细胞色素P4501A1-Wt和Asn~(461)、Val~(462)真核表达载体的构建及人胚肺成纤维细胞转染

目的构建能够高效表达细胞色素P4501A1(CYP1A1)蛋白的细胞株,分析不同基因型蛋白表达的差异。方法首先将已经建立的T载体中CYP1A1-Wt和Asn461、Val462的CYP1A1片断重组至pBABE-neo载体上,转染入人胚肺成纤维细胞(HLF),G418筛选获得阳性细胞,Western-Blot检测CYP1A1蛋白的表达,观察细胞形态,生长曲线,恶变性等生物学特性的改变。结果CYP1A1野生型、变异型转染的HLF细胞均能高效表达CYP1A1蛋白,其生物学特性与正常细胞无显著差异,也不属于恶性细胞。结论通过细胞转染和筛选获得了表达CYP1A1蛋白的细胞株。     

TIF3转基因CHO和COS7细胞株的构建与鉴定

目的：TIF3（Mouse Translation Initiation Facfor 3)是从镉转化BALB／c-3T3细胞中克隆出来的新基因，其在基因文库（GenBank)的新添编号为AF271072。为了对该基因的生物学功能进行研究，构建了TIF3转基因CHO和COS7细胞株并作了鉴定。方法：采用磷酸钙介导转染技术和G418细胞筛选法，以pcDNA3.1/V5-His-TOPO为表达载体，构建TIF3转基因CHO和COS7细胞株；应用Western Blot技术对转基因表达产物进行分析与鉴定。实验设计分无转染组（空白对照）、载体转染组（载体对照）和目的基因转染组（载体＋TIF3cDNA)。结果：结果显示，无论在CHO细胞还是COS细胞，经转染和G418筛选后,无转染组的细胞100％死亡，而载体转染组和TIF3cDNA转染组的细胞形成较锪细胞集落。提示克隆化基因的细胞转染及G418筛选效果良好。经Western Blot分析与鉴定，在7株转染和经G418反复筛选的CHO细胞株中，有3株具有高效稳定表达约36kDa的TIF3编码蛋白质；在4株转染和经G418反复筛选的COS7细胞株中有2株也具有高效稳定的TIF3编码蛋白质表达，而无转染组和载体对照组的CHO和COS7细胞均缺乏此蛋白质表达。结论：本研究成功地构建了3株TIF3转基因CHO细胞株和2株TIF3转基因COS7细胞株。这两类TIF3转基因哺乳动物细胞稳定表达系统的建立，对今后的镉化物相关癌基因的发现及其生物学功能的研究具有重要的应用价值。     

低剂量氢醌诱导hPARP-1蛋白正常及缺陷细胞适应性反应研究

目的观察人胚胎肺成纤维细胞（HLF）正常及缺陷细胞在低剂量氢醌（hydroquinone，HQ）处理后能否诱导适应性反应，探讨PARP-1蛋白缺陷与正常细胞诱导适应性反应与微核形成及细胞周期变化的关系，进一步阐明适应性反应形成机制。方法用低剂量HQ预处理细胞后，观察细胞和DNA对大剂量HQ攻击的适应性反应，从微核率及核异常率、细胞周期等方面测定细胞变化情况。结果在细胞整体活力水平，0．001～0．050μmol／L HQ预处理可以提高细胞对攻击剂量80．0μmol／L的耐受性；HLF、转染绿色荧光蛋白真核表达载体的HLF（HLFC）和转染hPARP-1基因反义RNA真核表达载体的HLF（HLFP）细胞经HQ低剂量预处理及大剂量攻击后，各剂量组不同程度出现含微核和核异常细胞，G1、G2、S期细胞数分布均不相同。与同种细胞仅大剂量攻击比较，0—0．050μmol／L HQ预处理的HLF，HLFC及HLFP细胞微核率及核异常率差异均有统计学意义（P〈0．05）。HQ预处理的HLF和HLFC细胞均出现G2期阻滞；HLFP细胞表现为G2期阻滞，1．000、2．000μmnol／L出现G1期阻滞。结论在低剂量HQ作用下，hPARP-1蛋白缺陷细胞和正常细胞一样有适应性反应，但低于正常细胞，说明hPARP-1蛋白在细胞适应性反应方面起重要作用，适应性反应与细胞周期调控等有关。     

