溶组织内阿米巴5例的粪便鉴定

目的探讨溶组织内阿米巴的粪便鉴定,并就溶组织内阿米巴包囊及滋养体的镜检要点及常见漏检原因进行讨论。方法用显微镜法对5例外院漏诊的肠阿米巴病患者粪便标本进行检验,分别用生理盐水涂片法、碘染色和苏木素染色法,在显微镜下进行观察鉴定。结果溶组织内阿米巴包囊及滋养体在生理盐水涂片、碘染色涂片和苏木素染色涂片中有典型的形态学特点。结论对于可疑肠阿米巴病患者,应多次及时送标本进行检验,采用几种不同方法进行鉴定,并注意将溶组织内阿米巴与吞噬细胞及迪斯帕内阿米巴相鉴别。     

1例国内罕见的输入性卵形疟的实验室检测

目的对1例输入性疑似疟疾患者的血样进行实验室检测。方法制备疑似疟疾患者血样的血涂片,吉姆萨染色后进行疟原虫的镜检观察。利用实验室自行研制的疟原虫属特异性（通用型）和4种疟原虫种特异性的巢式PCR和实时荧光PCR检测方法,对该血样进行疟疾检测及分型。将PCR扩增片段进行序列测定,并与已知的卵形疟序列进行blast比对分析。结合血样的分子生物学检测结果,重新对镜检结果进行复核。结果血样初次镜检为疟疾阴性。使用疟原虫巢式PCR通用引物对血样的DNA进行PCR检测,扩增出了预期大小约240bp的条带;巢式PCR分型检测表明,血样仅扩增出预期大小约450bp的卵形疟条带,无对应大小的恶性疟、间日疟和三日疟扩增条带产生。疟原虫通用型和卵形疟特异性的荧光PCR检测结果均为典型的S形阳性曲线,卵形疟扩增片段的熔解温度为72.5℃。序列分析表明,扩增片段长度为434bp,blast比对发现去除引物后的393个碱基与GenBank DQ845247等卵形疟的SSU rRNA对应部分的基因序列同源性为100%。重新对血涂片进行镜检复核,结果在薄血膜中发现了卵形疟的环状滋养体,被寄生的红细胞为椭圆形,边缘呈伞矢状。结论使用巢式PCR、实时荧光PCR、序列分析和镜检等方法,证实该例输入性的疑似疟疾患者为卵形疟原虫感染。     

抑制和刺激培养的溶组织内阿米巴生长与蛋白激酶激活和蛋白质磷酸化的关系

溶组织内阿米巴(E.h.)侵入人体肠道 引起结肠炎和阿米巴肝脓肿。关于原虫侵入     

3种方法检测粪便中溶组织内阿米巴的结果比较

目的比较生理盐水直接涂片法、醛醚沉淀法及ELISA 3种方法检测粪便中溶组织内阿米巴的优缺点。方法采集受检者粪便标本278份.分别采用3种方法进行阿米巴原虫感染检测,检测结果进行统计学处理,分析3种方法的阳性检出率、准确率、敏感性、特异性及费用。结果生理盐水直接涂片法、醛醚沉淀法和ELISA法的阳性率分别为9.71%、10.79%和12.23%,差异无统计学意义(P>0.05);阳性标本经PCR确证,3种方法的阳性符合率分别为48.71%、51.11%和77.36%,差异有统计学意义(P<0.05)。生理盐水直接涂片法费用低(1元/份),耗时少(0.1 h～0.2 h)。结论粪便溶组织内阿米巴检测推荐使用ELISA法,其次是醛醚沉淀法,如果用生理盐水涂片法,至少要重复检测3次。     

巢式PCR技术在输入性卵形疟诊断中的应用研究

目的应用巢式PCR扩增小亚单位核糖体核糖核酸(18S r RNA)基因确诊卵形疟原虫感染。方法采集2012-2013年山东省疟疾患者全血和滤纸血样,吉氏染色镜检观察血膜疟原虫形态并鉴定虫种。提取血样中DNA,根据疟原虫18S r RNA基因以属和种特异性引物进行巢式PCR扩增,筛查卵形疟阳性标本并进行测序验证。结果2012和2013年山东省共筛查到7例输入性卵形疟原虫感染病例。巢式PCR扩增7份血样均在800 bp处出现卵形疟原虫特异性单一条带,Blast比对表明产物序列与Gen Bank卵形疟参考序列一致。结论经巢式PCR方法确诊了2012和2013年山东省7例输入性卵形疟病例。     

