人脐带间充质干细胞原代培养方法的改良

目的: 探讨体外组织块培养原代人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的改良方法,并观察其形态,免疫表型,成脂成骨分化等生物学特性。方法: 从健康足月儿获得脐带,将血管剥离后,余下的结缔组织剪成小块,分别用传统植块法和改良植块法分离培养原代hUC MSCs。MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞免疫表型,成脂成骨诱导分化检测其分化潜能,化学染色鉴定诱导分化结果。结果： 改良植块法脐带组织贴壁培养3～4 d即可从组织块边缘长出长梭形成纤维样原代细胞,5～6 d后细胞可长满80%,比传统植块法原代细胞培养周期缩短了一半以上时间,细胞传代后流水状或漩涡状生长,MTT法显示细胞增殖能力强,流式细胞仪检测提示CD90, CD105,CD73,CD166,CD29,CD44均阳性表达,阳性率均在95%以上,CD45和HLA-DR均阴性表达,阳性率低于2%;诱导分化实验及化学染色结果证实, 该细胞具有成脂和成骨多向分化潜能。结论：应用与酶消化法相结合的改良植块法可以获得hUC-MSCs,比传统植块法缩短了原代培养周期,提高了细胞培养效率,所获得细胞贴壁生长,增殖能力强,表达间充质干细胞相关免疫表型,具有多向分化潜能,可在科研和临床应用中作为种子细胞来源。     

人脐带间充质干细胞的无动物血清培养及向肝细胞诱导分化

目的 探索从脐带组织中分离培养间充质干细胞的无动物血清方法,并将其向肝细胞诱导分化。方法 分离自体脐血清用于后续细胞培养,利用酶消化法从脐带组织中分离培养间充质干细胞,检测其形态和免疫表型,并采用两步法诱导其向肝细胞诱导分化。结果  流式细胞术检测结果表明,自体脐血清培养得到的贴壁细胞表型符合间充质干细胞特征,且在合适诱导条件下能肝样细胞分化,经过4周处理,能表达肝细胞特异性基因,部分细胞具有吞噬低密度脂蛋白的能力。结论  采用自体脐血清有效地培养脐带间充质干细胞,具备向肝细胞的分化能力。     

胎盘来源间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的实验研究

目的：掌握体外分离、培养扩增胎盘间充质干细胞的方法,探讨其成骨细胞定向诱导分化的能力。方法：用IV型胶原酶消化人胎盘组织,获得单个核细胞,接种于10%新生牛血清（FBS）低糖培养基中（DMEM）,贴壁后常规换液、传代,流式细胞仪检测其表面标志,用β 甘油磷酸钠,维生素C,地塞米松联合诱导,使胎盘贴壁细胞分化为成骨细胞,诱导后10?d检测碱性磷酸酶（ALP）活性,并行茜素红染色。结果：培养7～14?d后有少量贴壁细胞生长,逐渐呈成纤维细胞状,表达CD29、CD44和CD105,不表达CD34、CD45、CD19;在成骨诱导10?d后细胞ALP活性明显增强,茜素红染色可见钙盐沉积。结论：胎盘组织可能是新的间充质干细胞来源。     

人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离、培养、鉴定及冻存、复苏

目的：探讨从人脐带华通氏胶（Wharton’s jelly,WJ）中分离、培养、鉴定间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）及其冻存、复苏的方法。方法：采用植块法分离、培养间充质干细胞,流式细胞仪检测P3代细胞免疫表型,鉴定其向成骨、成脂方向诱导分化的能力;将P1细胞冻存6个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果：植块法容易从人脐带华通氏胶中获得间充质干细胞;组织块贴壁后6 d可见组织块周围细胞爬出,原代培养14~18 d细胞融合70%~80%;P3代细胞强烈表达CD73、CD90、CD105,不表达CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR;成骨诱导分化后10 d,可见明显钙结节;成脂诱导14 d,有明显的脂滴出现,油红O染色阳性。冻存再复苏细胞活力达80%,细胞免疫表型及成骨、成脂诱导显示与冻存前细胞呈相同的特性。结论：组织块培养法可从人脐带华通氏胶中分离、培养出纯度较高间充质干细胞,冻存、复苏不改变其特性。     

