鹦鹉热嗜衣原体蛋白酶样活性因子免疫优势区基因重组蛋白的诊断应用研究

目的 检测鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci,Cps)蛋白酶样活性因子(chlamydial protease-like activity factor,CPAF)免疫优势区基因在E.coli BL21中高效表达的产物在Cps感染诊断中的应用,为建立Cps感染的快速诊断奠定实验基础.方法 利用生物信息学软件筛选出Cps CPAF免疫优势区基因序列(CPAFm,A196～A450),设计特异性引物,PCR扩增目的基因,将其克隆入pGEX6p-2载体后转化E.coli BL21,利用IPTG诱导表达重组蛋白,Western blot鉴定重组蛋白.以纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立血清学诊断的间接ELISA法;同时用商品ELISA试剂盒与建立的间接ELISA法检测180份可疑Cps感染的病鸭血清标本,将检测结果进一步用Western blot方法验证.结果 构建原核重组质粒pGEX6p-2/CpsCPAFm,表达相对分子质量约为54×103的目的蛋白产物.以纯化的重组蛋白为包被抗原建立间接ELISA法检测Cps参考血清,其阴、阳性符合率均为100％;与肺炎嗜农原体(C.pneumoniae,Cpn)、沙眼衣原体(C.trachomatis,Ct)无交叉反应.对180份可疑病鸭血清标本进行检测,与商品Birds Chlamydia Psittaci IgG ELISA试剂盒比较,以Western blot方法作对照,自建的ELISA法符合率均为100％,Birds Chlamydia Psittaci IgG ELISA Kit符合率为77.5％～95.0％.结论 以Cps CPAF免疫优势区(A196～A450)作为诊断抗原,建立血清学诊断的间接ELISA法具有较好的临床诊断价值.     

重组猪戊型肝炎病毒ORF2区主要抗原域的原核表达及鉴定

目的：在大肠杆菌中表达猪戊型肝炎病毒ORF2区主要结构蛋白,并对其进行血清学鉴定。方法：通过RT-PCR技术从一份猪粪中扩增并克隆戊型肝炎病毒主要的结构基因片段,将该片段插入pET-32a表达载体,在原核系统中融合表达蛋白,Western blot和间接ELISA方法分析该蛋白的抗原性。结果：SDS-PAGE分析结果表明,获得45kD的目的蛋白,该重组蛋白可以与HEV阳性血清反应,而不与阴性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性。结论：本研究获得了猪戊型肝炎病毒重组抗原,可与HEV阳性血清产生特异性的结合反应,可以作为诊断用的重组蛋白,为研制敏感、特异的HEV诊断试剂盒,行之有效的HEV基因工程疫苗及为HEV感染的预防和临床治疗提供资料。     

登革病毒特异性抗原片段的筛选鉴定及其ELISA方法的建立

目的 筛选、鉴定登革病毒共同及型特异性抗原,用纯化抗原建立检测登革病毒抗体的ELISA方法.方法 分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对登革病毒1～4型、流行性乙型脑炎及黄热病毒M、E、NS1蛋白进行分析,预测可能的抗原表位.并根据表位位置和氨基酸序列的相似性,分析登革病毒的共有及型特异性抗原表位,并参考GenBank中的序列信息进行比对,分析其在不同登革病毒株中的保守性.然后选择预测得分值较高的表位,利用pET32a、pMAl-c2x原核表达系统进行原核表达,Western blot验证其免疫学反应特异性.Western blot检测阳性抗原片段经亲和纯化后,包被ELISA微孔板,并对ELISA反应条件进行系统优化.结果经系统的生物信息学分析,共预测获得登革病毒抗原表位18个,登革病毒型特异性抗原表位25个,并对其中得分值较高的5段进行了高效表达,经Western blot分析,获得登革1～4型(Den-Ag5),登革2、4型(Den-Ag3),登革1～3型(Den-Ag2)病毒共同抗原片段各一段,登革1、2、4型( Den-Ag1、Den-Ag4)共同抗原片段两段,与流行性乙型脑炎病毒、黄热病毒及所用甲病毒多克隆抗体均无交叉反应.选择Den-Ag5、Den-Ag1和Den-Ag2作为检测用抗原,建立了检测登革病毒抗体的ELISA方法,初步应用表明,所建立方法具备良好特异性,可检测50～200倍稀释的患者血清,S/N比值均在15以上.结论 经系统筛选,获登革病毒特异性抗原片段5段,并建立了检测登革病毒抗体的ELISA方法.     

