB融合蛋白主要以包涵体形式表达,相对分子质量(Mr)约为30 000,免疫兔所制备的抗血清效价为1∶125 000。EV71 VP1联合LTB组的小鼠特异性IgG和sIgA水平较EV71 VP1单独免疫组和对照组有明显增高。结论在E.coli BL21(DE3)中成功表达了6×His-LTB融合蛋白,纯化的融合蛋白具有良好的免疫活性和佐剂活性。通过滴鼻免疫,LTB可有效增强特异性血清抗体反应,诱导黏膜免疫应答。     

人源抗EV71病毒基因工程抗体的研究

目的 研制人源抗EV71病毒基因工程抗体.方法 采集多个患儿外周血淋巴细胞,构建人源抗EV71单链（scFv）噬菌体抗体基因文库.用纯化的EV71 VPI蛋白对抗体库进行筛选,将筛出抗体的轻链和重链通过序列测定确定抗体轻重链型别后分别克隆入全抗体表达载体pAC-LCH3R后转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达.结果 成功地获得了1株抗EV71病毒VPI蛋白的人源单克隆抗体,利用ELISA、IFA对所获人源单克隆抗体的功能特性进行鉴定,表达成分泌型IgG全抗体在体外与A型及C4亚型EV71病毒的中和反应结果 显示为阴性.结论 从免疫库中获得了1株人源非中和单抗,为EV71病毒引起的手足口病的鉴别诊断奠定了基础.     

人肠道病毒71型VP0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VP0蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性。方法:PCR方法扩增VP0基因,构建原核表达质粒pET-VP0并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VP0重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VP0多克隆抗体,ELISA方法检测抗VP0抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性。结果:VP0重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VP0抗体效价为1∶106。细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VP0多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VP0蛋白。结论:原核表达了EV71的VP0蛋白并制备出抗VP0多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段。     

新肠道病毒71型病毒样颗粒的制备

目的:研究新肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)的制备方法。方法:依据昆虫细胞偏爱密码子优化EV71 P1和EV71 3CD基因,将二者分别克隆至供体质粒pFastBac Dual多角体蛋白启动子pPh和pP10上;构建重组pFastBac Dual EV71 P1-3CD质粒,并与Bacmid质粒转座后,获得重组杆状病毒表达质粒转染至Sf9细胞,应用PCR、免疫荧光、SDS-Page和Western blot方法鉴定EV71 VLPs表达情况,最后利用蔗糖密度梯度离心的方法纯化EV71 VLPs。结果:经昆虫密码子优化的EV71 P1和EV71 3CD基因,利用Bac-to-Bac系统成功组装了EV71 VLPs,纯化EV71VLPs的浓度为0.817 mg/ml,纯度>90%。结论:成功地构建了重组杆状病毒EV71 P1-3CD Bacmid表达质粒,并表达和纯化了EV71 VLPs,这为今后EV71 VLPs疫苗的研究奠定了基础。     

人肠道病毒71型VPO蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VPO蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性.方法:PCR方法扩增VPO基因,构建原核表达质粒pET-VPO并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VPO重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VPO多克隆抗体,ELISA方法检测抗VPO抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性.结果:VPO重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VPO抗体效价为1:106.细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VPO多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VPO蛋白.结论:原核表达了EV71的VPO蛋白并制备出抗VPO多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段.     

柯萨奇病毒B 组5 型VP1 蛋白的外源表达及多克隆抗体的制备

目的:原核表达柯萨奇病毒B组5型的VP1蛋白,并制备其多克隆抗体及检测。方法:提取在Vero细胞中柯萨奇病毒B组5型的RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增获取VP1基因序列,构建原核表达载体,大量诱导表达重组VP1蛋白。用His Trap HP亲和层析柱纯化重组蛋白,以纯化的目的蛋白为抗原,免疫雄性SD大鼠获得VP1蛋白多克隆抗体血清,ELISA测定该抗体的效价,微量中和实验测定抗体的中和活性,Western blot检测抗体的特异性,免疫组化检测抗体对组织中抗原的识别。结果:成功构建了VP1-pET-28a重组载体,并且在BL21细胞中成功诱导表达,亲和层析柱纯化后蛋白纯度大于90%。ELISA测得抗体的效价为1∶128 000,微量中和实验显示抗体没有中和活性,Western blot分析显示抗体能与CVA16和EV71交叉反应,免疫组化实验表明抗体能够识别组织中的CVB5抗原。结论:本研究成功制备了CVB5 VP1蛋白的高效价的多克隆抗体,为CVB5病毒疫苗和病毒诊断的研发提供了有效的工具。     

Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达鼠IL-4受体拮抗体蛋白的研究

目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达鼠IL-4受体拮抗体 (mIL-4RA)蛋白.方法 PCR方法扩增小鼠IL-4 C118截断型基因,定向克隆入转移质粒pFastBacHTB中,转化感受态DH10Bac细胞,在DH10Bac细胞内重组pFastBacHTB与杆粒发生转座.筛选阳性克隆,提取重组杆粒,转染sf9昆虫细胞株,获取完整重组杆状病毒.反复感染sf9细胞,扩增病毒同时表达目的 蛋白;用ELISA方法进行蛋白鉴定并初步定量.结果 经核苷酸序列测定及PCR方法,鉴定成功获得含mIL-4RA基因的重组杆粒;通过杆粒转染后sf9细胞所表现出来的细胞病变,推断成功转染并获得重组杆状病毒;最后ELISA方法初步定量sf9细胞培养上清中mIL-4RA蛋白表达量为(1.15±0.12) ng/mL.结论 本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达mIL-4RA蛋白,为进一步研究其生物学活性及功能奠定了实验基础,同时亦为其他蛋白质的真核表达提供了方法学的参考.     

肠道病毒71型多表位-mGITRL真核表达质粒的构建、表达及其免疫原性研究

目的:构建肠道病毒71型(EV71)多表位-mGITRL真核表达质粒并对其免疫原性进行研究。方法:串联已证实的VP1表位并合成(VP1’);PCR扩增获得mGITRL,克隆至真核共表达载体pIRES中。对重组质粒进行测序鉴定后,以脂质体介导法转染至COS7细胞,通过Western blot方法检测其在COS7细胞中的表达。将构建好的重组质粒免疫小鼠,应用ELISA法检测小鼠血清中抗VP1的抗体滴度。结果:PCR扩增出目的基因,测序证实真核共表达载体pIRES-VP1’-mGITRL构建成功,Western blot结果显示目的基因在COS7细胞和肌细胞中过表达。小鼠血清中检测出高滴度的抗VP1抗体。结论:成功扩增出目的基因并构建VP1表位的重组真核共表达载体pIRES-VP1’-mGITRL,在COS7细胞和肌细胞中过表达,并获得高滴度的抗VP1抗体。     

重组基因c-Aβ-c的构建及其表达蛋白的免疫原性分析

目的:构建原核表达质粒pHGhis/c-Aβ-c,并在大肠杆菌中表达,观察融合蛋白c-Aβ-c的免疫原性,为阿尔茨海默病(AD)基因工程疫苗的研究打下基础。方法:采用PCR法,分别扩增编码HBcAg的1~71、88~144氨基酸的基因片断(HBc1~71和HBc88~144),以及编码淀粉样肽Aβ1-42的基因。将后者连接于HBc1~71和HBc88~144之间,构建重组质粒pGEMEX/c-Aβ-c,并将重组基因亚克隆于原核表达载体pHGhis中,构建表达质粒pHGhis/c-Aβ-c,通过温度诱导表达。用SDS-PAGE(考马斯亮蓝染色)检测融合基因的表达。以融合蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测小鼠血清中抗-Aβ抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、DNA序列测定证实,融合基因重组于表达质粒之中,表达质粒与理论设计相符。诱导表达后,表达蛋白约占细菌沉淀的16%。BALB/c小鼠经3次免疫后,其血清中抗-Aβ抗体的滴度可达1∶16000,且检测不到抗-HBcAg抗体。结论:c-Aβ-c融合基因在大肠杆菌中可高效表达,表达的融合蛋白具有较强的免疫原性。     

携带肠道病毒71型VPl基因的重组减毒沙门菌的构建和鉴定

目的构建和鉴定能够稳定携带肠道病毒71型（EV71）VPl基因的重组减毒伤寒沙门菌,用于口服EV71DNA疫苗的研发。方法利用DNA重组技术,构建表达EV71VPl蛋白的真核表达质粒VR．EV7lVPl,体外转染Vero细胞后检测目的蛋白体外表达和抗原性,并将该质粒电转化至减毒伤寒沙门菌SL7027。结果酶切鉴定证实构建含EV7lVPl基因的重组质粒,体外表达目的蛋白具有较好的抗原性．并获得稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌。结论成功构建稳定携带肠道病毒71型VPl基因的减毒伤寒沙门菌,为下一步的疫苗研究打下了基础。     