组织块法分离培养小鼠脾脏间充质干细胞

目的通过组织块培养法,建立一种高效可靠的小鼠脾脏间充质干细胞分离扩增策略。方法无菌条件下取小鼠脾脏组织充分碾碎,使用胶原酶消化获得的脾脏基质组织,将消化后的组织块种于培养瓶中,观察从组织块中迁移出的细胞形态,采用流式细胞术分析其表型,并将其做成骨和成脂肪诱导分化。结果消化后的脾脏组织块中迁移迁移出大量梭形纤维样细胞,流式细胞术检测结果表明,该种细胞高表达CD29、CD44、Sca-1和CD105,低表达CD11b、CD34、CD45和Ia。多向分化实验结果表明:小鼠脾脏基质组织中迁移出的细胞具有较好的成脂肪和成骨分化能力。结论组织块法可以分离培养出小鼠脾脏间充质干细胞,所获得的细胞纯度高,分化能力强,为开展相关研究提供了良好的细胞模型。     

人脂肪间充质干细胞体外培养鉴定与诱导分化的初步研究

目的分离培养人脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADSCs),观测表型及表达特异性蛋白与多向诱导分化的能力。方法取人脂肪组织,机械法与酶消化法分离、培养,观察细胞形态及增殖活力,免疫细胞化学和FCM检测其标志蛋白。第9代ADSCs向成脂、成软骨和成骨细胞诱导分化。结果原代细胞贴壁后多呈多角形,传代后呈均一梭形。免疫细胞化学结果显示:ADSCs不表达CK19,而波形蛋白(Vimentin)阳性表达,间充质干细胞表面标志CD105、CD90、CD44、CD73均高表达,CD45+34+11b+19+DR为0.48%。第9代ADSCs诱导培养后分别出现脂肪、软骨、骨细胞特征性染色阳性。结论酶消化法可有效分离ADSCs,第9代生长状态好,仍保持良好干性,经诱导可多向分化,表明ADSCs可作为良好的细胞治疗或组织工程种子细胞的来源,且有潜在广泛应用前景。     

人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。方法收集健康足月新生儿脐带组织,采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面抗原,将细胞冻存3个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高;细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105,不表达造血干细胞表型CD34、CD45等;冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞,为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。     

牙周膜干细胞培养及鉴定方法的研究进展

牙周组织工程是以开发促进牙槽骨、牙周膜和牙骨质再生的治疗手段为目的,利用牙周组织发生的原理来形成或再生功能性牙周组织,牙周组织再生的关键是种子细胞,自2004年国外学者首次发现牙周组织发育完成后存在于牙周膜中的未分化间充质细胞具有自我更新和多向分化等成体干细胞的特点,能形成牙骨质-牙周膜样复合体,将其命名为牙周膜干细胞后,近年来国内外学者对于牙周膜干细胞的研究逐渐增多,并且取得了一定的成果,本文着重对牙周膜干细胞的基本概念;原代培养方法：组织块贴壁法、酶消化法和酶解组织块法及干细胞纯化的方法;牙周膜干细胞的鉴定方法：包括形态学观察、细胞免疫细胞化学鉴定、细胞增殖能力的检测、多向分化潜能检测及细胞表型分析等进行了介绍。     

人早期胚胎源性间充质干细胞的体外分离培养及其生物学特性

目的：建立人早期胚胎源性间充质干细胞（MSCs）的体外分离培养方法,并对其生物学特性加以鉴定。 方法：将胚龄5～6周的胚胎组织经0.25%胰蛋白酶消化7~10 min后获得分离细胞悬液,MSCs培养基纯化贴壁细胞,流式细胞术检测细胞表型特征,MTT法和碘化丙啶(PI)标记测定细胞增殖活性和细胞周期,条件培养液诱导法鉴定其多向分化潜能。 结果：采用组织消化法从人早期胚胎组织中分离获得MSCs,表面标志CD29、CD44、CD73、CD105、CD166呈阳性表达,CD34、CD45和HLA-DR为阴性表达;细胞倍增时间为23 h;细胞在成脂诱导条件下可见脂滴形成,成骨诱导2周后细胞碱性磷酸酶染色显示类骨结节区呈棕黑色(活性明显增强),茜素红染色可见钙盐沉积。结论：人早期胚胎源性MSCs与成体MSCs表型一致,具有成脂和成骨分化潜能。     