甲型肝炎病毒P1B、P2A、P3AB和P3D蛋白在原核系统中的表达和抗原活性分析

目的研究甲型肝炎病毒P1B、P2A、P3AB和P3D在原核系统中的表达,并探讨这些蛋白的抗原活性和作为诊断抗原的应用价值。方法采用PCR方法,从克隆有HAV HM175株全长cDNA基因的克隆载体pHAV16H1上扩增出目的基因,以M47作为表达载体,构建N端带硫氧还蛋白的重组表达质粒。重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达。采用DEAE阴离子交换和镍离子柱螯和亲和层析纯化的方法对重组蛋白进行纯化。以Western Blot和间接ELISA的方法检测重组蛋白的抗原活性。结果四个重组质粒经测序证明构建正确无误,在大肠埃希菌中表达四个蛋白的相对分子质量也正确无误。Western Blot分析和间接ELISA方法证实四个蛋白中只有p2a有抗原活性。结论原核表达的P2a蛋白,具有较好的抗原活性,在间接ELISA方法中检测出了所有的24份阳性血清和24份阴性血清,非常有希望做成诊断抗原用于诊断急性甲肝患者和区分甲型肝炎自然感染与注射疫苗所产生的不同免疫。     

鸡白痢沙门菌SpiC蛋白的原核表达及其应用

目的进行鸡白痢沙门菌Spi C蛋白原核表达并建立以Spi C蛋白为检测抗原的间接ELISA。方法以鸡白痢沙门菌S06004基因组DNA为模板,PCR扩增384 bp的spi C基因。将spi C基因克隆至原核表达载体p ET30a中,构建重组原核表达质粒p ET30a-spi C,再转化到表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,纯化His-Spi C蛋白,建立Spi C蛋白为检测抗原的间接ELISA并检测临床血清样品。结果通过对诱导后重组菌裂解产物进行SDS-PAGE和Western blot分析,重组菌可以表达相对分子质量(Mr)约19 200的可溶性重组蛋白His-Spi C。重组蛋白GST-Spi C免疫无特定病原体鸡,所获得的高免血清能识别重组蛋白His-Spi C,表明体外表达的重组蛋白His-Spi C有良好的免疫反应原性。所建立的以重组蛋白His-Spi C介导的间接ELISA有较好的特异性,能够区分spi C基因缺失型疫苗候选株免疫与野生菌自然感染。结论重组蛋白His-Spi C呈可溶性表达,具有良好的免疫原性,以重组蛋白His-Spi C建立的间接ELISA,可以作为区分感染和免疫动物(DIVA)鸡白痢疫苗免疫的鉴定方法。     

新疆出血热病毒核蛋白多克隆抗体的制备及其免疫学评价

目的 原核细胞中表达、纯化新疆出血热病毒BA88166毒株核蛋白(NP)并制备及鉴定抗NP蛋白的多克隆抗体.方法 采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出BA88166毒株S基因的cDNA片段,将其构建到原核表达载体pET-32a上,形成重组原核表达质粒pET-88166S.构建好的质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,经镍柱亲和层析法纯化NP-His融合蛋白,SDS-PAGE分析蛋白相对分子质量(Mr).用该纯化蛋白免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blot法检测血清效价和特异性.结果 双酶切鉴定和DNA测序证实构建的pET-88166S重组表达载体正确,目的基因序列与GenBank中公布的序列一致,在E.coli BL21中表达的NP-His融合蛋白经SDS-PAGE分析,其Mr约为66000.ELISA检测抗体效价高于1:25600,蛋白免疫印迹实验结果表明抗体能特异性识别新疆出血热病毒YL04057毒株的NP蛋白及其截短蛋白.结论 成功获得新疆出血热病毒NP-His融合蛋白,得到了特异性兔抗NP蛋白多克隆抗体.     