DNA错配修复酶hMSH2缺陷细胞株的建立

目的 建立并鉴定DNA错配修复酶hMSH2缺陷细胞株。用于研究hMSH2基因的作用机制及其缺陷与肿瘤发生的关系。方法 运用基因工程的方法获得hMSH2 cDNA片段,并反向克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1上,随后将构建好的hMSH2反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体转染入人胚肺成纤维细胞(HLF)．使之在HLF中表达,用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中hMSH2基因的表达水平。结果 构建了hMSH2反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体,并在真核细胞成功表达;hMSH2酶缺陷细胞株hMSH2基因的蛋白表达水平下降了44％。结论 hMSH2缺陷细胞株的成功建立和鉴定为hMSH2基因功能研究提供了一种有效手段。     

肿瘤转移抑制基因nm23-H1在人肺癌细胞的表达及其检测

目的：选择已分离鉴定的人巨细胞肺癌细胞高转移亚型PGBEl，转染肿瘤转移抑制基因nm23-H1，以获得稳定表达nm23-H1基因的人肺癌细胞株。方法：采用亚克隆方法获得pcDNA3．1（-）／nm23-H1真核表达载体并进行双酶切和测序鉴定；应用脂质体转染法将重组质粒转染PGBE1细胞；用G418筛选获得阳性细胞克隆，命名为pcDNA3．1（-）／nm23-H1-PGBE1细胞株；用RT-PCR法半定量检测nm23-H1基因的mRNA表达水平和免疫组化法检测nm23-H1基因的蛋白质表达。结果：真核表达载体pcDNA3．1（-）中正确插入了具有完整阅读框的nm23-H1基因；倒置显微镜下观察到经G418筛选出的稳定转染的PGBE1细胞，形成“小岛”；RT-PCR和免疫组化显示转染的细胞中nm23-H1 mRNA和蛋白质水平表达均增高。结论：建立了稳定表达nm23-H1基因的PGBE1转染细胞株，可用于进一步研究肿瘤转移的分子机制。     

周期型马来丝虫基因稳定转染细胞株的建立

摘要:目的　将含周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Bm-CPI）基因的重组质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染人宫颈癌细胞（Hela细胞）获得重组质粒稳定转染细胞株,为重组蛋白的获得提供基础。方法　将成功构建的重组质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染Hela细胞,以G418筛选转染细胞,通过RT-PCR和SDS-PAGE鉴定G418筛选后的单克隆抗性细胞株。结果　重组真核表达质粒pcDNA3.1（+）-Bm-CPI转染Hela细胞后,d 14可见G418抗性细胞株开始形成。G418抗性Hela细胞株筛选、扩大培养后RT-PCR扩增出621bp左右的目的条带;SDS-PAGE检测获得了明显的目的条带。结论　实验证实pcDNA3.1（+）-Bm-CPI重组质粒被成功转入Hela细胞,并获得稳定表达;为进一步研究Bm-CPI表达、蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础。     

