HIV-1 Nef通过Erk/Mapk途径调节内皮细胞黏附分子ICAM-1的表达

目的:研究HIV-1Nef基因对内皮细胞ECV304细胞ICAM-1表达的影响及其信号途径。方法:选用Nef基因稳定表达细胞株ECV304-Nef和对照细胞株ECV304pcDNA3.1(+),应用Westernblot分析ECV304-Nef细胞ERK的磷酸化水平,利用ERK磷酸化抑制剂通过Westernblot、流式细胞术分析ECV304-Nef细胞ICAM-1的表达水平与信号分子ERK磷酸化的相关性。结果:Westernblot显示ECV304-Nef细胞ICAM-1和p-ERK蛋白的表达水平均高于对照组;流式细胞术检测结果表明ECV304-Nef细胞和对照组ICAM-1阳性细胞百分率分别为(35.3±2.2)%和(12.5±0.8)%(P0.01)。加入p-ERK抑制剂PD98059后,ECV304-Nef细胞p-ERK水平被显著抑制,ICAM-1降至对照组水平,ECV304-Nef细胞和对照组细胞ICAM-1阳性细胞百分率分别为(11.4±1.1)%和(10.4±1.5)%(P0.05)。结论:HIV-1Nef基因上调血管内皮细胞细胞黏附分子ICAM-1的表达与ERK信号分子磷酸化有关,为HIV-1感染的致病机制及临床治疗提供实验基础。     

HIV-1 Nef基因在THP-1细胞的表达和活性检测

目的将HIV-1 Nef基因转染THP-1细胞,获得稳定表达Nef蛋白的细胞克隆,为研究Nef对巨噬细胞生物学活性的影响奠定实验基础。方法将质粒pcDNA3.1(+)-Nef和pcDNA3.1(+()阴性对照)转染THP-1细胞,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、细胞免疫荧光等方法检测目的蛋白在真核细胞内的表达及定位,采用共转染法将荧光报告基因转染THP-1Nef和THP-13.1细胞,通过测定荧光(RLU)值来评价Nef蛋白的生物学活性。结果转染细胞经G418筛选后获得稳定表达Nef的THP-1细胞株,RT-PCR及Western blot结果表明Nef在真核细胞中成功表达,细胞免疫荧光结果显示,THP-1-Nef细胞表达的Nef蛋白主要定位于细胞质中。荧光酶标仪检测转染了HIV-1LTR-Luc和NFκB-Luc荧光报告基因的THP-1-Nef和THP-1-3.1细胞的RLU值。结论成功建立了THP-1-Nef细胞稳定表达细胞株,检测了其生物学活性,为进一步研究其作用机制实验奠定基础。     

α-黑色素细胞刺激素对ECV304细胞与U937细胞黏附作用的影响

研究α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)对人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞黏附作用的影响,以探讨α-MSH的抗炎与免疫调节机制。以U937细胞与ECV304细胞相互黏附作为实验模型,观察LPS或TNF-α刺激ECV304细胞,以及α-MSH干预后,对U937细胞黏附于ECV304细胞的影响。用不同浓度α-MSH处理ECV304细胞,或在LPS/TNF-α处理的同时加不同浓度的α-MSH培养ECV304细胞,以FACS检测ICAM-1,RT-PCR检测骨桥蛋白(OPN)mRNA,Westernblot检测OPN蛋白表达。结果显示,LPS或TNF-α处理ECV304细胞可增加ECV304细胞与U937细胞的黏附,而α-MSH降低这种黏附作用。α-MSH抑制ECV304细胞表达ICAM-1和OPN蛋白;LPS或TNF-α刺激后,ECV304细胞表达OPN mRNA上调,而α-MSH能抑制LPS或TNF-α的上调作用。这些结果提示,α-MSH可通过降低ICAM-1和OPN的表达抑制炎症时血管内皮细胞与白细胞的黏附。     

海洋放线菌素X2下调柯萨奇病毒B3感染ECV304细胞ICAM-1的表达

目的:观察海洋放线菌素X2对柯萨奇病毒B3(CVB3)感染ECV304细胞细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达的影响。方法:采用MTT法检测不同浓度的海洋放线菌素X2作用病毒后的抑制情况;采用RT-PCR和流式细胞术分别测定CVB3感染的ECV304细胞在海洋放线菌素X2作用前后不同时间点的ICAM-1的mRNA和蛋白的表达水平。结果:CVB3感染ECV304细胞后,ICAM-1蛋白表达在12 h～54 h显著高于正常ECV304细胞对照组(P<0.05);海洋放线菌素X2干预后,于12 h～54 h降低ICAM-1蛋白的表达,与CVB3感染组相比差异有统计学意义(P<0.05);海洋放线菌素X2干预后,于24 h～54 h降低ICAM-1mRNA的表达,与CVB3感染组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:海洋放线菌素X2在病毒吸附前对CVB3具有抗病毒作用,并可下调CVB3诱导的ECV304细胞ICAM-1的mRNA和蛋白的表达。     

