用半套式PCR检测蜱和啮齿动物中查菲埃立克体

目的　了解福建西北部林区查菲埃立克体 (Ehrlichiachaffeensis)的存在情况。方法　用 16SrRNA基因特异引物进行半套式PCR ,检测从福建武夷山和宁化采集的蜱类及野生动物中的查菲埃立克体DNA ,然后对有代表性的标本的扩增产物进行克隆和序列测定 ,并与GenBank中注册的核苷酸序列进行同源性比较。结果　从该地区的越原血蜱 ,野鼠(褐家鼠、黄毛鼠、黄胸鼠、社鼠、小家鼠 )和野兔的脾脏和 /或血块中均扩增出了查菲埃立克体的特异片段。越原血蜱成蜱 2 40组 (6 16只 ) ,31组阳性 ,最小阳性率 5 0 %。野鼠脾脏标本 39份 ,2 2份阳性。野鼠和野兔血块标本共 35份 ,14份阳性。 390bp的PCR产物经克隆、测序后分析发现其DNA序列与美国查菲埃立克体分离株对应位置一致。结论　福建西北部林区可能存在人单核细胞埃立克体病的自然疫源地。     

查菲埃立克体致病机制研究进展

查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)是一种侵染人单核细胞的专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌。其所致疾病为人单核细胞埃立克体病(Human Monocytotropic Ehrlichiosis, HME),是一种经蜱传播的人兽共患病。查菲埃立克体通过受体介导的吞噬作用侵入宿主细胞,在细胞质空泡中生存和繁殖。其缺乏编码肽聚糖和脂多糖生物合成的基因,影响多种促炎细胞因子的产生,从而抑制宿主的天然或获得性免疫应答。其通过抑制吞噬体溶酶体融合、抑制宿主细胞凋亡、逃避宿主自噬清除、参与蛋白质翻译后修饰等多种方式逃避宿主杀伤而导致持续感染。本文对查菲埃立克体致病机制研究进展进行综述,为进一步了解其与宿主相互作用模式、持续感染机制提供新的研究思路。     

查菲埃立克体和人单核细胞埃立克体病研究进展

埃立克体病是由埃立克体属微生物引起的一类人兽共患急性传染病,其特征为高热、头疼、贫血、白细胞减少、消瘦和黄疸等。查菲埃立克体是埃立克体属中代表性的蜱媒人畜共患病病原体,对人、畜均有较强致病性,在人体引起人单核细胞埃立克体病（HME）。本文较为全面地总结了查非埃立克体和HME的病原学、流行病学、临床表现、诊断和防治等方面的研究进展。     

查菲埃立克体120kDa抗原蛋白基因的克隆与表达

目的 克隆查菲埃立克体120kDa膜表面免疫决定性蛋白基因,并使之在原核表达系统中表达。方法 查菲埃立克体分离株（91HE17）感染DH82细胞40天后收集DH82细胞。根据查菲埃立克体P120蛋白基因序列设计特异性引物,套式PCR扩增查菲埃立允体P120蛋白基因部分片段,将PCR扩增产物用BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶双酶切后与pUC18载体连接,在获得阳性克隆子后用限制性内切酶将克隆片段切下,定向手稿原核表达载体pProEX HTb构建pProEX HTb/P120重组质粒。将重组质粒转化E.coli DH5α,并使之在IPTG的诱导下进行蛋白质表达。结果 裁短成1080bp的查菲埃立克体P120蛋白基因克隆到pUC18载体,用IPTG诱导pProEX HTb/P120重组质粒转化的E.coli DH5α,表达一分子量大小约为47kDa的融合蛋白。结论 查菲埃立克体120kDa抗原蛋白基因能在原核表达系统中表达,为诊断试剂盒的研制及其它研究工作提供了基础。     

