脑动静脉畸形血管内皮细胞和平滑肌细胞的体外培养

目的：探讨脑动静脉畸形（AVM）内皮细胞和平滑肌细胞的分离、培养及鉴定方法。方法：手术获得脑AVM标本后,分别采用组织块贴壁法和酶消化法对脑AVM血管内皮细胞、平滑肌细胞进行培养和形态学观察,采用免疫组化分别检测培养的内皮细胞CD31抗原和平滑肌细胞SMA抗原阳性表达。结果：相差显微镜下,培养的内皮细胞呈扁平梭形,胞核椭圆居中;平滑肌细胞呈长梭形。CD31和SMA分别在两种细胞中免疫阳性表达率超过90％。结论：AVM内皮细胞、平滑肌细胞可以获取和培养增殖,为可供研究脑血管畸形血管生物学的体外模型。     

体外培养人脑动静脉畸形血管内皮细胞中VEGF表达增加

目的探讨体外培养的人脑动静脉畸形血管内皮细胞和正常脑血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达水平的差异。方法采用组织块贴壁法对人脑动静脉畸形血管内皮细胞进行培养和形态学观察;免疫组化检测CD31和vWF抗原验证内皮细胞;采用RT-PCR和Western blot技术检测脑动静脉畸形血管内皮细胞VEGF mRNA和蛋白表达,并与和正常脑血管内皮细胞进行比较。结果体外培养的内皮细胞CD31和vWF染色阳性率达95%以上。人脑动静脉畸形血管内皮细胞中VEGF mRNA和蛋白表达均显著升高(P0.05)。结论体外培养的人脑动静脉畸形内皮细胞中VEGF的高表达,提示血管生成在脑动静脉畸形的发病机制中起重要作用。     

人脑胶质瘤细胞两种分离方法的对比研究

目的 对比人脑胶质瘤细胞的分离纯化方法,并观察其形态学特征.方法 取术后人脑胶质瘤新鲜组织,采用冷胰酶消化法和机械分离法分离后结合速差贴壁法纯化处理进行原代培养.采用吉姆萨染色对培养细胞进行形态学观察.结果 在细胞产量方面冷胰酶消化法优于机械分离法.结论 采用冷胰酶消化法,可以显著降低胰酶对人脑胶质瘤细胞的损害,是可靠的人脑胶质瘤细胞的分离纯化方法.     

缺氧诱导人脑动静脉畸形血管内皮细胞生长因子表达

目的 探讨缺氧条件下体外培养的人脑动静脉畸形（cAVM）血管内皮细胞中血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因表达与细胞超微结构变化。方法 采用组织块贴壁法对cAVM血管内皮细胞进行培养和形态学观察。采用免疫组化方法检测细胞中第八因子相关抗原（FⅧ-RA）的表达，采用RT-PCR技术观察静态和缺氧状态下2h、4h、8h血管内皮细胞VEGF mRNA表达。采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测每组细胞上清液中VEGF蛋白含量；在透射电镜下观察细胞超微结构的变化。结果 体外培养的活细胞具有单层“卵石样”排列的典型特征．95％以上的细胞FⅧ-RA染色阳性。血管内皮细胞vEGF蛋白和mRNA表达在缺氧2h开始升高（P〈0．05），并持续至缺氧8h（P〈0．01）：细胞线粒体丰富。核糖体及粗面内质网逐渐增多。结论 缺氧可能在基因转录水平诱导VEGF表达，后者通过自分泌途径刺激cAVM血管内皮细胞增殖。     

人脑胶质瘤细胞的原代培养及生长活性观察

目的 研究人脑胶质瘤细胞原代培养的方法,观察培养细胞的生长活性与肿瘤级别之间的关系.方法 用消化培养法原代培养24例人脑胶质瘤细胞,酶消化法 振荡贴壁法 机械划除法纯化,增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色及甲基噻唑基四唑(MTT)法观察培养细胞的生长活性.结果 20例原代培养成功,第4代以后肿瘤细胞纯度达98%以上,PCNA、MTT法显示肿瘤细胞的生长活性与肿瘤级别成正比.结论 采用消化培养法可成功培养原代胶质瘤细胞,酶消化法 振荡贴壁法 机械划除法的纯化方法可获得较高的肿瘤细胞纯度;肿瘤细胞的生长活性与肿瘤的恶性程度有关,离体细胞的生长活性可作为判断肿瘤恶性程度的一个指标;检测细胞生长活性MTT法比PCNA染色更具敏感性.     