HIV-1 nef基因的克隆及原核表达研究

目的:构建HIV-1 Nef基因的原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达,初步优化其表达条件。方法:利用特异性引物PCR扩增获得HIV-1 Nef基因片段,PCR产物经限制性内切酶双酶切后连接载体pET24a(+),构建重组质粒pET24a(+)-Nef。经双酶切鉴定及序列测定后的重组质粒转化入E.coliBL21,IPTG诱导表达目的蛋白,优化表达条件,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定表达产物。结果:PCR扩增获得618bpDNA片段,酶切鉴定结果表明HIV Nef基因已克隆入原核表达载体pET24a(+)中,测序证明序列正确。SDS-PAGE和Western blot分析证实重组菌诱导后可表达相对分子质量(Mr)符合预期的融合蛋白。0.1mmol/LIPTG在37℃诱导6h为最佳表达条件,重组蛋白表达量可由15.8%增加到43.9%。结论:在大肠杆菌中成功地表达了HIV Nef蛋白,并初步获得了最优化的表达条件。     

HAX-1对Jurkat细胞的抗凋亡作用研究

目的 研究HAX-1过表达在T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞中的抗凋亡作用.方法 构建HAX-1真核表达载体pEGFP-C3-HAX-1并转染Jurkat细胞.分别采用RT-PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平上检测HAX-1的表达,然后通过光镜、电镜以及TUNEL法检测在去血清培养、电子线照射以及地塞米松诱导等不同处理因素下HAX-1过表达Jurkat细胞的凋亡情况.结果 构建的表达载体经酶切和测序鉴定序列正确,载体构建成功;PCR 及 Western blot 结果表明,转染后HAX-1的表达水平明显高于对照组(P＜0.01);经检测过表达HAX-1的Jurkat细胞具有明显的抗凋亡作用,能够对抗去血清培养、电子线照射以及地塞米松诱导等的凋亡诱导作用.结论 HAX-1基因在Jurkat细胞中过表达具有明显的抗凋亡作用.     

HIV-1病毒Nef基因克隆、表达、纯化及其抗体的制备

目的:运用基因工程方法制备HIV-1 Nef重组蛋白及其抗体.方法:用PCR技术从HIV-1 H×B2质粒中扩增HIV-1 Nef基因,将测序鉴定过的HIT-1 Nef基因克隆到原核表达载体pET28a( )上,应用酶切鉴定、测序、SDS-PAGE及Western blot等方法鉴定基因片段的正确性及表达蛋白的特异性.纯化的重组蛋白免疫兔3次后,ELISA法测定兔多克隆抗体滴度.用其制备的多克隆抗体通过免疫组织化学方法测定表达Nef基因的内皮细胞.结果:成功地构建了Nef基因的原核表达质粒,测序证明HIV-1 Nef基因全长为621 bp,编码206个氨基酸.在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白为包涵体的形式.HIV-1 Nef蛋白N端融合6×His标签便于纯化及鉴定.获得的高纯度HIT-1 Nef融合蛋白,免疫动物后,可产生特异的高滴度抗体(ELISA滴度达1∶10000).将转染Nef基因的内皮细胞,应用免疫组化的方法证明其抗体有高度的特异性.结论:构建了高表达HIT-1 Nef蛋白的原核表达系统,制备的Nef重组蛋白免疫动物,获得了特异、高效价的抗体,为研究Nef基因的生物学活性提供了实验材料和依据.     