用免疫细胞化学法显示溶组织内阿米巴

在粪便、培养物或组织中一般较难检出溶组织内阿米巴。本文介绍一种检查各种标本中E.h.的免疫过氧化物酶方法。粪便标本取自有慢性腹泻和痢疾的溶组织内阿米巴病人(E.h.铁-苏木素染色阳性),直肠渗出物由患阿米巴痢疾的儿童直肠或乙状结肠的溃疡处采得,肝及肠活检标本系从肝脓肿患者中取得;盲肠渗出物由8～15天前感染阿米巴滋养体5×10~6～1.5×10~6的Sprague-Dawlly鼠内取得。另外,溶组织内阿米巴滋养体HV71:UCV、HV74:UCV、HV75:UCV、HV78:UCV、HV81:UCV和HV83:UCV株按De La Forre等改良法培养,纯种虫株NIH:200按Diamond等法培养。粪便     

应用FTA/PCR检测粪便中隐孢子虫的实验研究

目的 建立用FTA/PCR检测粪便中隐孢子虫的技术,并与常用的商业化的粪便DNA抽提试剂盒进行比较.方法 选择经病原学检测已经确诊的隐孢子虫阳性和阴性粪便,分别采用FTA卡和商业化DNA抽提试剂盒抽提粪便样本中DNA,进行巢式PCR扩增,对PCR阳性产物进行测序并利用BLAST在NCBI上与GenBank数据库进行比对,做同源性分析,确定虫种.结果 应用商业化DNA抽提试剂盒抽提DNA,无论是否反复冻融破壁,2个阳性对照样本扩增出目的 片段,另3个阳性样本未扩增出特异性条带.样本纯化后应用FTA卡抽提DNA进行PCR检测,所有阳性粪样均扩增出830 bp左右的目的 片段,通过测序和比对,其中2个为贝氏隐孢子虫,1个为火鸡隐孢子虫.结论 应用FTA进行粪便样本中隐孢子虫DNA的抽提方法具有简单有效、快速灵敏、准确可靠等特点,可以应用于粪便中隐孢子虫的检测.     

二、388例腹泻患者肠道原虫感染情况的调查

为了解腹泻患者肠道内原虫感染情况,我们于1990年7～10月,对开封市医院肠道门诊及住院的腹泻病人(3个月～72岁),每份新鲜粪便采用直接涂片法及碘液涂片法同时进行镜检调查。结果共检388人,原虫阳性者89人、阳性率为22.94％。发现隐孢子虫、结肠内阿米巴各10例(各2.58％),溶组织内阿米巴6例     

山东省14例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的鉴定

目的 对山东省14例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种进行鉴定分析。方法 收集14例输入性疟疾病例,进行快速疟疾诊断试纸条检测(RDT)、血涂片镜检、NP-1993常规巢式PCR鉴定和卵形疟原虫wallikeri(P. ovale wallikeri)亚种的特异性PCR检测。PCR扩增产物测序后,进行Blast比对分析。结果 14例患者RDT检测结果:泛疟原虫(非恶性疟)阳性12例,阴性2例;镜检结果,13例卵形疟原虫,1例间日疟原虫;NP-1993常规巢式PCR结果,14例样本4种疟原虫引物扩增结果均为阴性。P. ovale wallikeri亚种的特异性PCR检测结果:14例样本均能扩增到P. ovale wallikeri亚种特异性条带780 bp。Blast分析测序结果,检索结果为P. ovale wallikeri亚种。结论 14 例镜检阳性、NP-1993常规巢式PCR检测阴性的输入性疟疾病例均确诊为P. ovale wallikeri亚种感染。     

溶组织内阿米巴、结肠内阿米巴和贾第虫包囊大小的测量

有关人体肠道原虫包囊大小的数据,在教科书或文献已有的记述并不一致,国内尚未见报道。为了获得新鲜包囊大小的具体数据,我们作了溶组织内阿米巴、结肠内阿米巴和贾第虫包囊的大小测量,结果如下: 材料与方法:本测量系分别取溶组织内阿米巴、结肠内阿米巴和贾第虫感染者的新鲜粪便,作卢戈氏碘液染色涂片法查包囊,镜检测量时统一使用目镜测微计,记录所测数据,加以统计处理。     