人脑动静脉畸形血管平滑肌细胞的表型转变

目的:研究人脑动静脉畸形(CAVM)血管平滑肌细胞(VSMC)的表型转变。方法:以骨桥蛋白作为合成型VSMC表型的标志,对26例CAVM病理标本及对照组10名正常脑组织的血管进行免疫组化分析。结果:26例CAVM畸形血管中22例有骨桥蛋白不同程度的表达,主要见于CAVM的静脉部分,尤多见于管壁不规则增厚的静脉。在类似粥样硬化样病变的动脉处也有表达。正常脑组织的血管中未见骨桥蛋白表达。按有无出血史及畸形血管团大小分组进行比较,未发现骨桥蛋白的表达在组间差异没有统计学意义(P>0.05)。结论:人CAVM血管壁中部分VSMC转变为合成表型,这是CAVM的血管适应血流动力学状态发生的进行性血管重塑的结果。     

兔阴道平滑肌细胞体外分离与培养

背景：阴道平滑肌细胞原代培养主要有两种方法：酶消化法和组织块贴壁法。前者培养所需时间短，产量高，但所需组织量较大，且试验中污染机会大，最佳消化时间不易把握；后者虽方法简便、有效，但培养所需时间较长。 目的：观察组织块+酶消化法原代培养兔阴道平滑肌细胞时间，并与组织块法比较。 设计、时间及地点：体外观察实验，于2005-02/2006-02在南昌大学第一附属医院烧伤研究所及动物实验室完成。 材料：四五个月龄雌性新西兰大白兔，体质量2.0~2.5 kg。 方法：①组织块法原代培养阴道平滑肌细胞：将修剪好的1 mm×1 mm×1 mm组织块均匀地接种于培养皿中，然后放入37 ℃恒温培养箱中静置培养3.0~4.0 h，待组织块贴壁牢固后，再补加含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液，使组织块浸于培养液中，37 ℃恒温静置培养3.0~4.0 d，待细胞游出后换液,大约每3天换液一次。②组织块+酶消化法原代培养阴道平滑肌细胞：将组织块用0.1%胶原酶Ⅳ在37 ℃培养箱中消化0.5~1.0 h，至组织块边缘变毛时中止消化，然后将消化好的组织块接种于培养皿上，其余步骤同组织块法。③传代培养：第1次传代时机应根据细胞生长具体情况而定，在细胞达50%~60%融合时即进行传代培养。第2次以后传代，在细胞生长达80%融合时进行传代培养。 主要观察指标：①原代培养所需时间。②第3代阴道平滑肌细胞表面结构和超微结构。 结果：组织块+酶消化法原代培养细胞萌出时间较组织块法早1.0~2.0 d，细胞融合时间较组织块法早3.0~4.0 d，细胞可稳定传5~6代。倒置显微镜下观察两种方法所培养细胞呈梭形或多角形，融合时部分区域细胞出现平滑肌细胞特征性生长表现“峰-谷”状结构。透射电镜下观察，第3代阴道平滑肌细胞核呈锯齿状，胞浆内含平滑肌细胞特征性结构肌丝和密体，含有大量高尔基体,粗面内质网扩张，游离核糖体丰富,提示获得合成表型阴道平滑肌细胞比例大。 结论：组织块+酶消化法原代培养周期较短，需要注意的是在取材、分离整个操作过程中需保持阴道组织块湿润；胶原酶消化组织块时间不应过长，以组织块周边呈现毛须状为度；此外应在静置状态下培养。     

血管组织工程种子细胞原代培养技术的改良**★

背景：如何获取高质量的种子细胞是构建组织工程血管的先决问题。 目的：改良血管组织工程种子细胞原代培养技术并观察其生物学特性。 设计、时间及地点：以细胞为培养对象，观察性实验，于2006-12/2008-03在江西省分子医学重点实验室完成。 材料：新西兰家兔，体质量2 kg左右，用于血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的原代培养。 方法：以胶原酶胰酶序贯消化法获得血管内皮细胞、快捷贴壁法培养血管平滑肌细胞。 主要观察指标：免疫细胞化学法对两者进行鉴定；流式细胞术检测第2代和第6代血管内皮细胞的增殖指数。 结果：培养的种子细胞符合各自特征，免疫细胞化学鉴定其为血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。内皮细胞第2代和第6代细胞增殖指数分别为(20.87±2.05)%和(9.75±1.76)%。 结论：胶原酶胰酶序贯消化法和快捷贴壁法可以较稳定地获取血管内皮细胞及血管平滑肌细胞；第2代的内皮细胞较第6代更适用于构建组织工程血管。     