用查菲埃立克体P28融合蛋白作免疫印迹诊断犬埃立克体感染

目的 建立以查菲埃立克体P28融合蛋白为抗原的诊断犬埃立克体感染的免疫印迹。方法 诱导PinPoint^TMXa-3/P28重组质粒在E coli细胞内高效表达查菲埃立克体P28融全蛋白,以该重组蛋白作抗原与犬血清行免疫印迹。结果 P28融合蛋白与书籍的3份犬埃立克体感染血清呈阳性反应,与正常犬血清反应为阴性,在165份来自犬埃立克体病疫区的待检犬血清中有43份（26%）与P28反应阳性。结论 查菲埃立克体P28融合蛋白可作为犬埃立克体感染的特异性诊断抗原,以其建立的免疫印迹可用于犬埃立克体病的诊断。     

东北边境地区啮齿动物中新埃立克体感染调查及groEL基因序列分析

目的 了解东北地区啮齿动物新埃立克体(Candidatus Neoehrlichia mikurensis,Nm)感染及基因型分布情况。方法 采用巢式PCR检测从辽宁省宽甸、吉林省集安林区及黑龙江省密山耕地捕获的啮齿动物中Nm groEL DNA, 对阳性扩增产物进行测序和遗传进化分析。结果 PCR检测鼠脾标本共181份, 阳性5份,阳性率为2.76%。不同地区及不同鼠种Nm检出阳性率无明显差异。遗传进化分析显示,从宽甸、集安黑线姬鼠和大林姬鼠检出的5份Nm groEL基因序列与俄罗斯亚洲地区以及我国东北地区Nm同源性最高,基因型为ClusterⅠ型。结论 我国东北东部边境地区鼠类存在Nm感染,可能存在Nm自然疫源地。     

查菲埃立克体28kD表面抗原基因的克隆与表达

目的 克隆和高效表达查菲埃立克体（Ehrlichia chaffensis)28kD表面抗原基因。方法 依据书籍的查菲埃立克体28kD表面抗原基因设计引物,用PCR从查菲埃立克体基因组中克隆该基因片段（531bp）,再将该基因片段定向插入表达载体（PinPoint^TMXa-3）中,然后将该重组质粒转化E.coli JM109细胞。结果 经SDS-PAGE分析,转化子所产生的融合蛋白分子量为32kD,与预期的结果相一致;在37℃用0.1Mn IPTG诱导转化子12h,融合蛋白量达到细菌总蛋白量的35.8%。结论 查菲埃立克体28～kD表面抗原基因在E.coli JM109细胞内得到高效率表达,从而为该抗原的大量制备奠定了基础。     

查菲埃立克体重组120kDa抗原的初步应用研究

目的　克隆查菲埃立克体 12 0kDa膜表面抗原蛋白基因 ,获得纯化的重组蛋白。方法　根据查菲埃立克体(91HE17) 12 0kDa抗原蛋白基因序列设计特异性引物 ,PCR扩增查菲埃立克体 12 0kDa抗原蛋白的基因片段 ;用限制性内切酶酶切PCR扩增产物后与 pUC18载体相连接 ,经酶切和序列分析证实后 ,将目标片段定向插入原核表达载体pProEXHTB中构建pProEXHTB/ p12 0重组质粒 ;将重组质粒转化E coliDH5α ,并使转化子在IPTG的诱导下进行蛋白质表达 ;运用亲和层析和电洗脱法对重组蛋白进行纯化。结果　克隆到一大小为 10 80bp的查菲埃立克体 12 0kDa抗原蛋白的基因片段 ,用该基因与表达质粒连接 ,成功构建了重组表达质粒 ;SDS -PAGE分析显示 :在IPTG诱导下 ,重组表达质粒转化的大肠杆菌产生一分子量为 4 7kDa的目标蛋白 ,免疫印迹证明该重组蛋白能与查菲埃立克体免疫血清发生反应。用纯化的重组蛋白作免疫斑点分析 ,76份被检血清中有 2份为可疑阳性 ,但经IFA复核为阴性。结论　查菲埃立克体 12 0kDa重组抗原蛋白具有免疫反应活性 ,为以重组蛋白为基础的人单核细胞埃立克体病的血清学诊断试剂盒制备和疫苗的研制奠定了基础。     