Usefulness of multiplex-PCR for identification of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar

We evaluated the usefulness of a multiplex-PCR method for differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar, which are morphologically indistinguishable species. Cultured trophozoites of E. histolytica HM-1: IMSS and E. dispar SAW were used as the positive control. Seven human fecal samples, from which E. histolytica-like cysts were detected by microscopic examination, and three intestinal protozoan parasites, Cryptosporidium parvum HNJ-1, Giardia intestinalis Portland-1, and Blastocytis hominis Nand II, were used for the evaluation of sensitivity and specificity of the PCR method. The other PCR method, which has been used for the diagnosis of amebic infections in Japan, was also performed by using the same samples for the evaluation. In comparison with the conventional PCR method, the multiplex-PCR showed 1) higher sensitivity, 2) the size of diagnostic fragments of PCR products was clearly different in both Entamoeba species, 3) it was possible to perform PCR using a single tube per sample, and then to save the amount of DNA polymerase, 4) no diagnostic amplification products were found in other intestinal protozoan parasites, and 5) E. histolytica specific fragment was amplified in all clinical samples examined. In conclusion, it is considered that the multiplex-PCR method is a useful tool for detection of both Entamoeba species DNA from fecal samples and for the distinction between E. histolytica and E. dispar.     

聚合酶链反应检测隐孢子虫的临床应用探讨

目的　探讨一种更为简便的聚合酶链反应（PCR）检测人体微小隐孢子虫（Cryptosporidiumparvum,C.p.）的模板制备方法。方法　根据LaxerMA等克隆的C.p.核酸序列片段设计并合成一对引物,将含有C.p.卵囊的粪便经浓集、裂解后,直接取上清液作为模板与引物进行PCR反应。　结果　取自于桂林、福州和徐州三地含有C.p.的粪便标本均能扩增出418bp的C.p.目的DNA条带,阴性对照无扩增。结论　应用该引物对人粪便中的C.p.进行PCR检测具有高度特异性,该模板制备方法能缩短PCR检测C.p.时间,较适于临床实际应用。     

2例人类免疫缺陷病毒Ⅰ型母婴传播病例的毒株序列分析

目的对山东省的2对均为人类免疫缺陷病毒Ⅰ型抗体阳性的母子感染毒株进行核酸检测和序列分析,以探讨他们感染毒株的起源关系.方法采集2对母子的外周静脉防凝血,提取前病毒DNA进行体外扩增,获得核心蛋白（gag）基因的核酸片段,并对其进行测定和分析.结果 2对母子核酸扩增均为阳性,序列分析显示毒株亚型均为A/E,母子之间有高度同源性.结论由分子生物学研究和流行病学资料证实这2对母子是HIV-1母婴传播病例.     

聚合酶链反应检测粪便中微小隐孢子虫

目的：利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）原理建立一种敏感且特异的方法检测人和动物粪便标本中的微小隐孢子虫（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍ，Ｃ．ｐ．）。方法：从含有Ｃ．ｐ．卵囊的人和豚鼠粪便标本中直接提取ＤＮＡ用作ＰＣＲ的模板。用一对人工合成的寡核苷酸序列作为ＰＣＲ引物，扩增长为４５２ｂｐ的Ｃ．ｐ．目的ＤＮＡ片段。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色检测。结果：从感染Ｃ．ｐ．的人和豚鼠粪便标本ＤＮＡ抽提物中均扩增出目的片段，而从其他几种寄生虫、肠道微生物或宿主ＤＮＡ中均不能扩增出目的片段。本方法的敏感性比目前常用的检测方法高约１００倍。结论：ＰＣＲ技术检测人和动物粪便中的Ｃ．ｐ．，具有敏感性高且特异性强的特点，有希望成为隐孢子虫病诊断和流行病学调查的有力手段。     

粪便基因型检测幽门螺杆菌对克拉霉素耐药性的研究

背景：幽门螺杆菌（Hp）耐药情况日趋严重,选择快速、敏感、价廉的分子生物学技术对Hp耐药进行检测具有重要的临床意义。目的：评价检测粪便Hp基因突变对诊断克拉霉素耐药的有效性,并探讨cagA基因与耐药的相关性。方法：纳入74例13C-尿素呼气试验阳性患者,采集其新鲜粪便标本,提取粪便DNA,采用巢式PCR法扩增Hp23SrRNA,采用PCR—RFLP法检测限制性内切酶BbsI、BceAI、BsaI对23SrRNA扩增产物的酶切情况,采用PCR法扩增cagA基因。结果：74例患者的粪便标本中,60例扩增出Hp23SrRNA367bp片段,其中17例可被BsaI酶切,60例均未被BbsI、BceAI酶切。cagA阳性、阴性表达者的23SrRNA突变率相比差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：通过粪便基因型检测Hp对克拉霉素耐药是快速、简便的方法。江苏地区Hp对克拉霉素的耐药机制主要为23SrRNAA2143G突变。cagA基因与Hp对克拉霉素耐药不相关。     