Ⅰ型神经纤维瘤病雪旺细胞纯化培养的实验研究

目的获得高纯度的NF1(Ⅰ型神经纤维瘤病)神经纤维瘤中雪旺细胞。方法将手术室取来的NF1神经纤维瘤组织剪碎,用Ⅰ型胶原酶消化,普通培养液吹打分散差数贴壁后接种于培养瓶,细胞贴壁后换用含Geneticin的培养液培养3 d,换用普通培养液继续培养,待细胞汇合时结合低浓度酶快速消化法和差数贴壁法对雪旺细胞进行纯化,传代培养;继用S-100蛋白进行免疫组化染色,鉴定培养的雪旺细胞。结果应用含Geneticin的培养液培养雪旺细胞,结合酶快速消化法和差数贴壁法,成纤维细胞基本消失,雪旺细胞活力良好,可进行传代培养,经S-100蛋白免疫组化染色鉴定培养的细胞基本为染色阳性的雪旺细胞。结论应用含有Geneticin的培养液培养雪旺细胞,结合酶快速消化法和差数贴壁法,能够有效地去除成纤维细胞,获得纯度高、活力良好的雪旺细胞。     

不同浓度细胞种植脱细胞血管基质上构建组织工程血管

摘要 背景：前期研究表明制备的脱细胞血管基质适合平滑肌细胞和内皮祖细胞生长,但是共培养模型中细胞接种密度对血管基质上细胞覆盖率的影响尚不清楚。 目的：观察不同浓度度细胞种植在脱细胞血管基质上的生长情况。 方法：采用两步法进行细胞种植,先将不同细胞浓度血管平滑肌细胞种植在脱细胞血管基质上,培养3 d后再将不同浓度内皮祖细胞接种在平滑肌细胞-血管基质复合体上,构建片状组织工程材料,分别在内皮祖细胞种植后3 d、1周时间段获取标本,扫描电镜观察细胞在材料上的生长情况。 结果与结论：血管平滑肌细胞和内皮祖细胞在脱细胞基质表面生长良好。不同浓度细胞在基质上的排布不同;提高接种的浓度有利于在材料表面快速形成致密的细胞层。提示采用两步法以合适的浓度种植细胞于脱细胞基质上,可以构建组织工程血管。 关键词：内皮祖细胞;平滑肌细胞;组织工程血管;脱细胞血管基质;种植 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.010     

Efficient Schwann cell purification by differential cell detachment using multiplex collagenase treatment

Schwann cell purification is usually difficult due to the contamination of fibroblasts, which often become a predominant cell type in Schwann cell culture in vitro. We have developed a novel and efficient method to enrich Schwann cells by differential detachment of two types of cells. In the culture, cells were treated with a multiplex collagenase and the Schwann cells were found to detach faster than fibroblasts and thus Schwann cells could be easily isolated. Within 5 days, Schwann cell purity could reach above 99%, which was confirmed by immunostaining characterization and flow cytometric analysis. In addition, this efficient method can reach a high cell yield after two rounds of differential detachment procedures and does not require antimitotic treatment or special equipment as often needed by other reported methods.     

人胚胎背根神经节雪旺氏细胞的培养

BACKGROUND： Previous studies have used many methods for in vitro Schwann cells （SCs） cultures and purification, such as single cell suspension and cytosine arabinoside. However, it has been difficult to obtain sufficient cellular density, and the procedures have been quite tedious. OBJECTIVE： To investigate the feasibility of culturing high-density SCs using fetal human dorsal root ganglion tissue explants. DESIGN, TIME AND SETTING： Cell culture and irnmunohistochernistry were performed at the Central Laboratory of Kunrning General Hospital of Chinese PLA between March 2001 and October 2008. MATERIALS： Culture media containing 10% fetal bovine serum, as well as 0.2% collagenase and 0.25% trypsin were purchased from Gibco, USA; mouse anti-human S-100 monoclonal antibody and goat anti-mouse IgG labeled with horseradish peroxidase were provided by Beijing Institute of Biological Products, China. METHODS： Primarily cultured SCs were dissociated from dorsal root ganglia of human aborted fetuses at 4 6 months pregnancy. Following removal of the dorsal root ganglion perineurium, the ganglia were dissected into tiny pieces and digested with 0.2% collagenase and 0.25% trypsin （volume ratio 1：1）, then explanted and cultured. SC purification was performed with 5 rnL 10% fetal bovine serum added to the culture media, followed by differential adhesion. MAIN OUTCOME MEASURES： SCs morphology was observed under inverted phase contrast light microscopy. SC purity was evaluated according to percentage of S-100 immunostained cells. RESULTS： SCs were primarily cultured for 5 6 days and then subcultured for 4 5 passages. The highly enriched SC population reached 〉 95% purity and presented with normal morphology. CONCLUSION： A high purity of SCs was obtained with culture methods using human fetal dorsal root ganglion tissue explants.     