B细胞特异激活蛋白基因Pax5原核表达、纯化及多克隆抗体制备研究

目的克隆人B细胞特异激活蛋白基因Pax5,并实现Pax5的原核表达、纯化及多克隆抗体制备。方法从人淋巴瘤细胞株Raji提取总RNA,用RT-PCR扩增Pax5基因片段,克隆至pMD19-T载体,双酶切及基因测序鉴定后,再定向插入原核表达载体pET28a中,并转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达目的蛋白,进行SDS-PAGE分析,纯化后进行Western blot分析,用原核表达蛋白制备兔抗Pax5抗血清。利用免疫荧光染色法观察Raji细胞中的Pax5表达情况。结果克隆得到的目的基因片段大小与预期相符,测序结果与GenBank中报道的序列完全一致,成功构建了重组表达质粒pET28a-Pax5,并获得目的蛋白。Western blot检测原核表达Pax5蛋白相对分子质量约为42 000,经镍离子金属螯合柱纯化后,纯度达95%以上。兔抗Pax5抗血清ELISA效价可达1∶256 000。免疫荧光染色结果显示Raji细胞中Pax5高表达。结论本研究在原核系统中成功表达了Pax5重组蛋白,并制备多克隆抗体,为开发B淋巴细胞白血病诊断试剂盒提供了实验数据。     

人抗凝血酶Ⅲ的表达及其抗血清的制备

目的 用大肠杆菌系统表达重组的抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ),制备其抗血清并测定效价.方法 利用基因克隆技术获得AT-Ⅲ基因片段,构建原核表达质粒pET32a(+)-AT-Ⅲ,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达、蛋白纯化并免疫兔,间接ELISA、Western blot法检测抗血清.结果 SDS-PAGE、Western blot法检测原核表达蛋白结果显示,在相对分子质量(Mr)77 000附近出现特异性条带.对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备AT-Ⅲ抗血清,间接ELISA方法检测抗血清的最高效价可达到1∶12 800,Western blot分析表明抗血清可与293T、CHO细胞表达的AT-Ⅲ蛋白及AT-Ⅲ蛋白纯品特异性结合.结论 成功制备了人抗凝血酶Ⅲ抗血清.     

沙眼衣原体CPAF免疫活性区域重组蛋白的表达及在临床诊断中的应用

目的分析沙眼衣原体(Ct)蛋白酶样活性因子(CPAF)免疫优势区的免疫活性,探讨其在Ct感染诊断中的应用价值。方法构建原核表达重组质粒pGEX-6p-2/CPAF′,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用该纯化的表达产物包被酶标板,建立间接ELISA检测病人血清中的Ct特异性IgM和IgG抗体,同时与晶美公司Ct ELISA试剂盒检测结果进行对比分析。结果含pGEX-6p-2/ CPAF′的大肠杆菌BL21大量表达相对分子质量(M_r)约为43×10~3的目的蛋白,用该重组蛋白包被酶标板,建立间接ELISA检测Ct IgM、IgG阴性和阳性参考血清各50份,符合率均为100%;同时检测250份临床血清标本,与晶美公司ELISA试剂盒检测结果的符合率IgM为96.8%,IgG为98.4%。结论表达的Ct CPAF免疫优势区(AA_(200)～AA_(338))重组蛋白具有良好的免疫反应活性,可望用于Ct感染的临床诊断。     