ICAP1a及突变体T38A、1138A在内皮细胞ECV304整合素β1内化中的作用

目的:探讨ICAP1α及突变体T38A、I138A在内皮细胞ECV304内化整合素β1中的作用和机制.方法:构建pAAV-ICAP1α及其突变体pAAV-T38A和pAAV-I138A真核表达载体,转染ECV304.ECV304分为ICAP1α组、T38A组、I138A组、绿色荧光蛋白(GFP)组和未转染组,用NHS-SS-Biotin标记整合素β1,并利用生物素-亲和素系统以及Western blot检测整合素β1内化情况.结果:各组细胞转染的质粒均稳定表达;Western blot检测ICAP1α组,T38A组、I138A组、GFP组、未转染组内化的整合素β1相对光密度值分别为1.07±0.04、0.68±0.06、0.70±0.02、0.87±0.06、0.88±0.04;与GFP组和未转染组比较,ICAP1α组整合素β1内化明显增多(P<0.05);与GFP组、未转染组和ICAP1α组比较,T38A组和I138A组整合素β1内化明显减少(P<0.05),GFP组与未转染组无差别(P＞0.05).结论:转染ICAP1α后内皮细胞ECV304表面整合素β1内化增加,而转染T38A和I138A后内皮细胞ECV304表面整合素β1内化减少;ICAP1α可能通过第38位的苏氨酸残基(38Tyr)和第138位的异亮氨酸残基(138Ile)调控整合素β1的内化.     

牙龈卟啉单胞菌在单核细胞对内皮细胞黏附作用中的影响

目的 观察牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)W83和ATCC33277株侵入在单核细胞对内皮细胞黏附作用中的影响,及在内皮细胞细胞间黏附分子l(ICAM-1)转录和翻译中的作用. 方法 建立体外P.gingivalis侵入内皮细胞模型,孟加拉玫瑰红活细胞染色法测定P.gingivalis侵入前后单核细胞对内皮细胞黏附的变化;RT-PCR和mRNA比色定量法检测内皮细胞ICAM-1基因表达;West-ern blot检测ICAM-1蛋白水平的变化. 结果 P.gingivalis W83和ATCC33277株侵入可增加单核细胞对内皮细胞的黏附,抗ICAM-1抗体部分抑制P.gingivalis侵入介导的单核细胞对内皮细胞黏附增加;P.gingivalis侵入上调内皮细胞ICAM-l基因和蛋白的表达,W83诱导单核细胞对内皮细胞黏附增强及内皮细胞ICAM-1表达的能力强于ATCC33277. 结论 ICAM-1在P.gingivalis介导的单核细胞对内皮细胞黏附增强过程中起部分作用,P.gingivalis侵入内皮细胞诱导ICAM-1表达可能是其诱发动脉粥样硬化疾病的机制之一.     

促炎因子白细胞介素-1参与缺氧/复氧损伤的体外研究

目的研究促炎因子IL-1参与缺氧/复氧损伤的可能机制,探讨保护缺氧/复氧损伤的方法.方法 ECV304细胞株接种于培养瓶中,随机分为A、B、C、D四组,D为正常对照组,A组为实验组,行缺氧(60min)/复氧(240 min)培养,B、C组分别与IL-1和IL-1α受体拮抗剂共孵育.测定各组细胞的成活率,并应用细胞免疫组化分析ECV304细胞表面黏附分子的表达水平.结果经不同试剂培养后,各组细胞的成活率明显不同,A、B组显著低于D组,尤以B组为最;细胞形态学也发生相应改变;H/R孵育后ECV304细胞株表达ICAM-1和E-selectin增加,外源性IL-1可以进一步上调ICAM-1和E-selectin的表达,而IL-1受体拮抗剂则可明显抑制这种增多现象.结论缺氧/复氧损伤过程中产生的内源性IL-1在调控ICAM-l和E-selectin的表达及中性粒细胞的黏附中发挥着重要作用;采取措施降低IL-1的生物学活性,可能为临床治疗缺氧/复氧损伤提供新的途径.     

Triamcinolone acetonide modulates permeability and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) expression of the ECV304 cell line: implications for macular degeneration

Whilst animal studies and a pilot clinical trial suggest that intravitreal triamcinolone acetonide (TA) may be useful in the treatment of age-related macular degeneration (AMD), its mode of action remains to be fully elucidated. The present study has investigated the capacity of TA to modulate the expression of adhesion molecules and permeability using a human epithelial cell line (ECV304) as a model of the outer blood-retinal barrier (BRB). The influence of TA on the expression of ICAM-1 and MHC-I was studied on resting and phorbol myristate acetate (PMA)- or interferon-gamma (IFN-gamma)- and/or tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha)-activated cells using flow cytometry and immunocytochemistry. Additionally, ECV304 cells were grown to confluence in uncoated Transwell chambers; transepithelial resistance (TER) across resting and PMA-activated cells was monitored. TA significantly decreased the paracellular permeability of ECV304 cells and down-regulated ICAM-1 expression, consistent with immunocytochemical observations. PMA-induced permeability changes were dose-dependent and TA decreased permeability of both resting and PMA-activated monolayers. MHC-I expression by ECV304 cells however, was not significantly affected by TA treatment. The modulation of TER and ICAM-1 expression in vitro correlate with clinical observations, suggesting re-establishment of the BRB and down-regulation of inflammatory markers are the principal effects of intravitreal TA in vivo. The results further indicate that TA has the potential to influence cellular permeability, including the barrier function of the retinal pigment epithelium (RPE) in AMD-affected retinae.     