大鼠乳鼠和成鼠雪旺细胞提取纯化的对照研究*

背景：许旺细胞是神经创伤修复的种子细胞,获取大量高纯度、高活性许旺细胞是研究的关键。 目的：比较乳鼠和成年鼠许旺细胞的体外培养、纯化和形态学的差别,探讨简单可行的、可以获得高纯度许旺细胞的培养方法。 方法：出生1~3 d SD大鼠20只和成年大鼠10只(体质量150~200 g),实验按细胞的来源分为新生组和成年组。双酶分步消化,二次接种差速分离纯化细胞;倒置显微镜观察细胞形态、贴壁速度;细胞计数,纯度计算;MTT法检测细胞增殖能力,绘制两组许旺细胞的增殖曲线,判定增殖速度;S-100免疫化学法鉴定细胞。 结果与结论：乳鼠的许旺细胞贴壁速度快于成纤维细胞,成鼠的许旺细胞贴壁速度慢于成纤维细胞,两组许旺细胞纯度均达96%以上;MTT法检测两组许旺细胞增殖均活跃,由增殖曲线显示乳鼠许旺细胞增殖更快(P < 0.05);S-100免疫化学反应均呈阳性。提示双酶分步消化,二次接种差速分离纯化细胞,可以获取纯度高、活性良好的许旺细胞;乳鼠许旺细胞的增殖、贴壁能力更强。     

Dispase rapidly and effectively purifies Schwann cells from newborn mice and adult rats

In the present study, Schwann cells were isolated from the sciatic nerve of neonatal mice and purified using dispase and collagenase. Results showed that after the first round of purification with dispase, most of the Schwann cells appeared round in shape and floated in culture solution after 15 minutes. In addition, cell yield and cell purity were higher when compared to the collagenase group. After the second round of purification, the final cell yield for the dispase group was higher than that for the collagenase group, but no significant difference was found in cell purity. Moreover, similar results in cell quantity and purity were observed in adult Sprague-Dawley rats. These findings indicate that purification with dispase can result in the rapid isolation of Schwann cells with a high yield and purity.     

人外周血内皮祖细胞培养方法的建立

背景：成人外周血来源丰富,但内皮祖细胞含量较少,为使其能够更好的应用于组织工程及细胞治疗,有必要建立外周血内皮祖细胞成熟、稳定的体外扩增体系。 目的：建立稳定的人外周血分离、培养和体外扩增血管内皮祖细胞的方法。 方法：应用密度梯度离心法,获取外周血单个核细胞,将分选后细胞接种于预先包埋了人纤维连接蛋白的培养板上,加入内皮祖细胞专用培养基中培养3 d后,洗掉非贴壁细胞,培养至第6天,收集贴壁细胞,应用倒置显微镜和苏木精-伊红染色进行细胞形态学观察;采用MTT法和细胞计数测定第1,3代细胞生长曲线;应用流式细胞仪测定祖细胞和内皮细胞系标志,对培养的细胞进行鉴定。 结果与结论：细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增生期,至第6天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢,同时表达干细胞表面标志CD34、CD133和内皮细胞表面标志血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体2。证明人外周血可以分离培养内皮祖细胞。     

反义基因片段抑制人胶质瘤u251增殖和侵袭的体外研究

目的:研究反义PCNA及uPAR基因片段对胶质瘤细胞株u2 5 1体外增殖和侵袭能力的影响。方法:用脂质体介导寡核苷酸转染培养的u2 5 1胶质瘤细胞,RT PCR、原位杂交和免疫组化等方法分别检测相关基因和蛋白的表达,MTT比色法研究对胶质瘤细胞增殖能力的影响,Boyden小室模型研究对细胞侵袭能力的影响。结果:PCNA及uPAR反义寡核苷酸作用u2 5 1胶质瘤细胞后相关基因的mRNA及蛋白的表达明显减弱,细胞的体外增殖和侵袭能力明显被抑制。结论:反义PCNA及uPAR寡核苷酸片段能有效地抑制胶质瘤细胞的u2 5 1相关基因的表达,并能抑制胶质瘤细胞的体外增殖和侵袭能力。     