胎盘贴壁细胞的生物学特性

目的: 通过体外分离和培养胎盘贴壁细胞,以研究其形态、表型和分化特点. 方法: 采用IV型胶原酶消化人胎盘组织,获得单个核细胞,接种于100 mL/L FBS 低糖DMEM培养基中,贴壁后常规换液、传代,流式细胞仪检测其表面标志,绘制生长曲线. 采用β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松联合诱导,使胎盘贴壁细胞分化为成骨细胞,诱导后10 d行茜素红染色;采用地塞米松、胰岛素诱导,使胎盘贴壁细胞分化为脂肪细胞,油红O染色鉴定. 结果: 培养7～14 d后有少量贴壁细胞生长,逐渐呈成纤维细胞状,表达CD29,CD44和CD105,不表达CD34,CD45,CD19;在成骨诱导10 d后细胞茜素红染色可见钙盐沉积,成脂肪诱导7 d后油红O染色见脂肪滴形成. 结论: 通过不同方式诱导培养,胎盘贴壁细胞可分化为成骨细胞及脂肪细胞,提示胎盘贴壁细胞可能是新的干细胞来源.     

小鼠脐带间充质干细胞的体外诱导分化

目的分离扩增小鼠脐带间充质干细胞（mouse umbilical cord mesenchymal stem cells,mUCMSCs）探讨其是否可诱导成软骨、脂肪和成骨细胞。方法 通过贴壁培养法将mUCMSCs体外分离、扩增、纯化,倒置显微镜下观察细胞的形态特征,运用流式细胞仪检测分析细胞的抗原标志表达进行鉴定。运用诱导培养液对分离的mUCMSCs分别定向诱导培养为软骨、脂肪和成骨细胞。结果 运用组织贴块培养法可从新鲜脐带中分离到贴壁生长的成纤维样细胞,这些细胞高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD34。成软骨诱导后阿新兰染色呈蓝色;成脂诱导后油红O染色,出现红色脂滴;茜红素染色成骨诱导的mUCMSC,可见红色结节。结论 贴壁培养法分离培养所获得的mUCMSCs在体外可诱导分化为软骨、脂肪和成骨细胞。     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

三种胎盘间充质干细胞的分离培养及生物学特性对比研究

目的 分离培养人胎盘羊膜、绒毛膜和蜕膜三种间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),进行生物学特性对比研究.方法 酶消化法分离胎盘羊膜、绒毛膜和蜕膜内干细胞,体外培养传代,MTT法测定细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面标志,茜素红和油红O检测成骨和成脂能力.结果 表面标记鉴定分离的胎盘细胞为间充质干细胞,细胞具增殖和分化能力.三种细胞在传代过程中细胞形态、表面标志表达、分化能力维持稳定,但增殖能力存在差异.结论 成功分离获得三种胎盘MSCs,可以作为临床前研究用MSCs来源.     

改良分次酶消化法分离培养兔肌腱干细胞及诱导分化鉴定

目的  采用改良分次酶消化法体外分离培养家兔肌腱干细胞,观察其生物学特性,并进行诱导分化及鉴定。方法  无菌条件下取出家兔髌腱组织,分别运用改良的分次酶消化法和酶消化后低密度稀释接种法进行分离、培养、传代,用倒置相差显微镜观察细胞形态特征并绘制两种方法的生长曲线,通过流式细胞鉴定仪检测肌腱干细胞表面抗原标志物的表达,取P3-P4代肌腱干细胞向成骨细胞、成软骨细胞诱导分化并鉴定。结果  改良的分次酶消化法较酶消化后低密度稀释接种法细胞增殖速度加快,形态均一,杂质细胞少。分离出的肌腱干细胞表面抗原标志CD90、CD44呈阳性,而CD34、CD14呈阴性,证实之前分离的细胞为肌腱干细胞。鉴定出肌腱干细胞具有向成骨细胞和成软骨细胞分化能力。结论  采用改良的分次酶消化法分离培养兔肌腱干细胞简单易行,肌腱干细胞生长及传代速度可观,活性良好,纯度较高。另外,肌腱干细胞的成功分离培养,也为肌腱相关疾病的研究开辟了一条新途径。