DNA氧化损伤修复基因HOGG1低表达细胞株的建立及其生物学特性鉴定

目的为研究肺癌发生机制中DNA氧化损伤修复基因HOGG1的可能作用,利用携带有HOGG1特异性锤头状核酶基因的载体与肺腺癌A549细胞株,建立HOGG1低表达细胞株并观察其生物学效应。方法HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体[pcDNA3.1(+)RZ]经脂质体介导转染A549细胞;G418筛选;Neo基因的RTPCR法鉴定阳性克隆细胞;RTPCR半定量检测核酶对HOGG1基因的抑制效应。同时比较转染细胞与正常A549细胞的生长情况、细胞周期、软琼脂克隆形成率以及超氧化物歧化酶(SOD)的活力。结果转染后G418成功筛选出了阳性转化克隆,经传代形成稳定细胞株。核酶可持续抑制A549细胞HOGG1基因的表达,RTPCR结果显示转染细胞HOGG1mRNA的表达比正常A549细胞低61.5%(P<0.05);转染后,细胞株形态无明显改变;其群体细胞倍增时间为2.05天,稍短于正常A549细胞(2.17d);细胞周期各时相及细胞凋亡率以及细胞增殖指数没有明显改变(P>0.05);软琼脂克隆形成抑制率接近50%(P<0.05);SOD活力比正常A549细胞显著增加(P<0.05)。结论成功建立HOGG1低表达细胞株,所观察的生物学效应多数指标与正常A549细胞无显著差异。     

双链断裂修复蛋白hKu70缺陷细胞株的建立及其生物学特性

目的 建立并鉴定DNA双链断裂(DSB)修复蛋白hKu70缺陷细胞株,并观察该缺陷细胞的某些生物学效应,用于AKu70基因功能及职业有害因素对DNA双链断裂修复影响的研究。方法 用构建的AKu70基因反义RNA绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP—CI—K)转染人胚肺成纤维细胞(HLF),用蛋白兔疫印迹法鉴定转染细胞中AKu70基因的表达水平。同时观察转染细胞生长形态,绘制生长曲线,软琼脂培养法鉴定恶性程度。结果 pEGFP—CI—K载体在转染细胞内可较稳定表达,hKu70蛋白缺陷细胞株AKu70基因的蛋白表达水平下降了42％,转染后hKu70蛋白缺陷细胞生长形态、生长速度无明显变化,软琼脂培养未见细胞集落。结论 成功建立和鉴定了hKu70蛋白缺陷细胞株,该缺陷不足以单独引起可观察的某些生物学效应。     

CYP1A2基因沉默及其对三氯乙烯毒性影响

目的 构建细胞色素氧化酶1A2(CYP1A2)基因沉默载体,转染L02人正常肝细胞(简称“L02细胞”),建立CYP1A2沉默细胞株并观察其对三氯乙烯(TCE)毒性的影响.方法 设计合成短发卡RNA(shRNA),连接到pLKO.1-puro质粒中构建CYP1 A2 shRNA慢病毒表达载体,感染L02细胞.筛选CYP1A2沉默细胞株,采用荧光定量聚合酶链式反应和免疫印迹法鉴定.分别采用浓度为0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 mmol/L的TCE(设为相应的染毒剂量组)对L02细胞和CYP1A2沉默细胞染毒12h,同时设置二甲基亚砜溶剂对照组(即0.00 mmoL/L染毒剂量组),观察凋亡基因[B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8、Caspase-9]和癌基因(c-fos、c-myc、K-ras、p53)等基因表达的变化.结果 测序证明插入pLKO.1-puro载体的CYP1A2基因干扰序列与设计的shRNA 序列一致.CYP1A2沉默细胞的CYP1A2mRNA和CYP1A2蛋白相对表达水平分别较L02细胞下降75.9％和82.4％(P＜0.01).TCE染毒后,0.25 ～4.00 mmol/L 4个染毒剂量组CYP1A2沉默细胞Bcl-2表达水平均高于相应染毒剂量组L02细胞(P＜0.01);部分0.25 ～4.00 mmol/L染毒剂量组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和c-fos、c-myc k-ras、p53相对表达水平均低于相应染毒剂量组的L02细胞(P＜0.05或P＜0.01).结论 CYP1A2沉默降低TCE对L02细胞凋亡基因和癌基因的活化作用.     