聚合酶链反应结合非放射性标记探针检测粪便中微小隐孢子虫

目的：利用非放射性标记探针技术检测经聚合酶链反应扩增后的人粪便中微小隐孢子虫DNA，观察该方法的特异性和敏感性。方法：用裂解法从粪便标本直接制备微小隐孢子虫模板DNA，用一对人工合成的寡核苷酸作PCR引物，扩增长度为452bp的微小隐孢子虫目的DNA片段。将扩增产物直接点在或经Southern印迹法转移到硝酸纤维素膜上，再和生物素标记的寡核苷酸探针杂交，经底物（BCIP）呈色观察。结果：阳性杂交信号只见于微小隐孢子虫DNA扩增产物，而约氏疟原虫、杜氏利什曼原虫、贾第虫、白色念珠菌、大肠杆菌和人白细胞DNA均无杂交信号。PCR结合斑点杂交或Southern印迹法检测隐孢子虫DNA 的敏感性均为011 pg。结论: 非放射性探针检测人粪便隐孢子虫DNA 的PCR 扩增产物, 具有敏感性高、特异性强、操作较简便及无放射性污染等优点。     

General colorimetric method for DNA diagnostics allowing direct solid-phase genomic sequencing of the positive samples.

A system for rapid colorimetric detection of specific genome DNA fragments amplified by the polymerase chain reaction (PCR) is described that has been designed to allow direct solid-phase sequencing of positive samples. The amplified material is immobilized on magnetic beads by using the biotin streptavidin system. An Escherichia coli lac operator DNA sequence is incorporated in the amplified material during the second step of a nested primer procedure. This 21-base-pair sequence is used for a general colorimetric detection with a fusion protein consisting of the E. coli Lac repressor and beta-galactosidase. Positive samples can be treated subsequently with alkali to obtain a single-stranded DNA template suitable for direct genomic sequencing. This method to detect immobilized amplified nucleic acids (DIANA) is well adapted for automated or semiautomated clinical assays. Here, we show that it can be used to detect and sequence Chlamydia trachomatis genomic DNA in clinical samples.     

疟疾复合PCR检测系统的建立

目的：建立简易、快速的复合ＰＣＲ系统,用于检测间日疟、恶性疟及混合感染。方法：以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计疟原虫属特异性上游引物Ｓ１和间日疟原虫、恶性疟原虫种特异性下游引物Ｓ２和Ｓ３,建立双温度点复合ＰＣＲ扩增系统并用于临床血样的检测。结果：从间日疟原虫和恶性疟原虫感染血样中分别扩增出７０５ｂｐ和５７５ｂｐ特定扩增带,而食蟹猴疟原虫、诺氏疟原虫及健康人血样均未见扩增带。检测原虫水平达２－１０虫／μｌ全血。限制性内切酶酶切分析证实扩增产物为目的片段。检测１０４份镜检确诊疟疾患者血样,其中８１份与镜检结果相符,并查出镜检未发现的１７份混合感染和２份虫种鉴别失误的恶性疟。结论：本系统敏感性高,特异性强,操作简便,可在一次扩增中同时检出间日疟和恶性疟两种原虫。     

An improved PCR-based method for detection and differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in formalin-fixed stools

Detection of infectious agents in faecal samples by polymerase chain reaction (PCR) can be limited by the presence of substances which inhibit DNA amplification. Here, an improved protocol is reported for directly isolating DNA from fresh and aged formalin-fixed stools, after concentration by formalin-ethyl acetate (FEA). The protocol was successfully applied to detect DNA of Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar complex in stools by nested PCR, showing high specificity and low detection limit. Extended time of specimen storage in formalin had no influence on PCR yields. This PCR-based method offers technical advantages for routine detection and discrimination of invasive E. histolytica and non-invasive E. dispar.