TP47蛋白在梅毒血清学诊断中的应用

目的采用原核基因工程技术重组表达梅毒螺旋体TP47蛋白,探讨其在梅毒血清学诊断中的应用。方法PCR扩增获得TP47基因片段并构建pET28b-TP47原核表达重组质粒,转化到大肠杆菌BL21中,以IPTG诱导蛋白质表达。经镍柱纯化后通过质谱技术进行鉴定。采用免疫印迹法测定其与梅毒患者血清的免疫反应性。建立基于重组TP47抗原的ELISA间接法并对30份TPPA阳性血清和75份TPPA阴性血清进行方法学验证。结果PCR扩增获得约1．1kb的基因片段,成功构建原核表达载体pET28b-TP47。重组蛋白在细菌中以包涵体形式表达,约占菌体蛋白含量的70％,分子量约39000Mr,经纯化后其纯度约95％。经质谱分析表明重组蛋白为TP47蛋白。免疫印迹法证实TP47蛋白能够与梅毒患者血清发生特异性反应,ELISA测定TPPA阳性血清和阴性血清的符合率分别为97％（29／30）和97％（73／75）。结论通过DNA重组技术成功获得了梅毒螺旋体TP47蛋白,证实其与梅毒阳性血清具有良好的反应性,为研发新一代梅毒感染诊断试剂盒奠定了基础。     

乙型脑炎病毒E蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的：用巴斯德毕赤酵母系统表达乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白。方法：将JEV E蛋白基因亚克隆人真核表达载体pPIC9K，以电穿孔法转化酵母SMD1168。用MD平板筛选重组子、G418筛选高拷贝转化子，经甲醇诱导表达后，SDS—PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果：由于糖基化不同，所表达产物的相对分子质量(Mr)约为113000和78000，表达量约为50mg/L。结论：在巴斯德比赤酵母中成功地表达了JEVE蛋白，为制备JEV的诊断抗原和基因工程重组疫苗打下基础。     

Japanese encephalitis virus interacts with vimentin to facilitate its entry into porcine kidney cell line

Japanese encephalitis virus (JEV) requires the presence of an inexplicable cellular receptor on the surface of the host cell for its entry into the cell. The JEV envelope (E) protein has been shown to play an important role in attachment to cells. By using a widely accepted technique, virus overlay protein binding assay (VOPBA), a protein molecule of approximately 60 kDa, identified as vimentin by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI TOF), was recognized on porcine kidney (PS) cells as a possible receptor for JEV. Further, anti-vimentin monoclonal antibodies were able to block JEV entry into the PS cells. Additionally, co-immunoprecipitation assay confirmed that vimentin protein present on the PS cells interacts with the JEV-E protein. These observations indicate that vimentin serves as a putative receptor for JEV in porcine kidney cells.     

Cross protection against lethal West Nile virus challenge in mice immunized with recombinant E protein domain III of Japanese encephalitis virus

Japanese encephalitis virus (JEV) and West Nile virus (WNV) are closely related mosquito-borne flaviviruses that cause severe encephalitic diseases with global impact. Cross protection among JEV and WNV has been previously described, and most cross reactive epitopes were identified within the domain II of E protein (EDII). In this study, the E protein domain III (EDIII) of JEV was successfully expressed in Escherichia coli, purified by a Ni-NTA column and characterized by Western blotting assay. Competitive inhibition assay showed that this recombinant JEV EDIII blocks the entry of JEV into BHK-21 cells. Mice immunized with the recombinant JEV EDIII developed high IgG and neutralizing antibodies titers against JEV. Most importantly, antibodies induced by JEV EDIII could neutralize WNV in vitro and partially protected mice against lethal WNV challenge. These results demonstrate that immunization with JEV EDIII induces cross-protective immunity against WNV infection, indicating a possible role of EDIII for the cross-protection among flavivirus.     

Secretion of noninfectious dengue virus-like particles and identification of amino acids in the stem region involved in intracellular retention of envelope protein