我国埃立克体的研究进展

埃立克体(Ehrlichiae)是一类严格细胞内寄生的革兰氏阴性菌,主要寄生在单核细胞、粒细胞、或血小板内,引起动物和人的感染——埃立克体病(Ehrlichiosis)。埃立克体分为3个基因群,除腺热埃立克体群外,犬埃立克体群和嗜吞噬埃立克体群均是由蜱传播。长期以来人们认为蜱传埃立克体仅感染动物,而不感染人。然而1987年美国首次报     

福建西北林区人单核细胞埃立克体病分子流行病学调查研究

目的 了解福建西北林区人单核细胞埃立克全病的存在情况。方法 评价以查菲埃立克体16S rRNA基因序列高变区构建引物进行的半套式PCR的敏感性和特异性，并用此种半套式PCR技术检测从福建武夷山市和宁化县采集的蜱类、野生动物内脏和血液及人群血液标本中的查菲埃立克体DNA，对有代表性的阳性标本的扩增产物进行克隆和序列测定，并与GenBank中注册的核苷酸序列进行同源性比较。应用以16S rRNA基因构建的特异和通用引物进行PCR，从越原血蜱及黄毛鼠标本中分段扩增查菲埃立克体DNA，进行克隆和序列测定，分别将其连成完整序列，与已知所有埃立克体及近缘菌的16SrRNA基因序列进行最大同源性比较，用Clustal X(1.8)软件对同源位碱基作聚类分析，应用“Tree View”程序得出遗传发育树图。结果 这种半套式PCR检测方法具有很高的特异性，仅能扩增查菲埃立克体DNA，而对其它蜱媒病病原体，如斑点热立克次体、菜姆病螺旋体的DNA及人粒细胞埃立克体病病原体的16S rRNA基因都不能扩增，同时，用有限稀释法以含EC 16S rRNA基因的质粒为模板评价其敏感度，结果显示：最低能检测到4个拷贝的查菲埃立克体DNA。用此半套式PCR法从该地区的越原血蜱、粒形硬蜱，鼠类（褐家鼠、黄毛鼠、黄胸鼠、神鼠、小家鼠）和野兔的脾脏和/或血块中均扩增出了查菲埃立克体的特异DNA片段。检测越原血蜱成蜱283组（659只），25组阳性，最小阳性率为3.8%。粒形硬蜱4只，1只阳性。野鼠脾脏、血块及野兔血块的阳性率分别为56.4%（22/39）、38.7%(12/31)和18.2%(2/11）。同时检测的其它蜱种、狐狸血块、野猪血块及人血块中均未发现查菲埃立克体DNA。越原血蜱和野鼠代表性标本的390bp的PCR产物经克隆、测序后，发现其DNA序列与美国查菲埃立克体分离株对应位置分别一致和相差一个核苷酸。从越原血蜱和黄毛鼠扩增来的全序列与美国查菲埃立克体分离株的16S rRNA基因序列分别相差6个和2个核苷酸，同源性分别为99.6%和99.9%；与犬埃立克体（E.cn-is）、 尤菌氏埃立克体（E.ewingii）、鼠埃立克体（E.muris）之间的同源性为97.6%～98.0%，属于近缘种；与其它埃立克体种的同源性在83.0%～92.4%之间。结论 上述研究结果提示福建西北部地区可能存在人单核细胞埃立克体病的自然疫源地。越原血蜱和粒形硬埤为其潜在传播媒介，鼠和野兔可能为其贮存宿主。实践证明，半套式PCR及序列分析技术可作为检测蜱和动物标本中查菲埃立克体的一种敏感、特异的方法，适用于现场流行病学调查。本研究首次测定我国南方蜱及啮齿动物中埃立克体的16S rRNA全基因序列，为进一步开展疫源地调查奠定了基础。     