抑制ECV304细胞内EOLA1基因表达后效应观察

目的观察抑制人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞内内皮高表达脂多糖相关因子1（endothe-lial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1）基因表达后细胞生长的变化。方法构建EGFP-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2/EOLA1,转染ECV304细胞,G418压力筛选获得稳定表达株;设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ和HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上。转染重组质粒到稳定表达EGFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,检测靶基因的抑制情况,观察EOLA1表达被抑制后细胞生长的改变。结果抑制EOLA1表达后ECV304细胞生长明显减慢。结论EOLA1基因在细胞内参与了细胞生长的调控。     

海洋放线菌素X2对CVB3感染ECV304细胞VCAM-1表达的影响

目的研究柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CVB3)感染ECV304细胞后,血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesionmolecule,VCAM-1)的表达变化及海洋放线菌素X2对CVB3感染ECV304细胞VCAM-1表达的影响。方法采用MTT法检测不同浓度的海洋放线菌素X2作用病毒后的抑制情况;采用RT-PCR和FCM分别测定CVB3感染的ECV304细胞在海洋放线菌素X2作用前后不同时间点的VCAM-1的mRNA和蛋白的表达水平。结果海洋放线菌素X2在病毒吸附前对CVB3的SI为63.88。正常状态下ECV304细胞基本无VCAM-1 mRNA表达,CVB3感染ECV304细胞促进VCAM-1 mRNA表达,感染12 h达到最高峰,6～54 h时VCAM-1 mRNA水平,与细胞对照组相比CVB3感染组差异有统计学意义(P<0.05)。CVB3感染ECV304细胞后,VCAM-1蛋白表达在12～48 h显著高于正常ECV304细胞对照组(P<0.05)。海洋放线菌素X2干预后,于12～54 h降低ECV304细胞VCAM-1 mRNA的水平,12～24 h降低VCAM-1蛋白的表达,与CVB3感染组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论海洋放线菌素X2在病毒吸附前对CVB3具有抗病毒作用,并可下调CVB3诱导的ECV304细胞VCAM-1的mRNA水平和蛋白的表达。     

血管内皮细胞(ECV304)表达的HLA-G1对NK细胞杀伤活性的抑制作用

目的:证实HLA-G1分子能够抑制NK细胞对同种血管内皮细胞系的杀伤作用。方法:采用脂质体介导的DNA转染技术,以构建的真核表达质粒pcDNA3-HLA-G1转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,再用免疫荧光法检测表达的HLA-G1分子。并用MTT比色法检测HLA-G1对NK细胞杀伤活性的影响。结果:ECV304细胞上可稳定表达HLA-G1。NK细胞对空质粒pcDNA3转染的ECV304细胞的杀伤率为(50.6±18.1)%;而对pcDNA3-HLA-G1转染的ECV304细胞的杀伤率为(29.7±11.4)%,两者差异具有显著意义(P<0.01)。结论:HLA-G1分子可明显抑制NK细胞对同种血管内皮细胞的杀伤效应。     

Functional characterization of HIV-1 Nef mutants in the context of viral infection

Nef is an important pathogenesis factor of HIV-1 with a multitude of effector functions. We have designed a broad panel of isogenic viruses encoding defined mutants of HIV-1(SF2) Nef and analyzed their biological activity in the context of productive HIV-1 infection. Analysis of subcellular localization, virion incorporation, downregulation of cell surface CD4 and MHC-I, enhancement of virion infectivity and facilitation of HIV replication in primary human T lymphocytes mostly confirmed the mapping of Nef determinants previously reported upon isolated expression of Nef. However, reduced activity in downregulation of CD4, infectivity enhancement and virion incorporation of a Nef variant (Delta12-39) lacking an amphipatic helix required for binding of a cellular kinase complex and the association of Nef with MHC-I/AP-1 suggested a novel role of this N-terminal motif. The SH3 binding motif of Nef was partially required for infectivity enhancement and replication but not for receptor downmodulation. In contrast to previous results obtained using other Nef alleles, non-myristoylated SF2-Nef was only partly defective when expressed during HIV infection and was present in HIV-1 particles. Importantly, incorporation of Nef into HIV-1 virions was not required for any of the tested Nef activities. Altogether, this study provides a broad characterization and mapping of multiple Nef activities in HIV-infected cells. The results emphasize that multiple activities govern Nef's effects on HIV replication and argue against a role of virion incorporation for Nef's activity as pathogenicity factor.     