DNA plasmids that express flavivirus premembrane/membrane (prM/M) and envelope (E) proteins in the form of virus-like particles (VLPs) have an excellent potential as DNA vaccine candidates against virus infection. The plasmid-expressed VLPs are also useful as safe, noninfectious antigens in serodiagnostic assays. We have constructed plasmids containing the prM/M and E gene regions for DENV-1, -3, and -4 that express and secrete VLPs when electroporated into Chinese hamster ovary cells. Constructs containing the full-length DENV-1 E protein gene did not secrete VLPs into tissue culture fluid effectively. However, a 16-fold increase in ELISA titers of DENV-1 VLPs was achieved after replacing the carboxy-terminal 20% region of DENV-1 E protein gene with the corresponding sequence of Japanese encephalitis virus (JEV). DENV-3 plasmids containing either the full-length DENV-3 E protein gene or the 20% JEV sequence replacement secreted VLPs to similarly high levels. Whereas DENV-4 VLPs were secreted to high levels by plasmids containing the full-length DENV-4 E protein gene but not by the chimeric plasmid containing 20% JEV E replacement. Domain substitutions by replacing prM/M protein stem-anchor region with the corresponding prM/M stem-anchor region of JEV or DENV-2 in the chimeric DENV-4 construct failed to promote the secretion of DENV-4 VLPs. Using the DENV-2 chimeric plasmid with carboxy-terminal 10% of JEV E gene, the sequence responsible for intracellular localization of E protein was mapped onto the E-H1 alpha-helix domain of DENV-2 E protein. Substitution of three amino acids from the DENV-2 sequence to the corresponding amino acids in the JEV sequence (I398L, M401A, and M412L) in the E-H1 was sufficient to promote extracellular secretion and resulted in detectable titers of DENV-2 VLP secretion.     

中国基因3型乙型脑炎病毒E基因分子特征

目的 以减毒活疫苗(SA14-14-2株)为对照,分析我国分离的基因3型乙脑病毒E基因区段核苷酸及氨基酸序列分子特征.方法 从GenBank中获取相应乙脑病毒株E基因区段核苷酸序列,通过Clustal X(1.81)、DNAStar、GENEDOC(3.2)等生物学软件进行核苷酸和氨基酸位点差异分析.以蜱传脑炎病毒可溶性蛋白晶体结构为模板进行乙脑病毒E蛋白氨基酸位点分析.结果 我国不同地域、不同宿主分离的基因3型乙脑病毒与SA14-14-2株核苷酸同源性分别在96%和95%以上,氨基酸同源性在95%和94%以上.在同一地域、同一宿主类型分离的毒株之间核苷酸和氨基酸同源性非常高.在E基因区段存在10处共同的氨基酸位点差异,在结构域Ⅰ(E160)、结构域Ⅱ(E123和E227)和两个未在结构域中的氨基酸位点(E441和E487)等5个位点在部分基因3型乙脑病毒中存在差异.结论 我国分离的基因3型乙脑病毒与减毒活疫苗株(SA14-14-2株)E基因区段同源性高,存在5处基因3型乙脑病毒特异的氨基酸位点差异,但现行减毒活疫苗株理论上可以保护我国分离的基因3型乙脑病毒野毒株.     

Characterization of Japanese encephalitis virus envelope protein expressed by recombinant baculoviruses

Recombinant baculoviruses containing the coding sequences of the viral structural proteins, i.e., the capsid (C) protein, the precursor to premembrane (preM) protein, and the envelope (E) protein, as well as a nonstructural protein, NS1, of Japanese encephalitis virus (JEV) were constructed. Infection of Spodoptera frugiperda cells with these recombinant viruses produced PreM and E proteins. The E proteins synthesized by the recombinants were shown to be glycosylated and similar in size to the authentic E protein. The E protein was found on the surface of infected cells. The antigenic properties of recombinant E proteins were evaluated using a panel of monoclonal antibodies produced against JEV E protein. It was demonstrated that all of the epitopes detectable on the authentic JEV E protein were present on the recombinant E protein expressed by a recombinant baculovirus containing the coding sequence for a part of C, PreM, E, and a part of NS1 proteins. However, for E protein expressed by a recombinant baculovirus having the coding sequence of only a part of PreM, but all of E and a part of NS1, one of the flavivirus cross-reactive epitopes was not detected. Mice immunized with cells infected with the recombinant baculoviruses developed neutralization antibodies.     