Survivin siRNA、HSP70双基因转染对乳腺癌细胞株MCF7 survivin及HSP70表达的影响

目的探讨survivin siRNA、HSP70双基因转染对乳腺癌细胞株MCF7survivin、HSP70表达的影响。方法常规培养乳腺癌细胞株MCF7,将已构建的真核表达载体(pIRES2-EGFP-survivin siRNA、pIRES2-EGFP-HSP70)用脂质体介导转染MCF7细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染后的细胞,通过western-blot、RT-PCR检测转染后细胞中HSP70蛋白、survivin蛋白及survivinmRNA表达的变化。结果转染空载体与转染真核表达载体的乳腺癌细胞株MCF7于倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,证实转染成功。转染真核表达载体的MCF7细胞与转染空载体的MCF7细胞和未转染的MCF7细胞相比,survivin mRNA和survivin蛋白表达水平降低,而HSP70蛋白表达升高。结论 survivin siRNA能有效抑制MCF7细胞内源survivin基因的表达,HSP70能上调MCF7细胞HSP70蛋白的表达,为进一步深入研究survivin siRNA、HSP70双基因对乳腺癌细胞株MCF7生物学特性的影响奠定实验基础。     

不明原因胚胎停育绒毛和蜕膜组织芳香烃受体和细胞色素P4501A1蛋白的表达及意义

目的:探讨芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)和细胞色素P4501A1(cytochrome P4501A1,CYP1A1)蛋白在胚胎停育患者绒毛及蜕膜中的表达。方法:分别选取30例不明原因胚胎停育患者作为病例组和30例正常早期妊娠人工流产妇女作为对照组,采用免疫组织化学方法检测2组患者绒毛和蜕膜组织中AhR和CYP1A1蛋白表达水平。结果:绒毛组织中,病例组AhR蛋白表达水平(0.58±0.03)高于对照组(0.25±0.04),病例组CYP1A1蛋白表达水平(0.60±0.01)高于对照组(0.22±0.03),差异均有统计学意义(P0.05)。蜕膜组织中,病例组AhR蛋白表达水平(0.56±0.03)高于对照组(0.26±0.04),病例组CYP1A1蛋白表达水平(0.57±0.01)高于对照组(0.24±0.03),差异均有统计学意义(P0.05)。结论:胚胎停育患者绒毛和蜕膜组织中AhR和CYP1A1蛋白表达明显增高,可能与不明原因胚胎停育的发生有关。     

苯并[a]芘诱导内皮细胞细胞色素P4501A1表达的研究

目的：探讨苯并[a]芘(BaP)诱导猪主动脉内皮细胞细胞色素P4501A1(CYP1A1)表达及活性的影响。方法：离体培养猪主动脉内皮细胞，不同浓度BaP(0、0．5、1．0、5．0、10．0μmol／L)染毒24h，分别以Western-blot法和免疫组化方法检测不同浓度BaP诱导内皮细胞合成CYP1A1的影响，同时还探讨了乙氧基异吩噁唑-o-去乙氧基酶(EROD)活力的变化规律。结果：Western-blot法未能检测出对照组CYP1A1的表达，而各染毒组均检出了CYP1A1的表达；免疫组化结果显示染毒组仅在部分内皮细胞呈阳性反应；EROD活力诱导高峰的BaP浓度为0．5～1.0μmol／L。结论：BaP可诱导部分猪主动脉内皮细胞合成CYP1A1；EROD活力诱导高峰的BaP浓度为0．5～1．0μmol／L。     