     

成人骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性

目的：建立一种成人骨髓间充质干细胞体外分离、培养和扩增的方法，并探讨其部分生物学活性及向脂肪细胞诱导分化的方法，并以此鉴定所获细胞。方法：采用1．073g／ml的Percoll分离液分离成人骨髓间充质干细胞。接种于纤维连接蛋白包被，含有表皮生长因子和血小板原性生长因子BB的2％胎牛血清培养液中，并利用其贴壁性进行纯化；观察其形态学变化及超微结构，流式细胞仪检测其表面标记物；采用10％胎牛血清和尼克酰胺诱导其向脂肪细胞的分化。结果：原代和传代培养均保持较强的增殖能力，超微结构显示了干细胞的幼稚特性，流式细胞仪检测示CD34、CD45、CD19、组织相容性抗原-DR阴性，CD44、CD10、CD29、CD13阳性。体外能够分化成为脂肪细胞，油红O染色阳性。结论：采用该方法骨髓间充质干细胞生长稳定，扩增较快；一定条件下能够定向分化成为脂肪细胞；我们所获得的细胞具有间充质干细胞的特性。     

兔脂肪干细胞的体外成脂成骨诱导及BrdU标记情况的初步研究

目的探索兔脂肪间充质干细胞体外分离培养的方法及生物学特性,并探讨5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记脂肪间充质干细胞的效果。方法取兔颈后脂肪采用胶原酶消化方法分离培养干细胞,诱导培养基定向成脂、成骨细胞诱导及组织化学鉴定。采用BrdU法标记干细胞,免疫组化法鉴定其体外标记情况。结果兔脂肪组织中可以分离培养出生长旺盛的干细胞,定向诱导后表现出成脂,成骨细胞的特性。BrdU可标记干细胞的核,体外标记率达95%。结论兔脂肪干细胞易于体外分离培养,具有较强的自我更新能力及多向分化的潜能。BrdU对脂肪干细胞的标记效果满意,操作简单易行。     

人脂肪干细胞向脂肪细胞的定向分化

目的：分离和培养人脂肪干细胞（hADSCs）,并在体外定向诱导hADSCs分化为脂肪细胞。方法：利用胶原酶消化法和贴壁筛选法从人脂肪组织中分离、培养及扩增hADSCs;应用地塞米松、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤及胰岛素定向诱导hADSCs分化为脂肪细胞。结果：体外分离、培养出高度同源性的hADSCs,hADSCs具有相对特异的细胞表面标志,即CD29、CD73、CD105及CD166呈阳性表达,而CD31及HLA-DR呈阴性表达;hADSCs具有典型的干细胞增殖特点,大部分处于静息期,只有少数细胞处于增殖活跃期;hADSCs能被诱导分化为脂肪细胞。结论：成功地分离、培养出高度同源性的、未分化的hADSCs;体外定向诱导hADSCs可分化为脂肪细胞。     

人胃癌组织中间充质干细胞的生物学特性的研究分析

目的对从人胃癌组织分离培养的间充质干细胞(mesenchymal stem cells from human gastric cancer,hGC-MSCs)进行生物学特性的研究分析,为hGC-MSCs的研究提供科学资料。方法采用酶消化法从新鲜的胃癌标本中分离培养hGC-MSCs,研究其细胞形态、生长曲线、细胞表面标志物的表达、细胞多向分化能力等。结果人胃癌组织中可分离培养出hGC-MSCs,hGC-MSCs在倒置相差显微镜下呈梭形或多角形的成纤维样细胞,细胞间排列呈漩涡状或辐射状;生长曲线提示细胞增殖能力很强,并随着传代有所降低。hGC-MSCs表面抗原高表达CD13、CD44和CD90,低表达CD45,CD34,HLA-DR,诱导分化实验显示hGC-MSCs具有多向分化潜能。结论人胃癌组织中存在间充质干细胞,具有与人类骨髓来源的MSCs相似的细胞生物学特性。hGC-MSCs的研究,对肿瘤微环境的研究及MSCs的临床应用有重要的价值。