人胎盘源与人骨髓源间充质干细胞的生物学性状比较

人骨髓源间充质干细胞具有很好的临床应用价值,但数量和取材都有限,而人胎盘源间充质干细胞则相反,目前已成为再生医学的重要细胞来源和最具临床应用前景的功能干细胞。 目的：比较人胎盘源间充质干细胞和人骨髓源间充质干细胞体外分离培养、扩增及生物学性状的差异。 方法：采用胶原酶消化法分离人胎盘组织,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,分别加入体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM 培养液,待细胞汇合至90%后消化传代。分别取第3代的人胎盘和骨髓间充质干细胞,按1×106 浓度接种,当细胞达70%~80%融合时,换成成脂细胞诱导分化培养液,诱导16 d。 结果与结论：胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞均成贴壁生长、形态均一的成纤维样细胞梭形外观,但后者体积略小。两种细胞均高表达CD29、CD44,不表达CD34、CD106。二者均可分化为脂肪细胞。可见,从胎盘和骨髓中培养出的间充质干细胞在细胞形态、生长特性等方面基本相似,在体外均可有效扩增并成脂肪分化,均可作为组织工程的另一成体干细胞来源,而胎盘源间充质干细胞具有更好的应用前景。     

人脐带间充质干细胞分离培养及成骨分化*

背景：目前,人们对间充质干细胞的观察研究多采用扫描电镜、透射电镜和倒置显微镜等,但是这几种方法对观察细胞膜超微结构及细胞骨架的研究则有不足之处。 目的：探讨并优化人脐带间充质干细胞体外获取及培养增殖的方法并鉴定;应用原子力显微镜观察其向成骨诱导过程中超微结构的变化。 方法：用酶消化法分离培养人脐带间充质干细胞,通过传代培养,扩增。体外向骨方向诱导分化,并通过碱性磷酸酶钙钴法染色、茜素红染色鉴定其分化能力。流式细胞仪检测人脐带间充质干细胞免疫表型;诱导过程中利用原子力显微镜的高空间分辨率从可视化的角度观察其在诱导前后细胞表面超微结构的变化。 结果与结论：采用酶消化法能有效分离纯化人脐带间充质干细胞。接种24 h,贴壁细胞形态多为长梭形,多边形或成纤维细胞样形态,大小均一。流式细胞仪分析第3代细胞均表达CD29、CD44 、CD105,不表达CD34、CD45和HLA-DR。经成骨诱导分化4周后,碱性磷酸酶染色呈强阳性,茜素红染色可见明显钙结节;通过原子力显微镜对分化前后的细胞骨架分析：未分化的干细胞其细胞骨架的微管突出不明显,分化后的细胞骨架其微管明显突出,并呈平行分布状态。     

人脐血间充质干细胞向类肝细胞分化*

背景：研究表明共培养条件下,骨髓间充质干细胞可向心肌细胞、肝样细胞等方向分化。 目的：探讨人脐血间充质干细胞与人肝细胞在体外共培养条件下,诱导人脐血间充质干细胞分化为类肝细胞的可行性。 方法：无菌条件下采集新生儿脐带血,采用密度梯度离心法与贴壁法分离纯化脐血间充质干细胞,待细胞融合至80%时胰蛋白酶消化传代。应用具有微孔滤膜的插入式细胞培养皿和培养板构建人脐血间充质干细胞-肝细胞共培养模型,脐血间充质干细胞按1×107 L-1密度接种于下层6孔板内,LO2人肝细胞按1×105 L-1密度接种到上层插入式培养皿中。以上、下两层均接种人脐血间充质干细胞作为对照组。采用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志,倒置相差显微镜观察共培养后细胞形态变化,RT-PCR法检测肝细胞表面抗原mRNA的表达。 结果与结论：贴壁细胞呈长梭形,强表达CD44和CD29,不表达造血细胞表型CD34和CD45。共培养组5 d时长梭形细胞数量减少,随共培养时间的延长,不规则圆形或多角形的细胞逐渐增多,与肝细胞形态相似;对照组培养4周时,人脐血间充质干细胞仍呈形态均一的长梭形。共培养组5 d时甲胎蛋白mRNA呈阳性表达,其余均为阴性;14 d时细胞角蛋白19 mRNA、白蛋白mRNA开始表达,随着时间延长有增强趋势,甲胎蛋白mRNA表达则较前减弱;对照组各抗原的表达均呈阴性。提示与LO2人肝细胞共培养后,人脐血间充质干细胞可诱导分化为类肝细胞。