携带肠道病毒71型VP1基因的重组减毒沙门菌的构建和鉴定

目的 构建和鉴定能够稳定携带肠道病毒71型(EV71)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌,用于口服EV71 DNA疫苗的研发.方法 利用DNA重组技术,构建表达EV71 VP1蛋白的真核表达质粒VR-EV71 VP1,体外转染Vero细胞后检测目的 蛋白体外表达和抗原性,并将该质粒电转化至减毒伤寒沙门菌SL7027.结果 酶切鉴定证实构建含EV71 VP1基因的重组质粒,体外表达目的 蛋白具有较好的抗原性,并获得稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌.结论 成功构建稳定携带肠道病毒71型VP1基因的减毒伤寒沙门菌,为下一步的疫苗研究打下了基础.     

携带肠道病毒71型VP1基因的重组减毒沙门菌的构建和鉴定

目的 构建和鉴定能够稳定携带肠道病毒71型(EV71)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌,用于口服EV71 DNA疫苗的研发.方法 利用DNA重组技术,构建表达EV71 VP1蛋白的真核表达质粒VR-EV71 VP1,体外转染Vero细胞后检测目的 蛋白体外表达和抗原性,并将该质粒电转化至减毒伤寒沙门菌SL7027.结果 酶切鉴定证实构建含EV71 VP1基因的重组质粒,体外表达目的 蛋白具有较好的抗原性,并获得稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌.结论 成功构建稳定携带肠道病毒71型VP1基因的减毒伤寒沙门菌,为下一步的疫苗研究打下了基础.     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的分泌表达与性质鉴定

目的 较高效率分泌表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位并鉴定其性质。方法 将编码成熟大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)的基因引入pET22b( )并转化E．coli BL21(DE3)；重组工程菌在改良M9-CAA培养基内进行表达；对分泌表达的LTB进行纯化后进行神经节苷脂(GMl)结合活性、免疫原性与黏膜免疫佐剂活性的鉴定。结果 LTB既能分泌表达至胞周质又能以包含体形式表达，两者都与pelB信号肽准确分离。纯化出的LTB具有正常的GM1结合活性、免疫原性及黏膜免疫佐剂活性。结论 pET22b( )质粒的pelB信号肽可使LTB以较高效率分泌表达。     

Immunogenicity of the Plasmodium falciparum serine repeat antigen (p126) expressed by vaccinia virus.

cDNA encoding the serine repeat antigen (SERA) (also called p126) of Plasmodium falciparum has been isolated from the FCR3 strain and inserted into a recombinant vaccinia virus designated vP870. Expression analysis of vP870-infected Vero cells by immunoprecipitation has demonstrated several intracellular forms of SERA and a single secreted SERA peptide. Endoglycosidase digestion of these immunoprecipitated SERA peptides indicated that the intracellular SERA peptides contain simple, high-mannose N-linked oligosaccharides and that the secreted SERA peptide contains complex N-linked oligosaccharides. Pulse-chase experiments indicate that the multiple intracellular SERA peptides in infected Vero cells represent a trafficking pathway whereby the smallest SERA peptide is converted into larger peptides by co- and posttranslational modifications, including glycosylation, and eventually secreted from the cell with complex N-linked oligosaccharides. To study the immunogenicity of vaccinia virus-expressed SERA, rabbits were immunized with vP870 and their sera were analyzed for reactivity with authentic, parasite-derived SERA protein. The anti-vP870 rabbit sera reacted with P. falciparum-infected erythrocytes by immunofluorescence analysis, recognized authentic SERA from schizonts by both immunoprecipitation and Western blot (immunoblot) analyses, and recognized proteolytically processed fragments of SERA secreted into the culture medium by Western blot analysis. These results indicate that when expressed by vaccinia virus, SERA is glycosylated and secreted from infected cells and that in immunized rabbits, vaccinia virus-expressed SERA can stimulate a humoral immune response against SERA derived from blood-stage parasites.     