云南临沧地区蜱种分子生物学鉴定及埃立克体基因序列分析

目的 了解云南临沧地区蜱虫种类及其自然感染埃立克体的情况。方法 采集耕牛体表寄生的蜱虫,经形态学鉴定和分组后,从蜱虫中提取DNA,应用PCR扩增蜱虫COI基因以及埃立克体16S rRNA和groEL基因,并测序分析。结果 共采集到蜱虫42只,其中微小牛蜱38只占90.48%、血蜱4只占9.52%。将每种蜱的2只为1组,在21组样本中,检出COI片断21份(检出率100%);在相同的4组样本中均检出埃立克体16S rRNA片断和groEL片断4份(检出率19.05%)。基因序列分析,检出的COI片断序列中有2份与澳大利亚pava血蜱(JX573136)的同源性最高(89.3%),其余19份序列与马来西亚微小牛蜱B3的同源性最高(99.5%);检出的4份16S rRNA片断序列完全一致,与美国查菲埃立克体Arkansas和埃文埃立克体Aa2FT349及中国北京查菲埃立克体BY-YQ-HME-O18株的同源性均为100%;检出的4份groEL片断序列也完全一致,与日本埃立克体Yonaguni206 株的同源性最高均为93.9%。结论 经分子检测证实云南临沧地区耕牛体表微小牛蜱中存在一种类似日本Yonaguni206株的埃立克体感染,耕牛体表还可能寄生一种新的血蜱。     

我国东北部分地区宿主动物感染汉坦病毒的分子流行病学调查

目的了解我国东北部分地区宿主动物携带汉坦病毒状况及其型别。方法采用夹夜法捕鼠，针对不同型别汉坦病毒M片段设计引物，应用RT—PCR检测带毒状况，阳性标本测序，对M片段变异大的标本再进行S片段的扩增测序，获得序列用clustalX（1．83）和Phylip3．63进行分析。结果共捕获鼠类宿主220只，平均阳性率为3．64％，不同鼠种间阳性率差别有统计学意义。其中从棕背鼠平鼠Jilin-54、Jilin-59检测到汉滩型汉坦病毒，从褐家鼠Jilin-99、Ji—lin-106标本中检测到汉城型汉坦病毒。而从大林姬鼠HU-32、Jilin—AP10和HLJ-47中得到的汉坦病毒M片段均与HTNV原型株76-118同源性最高（95．35％～97．42％）；来源吉林（毗邻俄罗斯远东地区）大林姬鼠的Jilin-AP06的汉坦病毒M片段与我国病人分离株B78、H5同源性最高（97.25％～95.33％），与来源俄罗斯远东地区大林姬鼠的Amur类汉坦病毒AP111株同源性为93．48％，与来自吉林大林姬鼠的Jilin93同源性为80．80％，与76-118同源性为80.80％，与朝鲜大林姬鼠分离株Soochong-1同源性为88.24％。Jilin-AP06S片段同其他株的同源性与M片段的结果一致。结论我国东北部分地区宿主动物携带汉坦病毒的型别多样，我国大林姬鼠中存在Amur类病毒感染。     

蜱中人粒细胞埃立克体DNA的PCR检测及序列分析

目的了解吉林地区蜱种感染人粒细胞埃立克体的情况。方法采用16S rRNA基因特异引物进行半套式PCR,检测吉林省部分林区蜱中人粒细胞埃立克体DNA,并对扩增产物进行克隆和测序,与已知序列进行同源性比较。结果从采集于吉林地区的全沟硬蜱中检出人粒细胞埃立克体的特异性DNA片段,阳性率为1.98%。扩增产物经克隆、测序发现吉林地区人粒细胞埃立克体扩增片段与美国人粒细胞埃立克体分离株(GenBank注册号为U02521)16SrRNA基因序列相对应片段相差2个核苷酸,同源性为99.7%。结论吉林地区的全沟硬蜱携带人粒细胞埃立克体,提示吉林地区可能存在人粒细胞埃立克体病的自然疫源地。     