脱氢表雄酮对抗LDL和OX-LDL所致ECV304细胞的损伤

目的：观察脱氢表雄酮（DHEA）对抗LDL及OX-LDL所致ECV304细胞的损伤作用，探讨DHEA可能的抗AS作用机制。 方法: 采用培养的ECV304细胞, 应用硝酸还原酶、放免及SABC免疫组化等方法观察经DHEA预处理及与LDL或OX-LDL混合作用后的细胞培养液中NO2-/NO3-、ET-1水平及细胞表面ICAM-1的表达。 结果: LDL可明显地减少培养液中NO2-/NO3-的含量，增加细胞ICAM-1的表达，但不影响ET-1的分泌；OX-LDL可明显减少培养液中NO2-/NO3-的含量、升高ET-1的水平，同时上调细胞表面ICAM-1的表达； 在预处理条件下，DHEA可升高LDL作用后细胞培养液中NO2-/NO3-的含量、下调ICAM-1的表达，但在混合培养条件下无此作用；在预处理及混合培养条件下，DHEA均可升高OX-LDL作用后细胞培养液中NO2-/NO3-的含量、减少细胞ET-1分泌以及下调ICAM-1的表达。 结论: LDL和OX-LDL对ECV304细胞具有明显的毒性作用，两者作用机制不尽相同。DHEA可能通过对ECV304细胞内部结构和功能的调节或通过其对OX-LDL分子的直接作用而发挥保护作用。     

血小板对ECV304细胞PTA1表达和PDGF释放的影响

目的:探讨血小板对妊高征患者血清刺激下的ECV304细胞(ECV304)表达人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)和释放血小板衍生生长因子(PDGF)的影响。方法①用间接免疫荧光染色结合流式细胞仪分析观察血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PTA1的表达②用ELISA方法检测血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PDGF的量。结果:①血小板与妊高征患者血清刺激(24h、48h)的ECV304细胞孵育后PTA1表达的百分率(6.32%、4.13%)明显低于对照组(15.51%、5.64%)(P<0.05)。②妊高征患者血清刺激ECV304细胞8h、24h、48h释放PDGF的量(1593、2625、2175ng/L)明显高于正常孕妇组(235、405、133.5ng/L)差异显著(P<0.01)。③血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育后,24h、48h细胞培养上清液中PDGF-B的量又进一步增加(3266、2360ng/L),与对照组比差异显著(P<0.05)。结论:ECV304细胞与血小板之间的黏附可能是通过PTA1分子发挥作用的,同时导致了PDGF的进一步释放。     

Orientia tsutsugamushi induced endothelial cell activation via the NOD1-IL-32 pathway

Orientia tsutsugamushi (OT), the causative agent of scrub typhus, is an obligate intracellular bacterium. In order to verify the inflammatory responses involved in the pathogenesis of scrub typhus, we assessed the cytokine profile of the human endothelial cell line, ECV304, after OT infection. We noted that CCL5, CCL17, IL-1α, IL-6, IL-8, IL-10, IL-15, TNF-α and TNF-β were strongly induced in response to OT. Additionally, IL-32, the candidate modulator for the induction of IL-6 and IL-8, was increased significantly with OT infection and these increases coincided with NOD1 pathway activation. Thus, we hypothesized that NOD1 pathway and IL-32 might act on cytokine release in endothelial cells as a modulator of the inflammation caused by OT infection. NOD1 siRNA resulted in a reduction in IL-32 levels, and also reduced IL-1β, IL-6, IL-8, and ICAM-1 expression in OT-infected ECV304 cells. These changes in IL-1β, IL-6, IL-8, and ICAM-1 induced by NOD1 knockdown were reversed as the result of IL-32 treatment. This indicated that OT infection activated the NOD1 pathway followed by IL-32 secretion, thus resulting in the production and expression of IL-1β, IL-6, IL-8, and ICAM-1. Therefore, IL-32 might perform a role upstream of the inflammatory reaction in endothelial cells of OT infection.