重组质粒pYTA/Aβ-HBcAg的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :研究 β 淀粉样肽 (Aβ)与HBcAg的融合基因Aβ HBcAg的原核表达 ,并检测表达的融合蛋白Aβ HBcAg的免疫原性。方法 :从重组质粒 7Z/Aβ HBcAg中 ,切下含Aβ HBcAg的基因片段 ,将其融合于质粒pYTA1的lac启动子之后 ,构建重组表达质粒pYTA/Aβ HBcAg。以此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,在IPTG诱导下表达。超声破碎表达的细菌 ,通过SDS PAGE及考马斯亮蓝染色 ,检测融合蛋白Aβ HBcAg的表达。采用ELISA法检测融合蛋白的反应原性。融合蛋白经饱和硫酸铵盐析法分离和纯化后免疫BALB/c小鼠 ,用ELISA法检测血清中抗 Aβ抗体的滴度。 结果 :融合蛋白以可溶性形式存在于细菌裂解液的上清中 ,其表达量为菌体总蛋白量的 7%。表达的融合蛋白既有Aβ的反应原性 ,又有与HBcAg的反应原性。经 3次免疫后 ,BALB/c小鼠血清中抗 Aβ抗体的滴度最高可达为 1∶16 0 0 0。结论 :融合基因Aβ HBcAg可在大肠杆菌DH5α中表达。表达产物为可溶性蛋白 ,存在于细菌裂解液的上清中 ,具有较强的免疫原性。本研究为正在进行的AD基因工程疫苗的动物实验打下了基础     

含APPβ裂解位点肽及Aβ1-15的嵌合型HBcAg颗粒抗原的制备及其免疫原性分析

目的:构建含APPβ位点裂解肽ABCSP、β-淀粉样肽氨基段15肽(Aβ1-15)及删除了c/e1表位的截短型HBcAg基因的原核表达质粒pET/c-ABCSP-Aβ15-c,并在大肠杆菌中表达,观察融合蛋白C-ABCSP-Aβ15-C形成的病毒样颗粒,检测其免疫原性,为多表位AD基因工程疫苗的研究奠定基础。方法:PCR扩增含APPβ位点裂解肽ABCSP、β-淀粉样肽氨基段15肽(Aβ1-15)的基因,连接于HBcAg的1～71的3’端,再将HBcAg的88～144位氨基酸的基因片断连接于Aβ1-15的基因的3’端,构建重组质粒pUC/c-ABCSP-Aβ15-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET-28a(+)中,构建表达质粒pET/c-ABCSP-Aβ15-c,IPTG诱导表达。用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色,观察重组基因的表达。透射电镜观察融合蛋白形成的病毒样颗粒。融合蛋白经腹腔注射免疫昆明小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗-ABCSP、抗-Aβ抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、DNA序列测定证实,重组基因位于表达质粒之中,其大小、序列与理论设计相符。诱导表达后,SDS-PAGE显示,在细菌裂解液的上清和沉淀中均可见到表达蛋白条带,且以沉淀中为多,约占沉淀总蛋白的40%。纯化后的融合蛋白形成电镜下可观察到的病毒样颗粒。昆明小鼠经融合蛋白免疫5次后,其血清中抗-ABCSP抗体的滴度可达1∶5 000,抗-Aβ抗体的滴度可达1∶10 000,检测不到抗-HBc抗体。结论:c-ABCSP-Aβ15-c融合基因在大肠杆菌中可高效表达,表达的融合蛋白具有较强的免疫原性。     

口服鼠疫F1-V重组融合基因DNA活菌疫苗的构建及免疫原性研究

目的 构建携带鼠疫耶尔森菌F1-V融合基因的重组减毒沙门菌苗,口服免疫Balb/c小鼠检测其免疫原性,为口服鼠疫活载体DNA疫苗研究打下基础.方法 将F1-V融合基因克隆到真核表达载体asd-pVAX1,进一步依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd-pVAX1/F1-V),提取重组质粒转染COS-7细胞并做免疫组化和Western-blot检测F1-V融合蛋白在细胞中的表达.以1×109CFU/只的剂量3次口服免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测血清中抗体水平.结果 构建的重组减毒沙门菌转染COS-7细胞后,免疫组化和Western-blot试验证明F1-V融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清有特异性抗体IgG产生.结论 构建的重组沙门菌能运送DNA疫苗到体内并成功释放质粒刺激机体产生特异性免疫应答,为口服鼠疫活载体DNA疫苗的黏膜免疫研究打下了基础.