黑龙江逊克地区森林革蜱斑点热立克次体DNA的检测

目的 调查黑龙江逊克地区蜱传斑点热自然疫源地,发现该地区蜱携带斑点热立克次体的种类。方法 采用斑点热立克次体ompA和gltA基因特异的PCR,检测该地区森林革蜱的DNA样本,并对扩得阳性产物进行测序和聚类分析。结果 从60只森林革蜱中检测有14只扩得斑点热立克次体ompA和gltA基因片段,阳性率为23.33%。随机选择2只蜱的阳性片段进行测序,二者同源性为100%,ompA基因序列与Rickettsia sp.JL-02同源性为99.30%, 与Rickettsia raoultii为99.18%。结论 黑龙江省逊克地区森林革蜱携带与Rickettsia sp.JL-02株亲缘关系相近的斑点热群立克次体。     

福建部分地区人和动物嗜吞噬细胞无形体基因检测和序列分析

目的 了解福建省人和动物嗜吞噬细胞无形体的感染状况以及基因特征.方法 收集永春县和上杭县高危人群,家畜的全血,采用巢式PCR扩增无形体16S rRNA片段, PCR产物纯化测序并与序列比对分析.结果 永春县牛的无形体感染率最高为53.85%,羊,狗无形体感染率分别为24.71%和12.50%.上杭县羊的无形体感染率为53.06%,高危人群的无形体感染率为8.33%.无形体基因序列与相应的参考序列同源性均达97%~100%.结论 福建省人和动物存在嗜吞噬细胞无形体感染.     

福建厦门微小牛蜱中埃立克体的检测与鉴定

目的 检测福建厦门微小牛蜱携带的埃立克体，进行分类鉴定。方法 采用套式PCR方法检测埃立克体，然后对阳性标本中的埃立克体进行16SrRNA全基因序列测定并分析。结果 共检测吸血微小牛蜱标本299份，27份阳性，阳性率为9．0％。选择其中的1份阳性样本扩增16SrRNA的全基因序列，全长1458bp，序列对比显示与泰缅边境和越南的埃立克体同源性为99．9％，相差2个碱基；与西藏埃立克体同源性为99．7％，相差4个碱基；与非洲埃立克体同源性为99．6％，相差7个碱基；与中国南方的查菲埃立克体同源性为98．9％，相差17个碱基。结论 从福建厦门微小牛蜱中检测到埃立克体，可能是一个埃立克体新的亚种。     

新疆部分地区鼠类无形体和埃立克体的调查及16srRNA序列分析

目的 调查新疆部分地区鼠类携带无形体和埃立克体的状况.方法 对新疆博乐、石河子、乌鲁木齐3个地区捕获的鼠类(沙鼠、褐家鼠、田鼠)401份,采集肺脏、脾脏提取总DNA,通过巢式PCR扩增无形体和埃立克体16SrRNA片段并与GenBank中相应基因序列进行比对分析.结果 在沙鼠样本中扩增到无形体和埃立克体16SrRNA片段,而在其它两种鼠类未扩增到目的片段,扩增片段经测序、比对后确定为Anaplasma phagocytophilum和Erhlichia chaffeenisis.在312份沙鼠检测样本中,检出无形体17份,占5.45％;埃立克体48份,占15.38％;无形体和埃立克体均检出12份,占3.84％.结论新疆地区存在无形体和埃立克体病原,其主要存在与荒漠和半荒漠地带生存的沙鼠中,新疆存在这两种病原的自然疫源地,而且两种病原可以共同存在于同一宿主动物.