2,3,7,8-四氯二苯并二噁(口英)对大鼠肝脏芳烃受体和细胞色素P4501A1 mRNA的诱导

目的　研究 2 ,3,7,8 四氯二苯并二口恶 口英 (TCDD)对于SD大鼠肝脏CYP1A1,芳烃受体(AHR)mRNA的诱导 ,探讨其毒作用机制。方法　 30只雌性SD大鼠随机分为对照组和 5个染毒组 ,每组 5只 ,染毒剂量为 0 .0 1、0 .10、1.0 0、10 .0 0、5 0 .0 0 μgTCDD/kg体重 ,用腹腔注射的方式一次染毒 ,2 4h后 ,用RT PCR方法测定肝脏中CYP1A1、AHRmRNA的诱导情况。结果　除 0 .0 1μgTCDD/kg体重外 ,各染毒组AHR和CYP1A1mRNA表达均有所增加 ,其中 ,AHRmRNA在 5 0 μgTCDD/kg体重组明显增加 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,CYP1A1mRNA在除 0 .0 1μgTCDD/kg体重组外的各染毒组明显增加 ,差异均有显著性 (P <0 .0 5 ) ,且染毒剂量与AHR、CYP1A1mRNA诱导之间存在剂量 -效应关系。结论　染毒后 2 4h ,TCDD能诱导SD大鼠肝脏AHR、CYP1A1基因表达 ,CYP1A1基因比AHR基因更容易被诱导。     

Modulation of CYP1A1, CYP1A2 and CYP1B1 Expression by Cabbage Juices and Indoles in Human Breast Cell Lines

Epidemiological studies have shown that consumption of cabbage and sauerkraut is connected with significant reduction of breast cancer incidences. Estrogens are considered a major breast cancer risk factor and their metabolism by P450 enzymes substantially contributes to carcinogenic activity. The aim of this study was to investigate the effect of cabbage and sauerkraut juices of different origin on the expression profile of the estrogen metabolism key enzymes (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1) in breast cell lines MCF7, MDA-MB-231, and MCF10A. The effects of cabbage juices were compared with that exerted by indole-3-carbinol (I3C) and 3,3'-diindolylmethane (DIM). The treatment with cabbage juices or indoles for 72?h affected the expression of CYP1 family genes in cell-type dependent manner. Their induction was found in all cell lines, but the ratio of CYP1A1 to CYP1B1 was 1.22- to 10.6-fold in favor to CYP1A1 in MCF7 and MCF10A cells. Increased levels of CYP1A2 in comparison with CYP1B1 were also observed in MCF7 cells. In contrast, in MDA-MB-231 cells CYP1B1 was preferentially induced. Since the cell lines investigated differ in invasion capacity, these results support epidemiological observations and partly explain the mechanism of the chemopreventive activity of white cabbage products.     

Reduction in 7,12-dimethylbenz[a]anthracene-induced hepatic cytochrome-P450 1A1 expression following soy consumption in female rats is mediated by degradation of the aryl hydrocarbon receptor

Consumption of a soy diet has been found to reduce cancer incidence in animals and is associated with reduced cancer risk in humans. In this study, the effect of consuming soy protein isolate (SPI) on the aryl hydrocarbon receptor (AhR)-mediated signaling pathway was investigated. Female Sprague-Dawley rats were fed AIN-93G diets with (+) or without (-) SPI-bound phytochemicals or casein (CAS) protein and gavaged orally with 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) or sesame oil. We found reduced (P < 0.05) DMBA-induced hepatic cytochrome-P450 1A1 (CYP1A1) activity, apoprotein, and mRNA expression along with the reduced binding of AhR-AhR nuclear translocator complex to CYP1A1 gene promoter in SPI(+)-fed rats compared with CAS- or SPI(-)-fed rats. Basal AhR protein expression was lower (P < 0.05) in SPI(+)-fed rats compared with CAS- or SPI(-)-fed groups. AhR levels were reduced (P < 0.05) after rats were fed SPI(+) for >20 d. Experiments in which SPI(+)-fed rats were weaned to CAS diets demonstrated that AhR reduction by SPI(+) is not imprinted metabolically. To determine the molecular mechanisms of SPI(+)-mediated AhR reduction, an ex vivo model was developed using FGC-4 cells treated with serum from CAS- or SPI(+)-fed rats. SPI(+) serum treatment of FGC-4 cells reduced AhR expression and DMBA-induced CYP1A1 expression (P < 0.05). The reduction in AhR expression was in part due to the shorter half-life of AhR protein. Our findings suggest that the cancer preventive effect of soy-based diets is mediated in part by reduction in AhR protein level posttranslationally, which reduces procarcinogen-induced CYP1A1 induction and metabolic activation.