Expression of Japanese encephalitis virus envelope protein in transgenic tobacco plants

The virus envelope (E) protein of Japanese encephalitis virus induces virus-neutralizing antibodies and is therefore a potential vaccine antigen. In a mammalian system, co-expression of another viral structural protein prM is necessary for proper expression and folding of E protein. Transgenic tobacco plants were produced carrying JEV cDNA encoding prM and E proteins under the control of the CaMV 35S promoter. E protein, however, was not detectable in these plants. In vitro translation studies showed that the presence of the prM sequence inhibited transgene expression in the plant system. Accordingly, JEV E protein could be expressed in transgenic tobacco plants only without the prM protein.     

登革2型病毒ZSO1／01株E蛋白在真核细胞中的分泌表达研究

目的对登革2型病毒（DENV-2）ZSO1／01株E蛋白在哺乳动物细胞及昆虫细胞中的分泌表达进行研究。方法RT．PCR扩增DENV-2prM／E基因,通过融合PCR在prM基因前添加来自乙型脑炎病毒的信号肽序列,并将E基因羧基末端20％区域缺失或替换为乙型脑炎病毒SA14-2株E基因相应序列,将上述基因元件分别克隆人哺乳动物细胞表达载体pcDNA5／FRT及昆虫细胞表达载体pAcUW51-M中,将重组质粒转染293T细胞或Sf9细胞,利用间接免疫荧光（Immunofluoreseence assay,IFA）及Western Blot检测E蛋白的表达与分泌。结果各重组质粒分别转染293T细胞或Sit）细胞后,E蛋白在细胞内均有效表达,而仅有携带乙脑信号肽且缺失或替换E基因羧基末端20％区域的重组质粒转染293T细胞后,上清中可检测到明显的E蛋白分泌。结论信号肽及E基因羧基末端20％区域对登革病毒E蛋白的分泌至关重要,宿主细胞对其亦有一定影响。     

登革2型病毒ZS01/01株E蛋白在真核细胞中的分泌表达研究

目的 对登革2型病毒(DENV-2)ZS01/01株E蛋白在哺乳动物细胞及昆虫细胞中的分泌表达进行研究.方法 RT-PCR扩增DENV-2 prM/E基因,通过融合PCR在prM基因前添加来自乙型脑炎病毒的信号肽序列,并将E基因羧基末端20%区域缺失或替换为乙型脑炎病毒SA14-14-2株E基因相应序列,将上述基因元件分别克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA5/FRT及昆虫细胞表达载体pAcUW51-M中,将重组质粒转染293T细胞或S19细胞,利用间接免疫荧光(Immunofluoreseence assay,IFA)及Western Blot检测E蛋白的表达与分泌.结果 各重组质粒分别转染293T细胞或Sf9细胞后,E蛋白在细胞内均有效表达,而仅有携带乙脑信号肽且缺失或替换E基因羧基末端20%区域的重组质粒转染293T细胞后,上清中可检测到明显的E蛋白分泌.结论 信号肽及E基因羧基末端20%区域对登革病毒E蛋白的分泌至关重要,宿主细胞对其亦有一定影响.     

登革2型病毒ZS01/01株E蛋白在真核细胞中的分泌表达研究

目的 对登革2型病毒(DENV-2)ZS01/01株E蛋白在哺乳动物细胞及昆虫细胞中的分泌表达进行研究.方法 RT-PCR扩增DENV-2 prM/E基因,通过融合PCR在prM基因前添加来自乙型脑炎病毒的信号肽序列,并将E基因羧基末端20%区域缺失或替换为乙型脑炎病毒SA14-14-2株E基因相应序列,将上述基因元件分别克隆入哺乳动物细胞表达载体pcDNA5/FRT及昆虫细胞表达载体pAcUW51-M中,将重组质粒转染293T细胞或S19细胞,利用间接免疫荧光(Immunofluoreseence assay,IFA)及Western Blot检测E蛋白的表达与分泌.结果 各重组质粒分别转染293T细胞或Sf9细胞后,E蛋白在细胞内均有效表达,而仅有携带乙脑信号肽且缺失或替换E基因羧基末端20%区域的重组质粒转染293T细胞后,上清中可检测到明显的E蛋白分泌.结论 信号肽及E基因羧基末端20%区域对登革病毒E蛋白的分泌至关重要,宿主细胞对其亦有一定影响.