X-连锁凋亡抑制蛋白在顺铂诱导的喉癌Hep-2细胞凋亡中的作用

目的 探讨X-连锁凋亡抑制蛋白(x-linked inhibitor of apoptpsis protein,XIAP)在顺铂诱导喉癌Hep-2细胞凋亡中的作用和机制.方法 体外培养的Hep-2细胞,选择不同浓度的顺铂以不同时间作用于培养的细胞.利用结晶紫法、RT-PCR、流式细胞分析技术研究不同时间、浓度下细胞凋亡的发生率和XIAP、mRNA的表达及两者的相互关系.结果 正常状态下,Hep-2细胞为贴壁细胞,凋亡率低.顺铂作用后细胞凋亡率和XIAP表达水平发生明显变化,表现为XIAP表达水平的下降伴Hep-2细胞凋亡率的升高.不同药物浓度及不同时间点间相比较,细胞抑制率、XIAP的表达及凋亡率差异均有显著性意义.RT-PCR终产物分析表明,随着加药浓度的增加及药物作用时间的延长,XIAP的mRNA水平逐渐降低.相关性分析显示细胞抑制率、凋亡率与药物浓度及药物的作用时间成正相关,而XIAP的表达与药物浓度及作用时间呈负相关,XIAP的表达与调亡率呈负相关.结论 顺铂引起细胞死亡的主要方式是细胞凋亡.XIAP及mRNA在喉癌Hep2细胞中的表达与顺铂的作用浓度及作用时间有双相依赖性.通过诱发XIAP表达水平的降低使细胞的凋亡率升高是顺铂杀伤肿瘤的作用机制之一.     

铜转运蛋白与顺铂耳毒性研究

顺铂是临床上常用的化疗药物,具有抗肿瘤谱广、临床效果显著、价格低廉等优点,然而其耳毒性一直是困扰临床工作者的难题。近年研究发现铜转运蛋白在顺铂进出细胞过程中发挥重要作用。本文就铜转运蛋白与顺铂耳毒性研究的国内外最新进展做一综述。     

脑源性神经营养因子和神经生长因子对顺铂诱导的内耳毒性的保护作用

目的研究豚鼠耳蜗内脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和神经生长因子(nerve growthfactor,NGF)在顺铂致耳中毒后的表达,并探讨其对内耳的保护作用。方法将豚鼠分成对照组、顺铂组,分别给生理盐水、顺铂腹腔注射,于注射后3、5、7天取豚鼠耳蜗行石蜡切片,进行BDNF和NGF免疫组织化学染色,观察螺旋神经节BDNF和NGF蛋白表达。结果对照组耳蜗螺旋神经节细胞中BDNF几乎不表达,NGF呈中度阳性表达。顺铂组BDNF在3天时达到高峰,以后减弱;NGF在5天时达到高峰,以后减弱。结论正常豚鼠耳蜗有中度NGF的表达,表明NGF可能对内耳的正常生理功能起重要作用。顺铂干预后螺旋神经节BDNF和NGF出现高表达,提示BDNF和NGF对顺铂诱导的螺旋神经元损伤有保护作用。     

XIAP与顺铂诱导的感音神经性聋

顺铂是常用的化疗药物，但具有耳毒性，在很多应用高剂量顺铂治疗的患者中出现听力损失的症状。在动物实验和人的颞骨研究中也发现，顺铂可导致耳蜗多部位损伤。听力损伤的机制可能是活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生过多等的原因激发了细胞凋亡。调控细胞凋亡级联反应下游的凋亡蛋白因子可望阻止细胞凋亡和听力损失。本文对顺铂耳毒性及XIAP预防顺铂耳毒性损伤的可能机制进行综述。     

腺病毒介导bcl-2基因转染对顺铂所致大鼠螺旋神经节细胞损伤的拮抗作用

目的 通过腺病毒(adenovirus,Ad)载体介导bcl-2基因转染体外培养的新生大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGC),探讨bel-2蛋白过度表达对顺铂所致SGC损伤的拮抗作用.方法 体外培养新生大鼠SGC,携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的腺病毒载体Ad-GFP转染SGC,并行神经丝蛋白(NF200)免疫细胞化学染色鉴定,激光共聚焦扫描荧光显微镜下观察.携带bel-2基因的腺病毒载体Ad-bel-2转染SGC,蛋白质印迹法(Western Blot)检测bcl-2蛋白表达.设立Ad-bcl-2转染加顺铂组(A组),Ad-GFP转染加顺铂组(B组),顺铂组(C组)和正常对照组(D组),顺铂作用浓度为2μg,/ml;顺铂作用48 h后,行各组SGC计数,并通过lmageJ软件测量各组SGC轴突长度.结果 成功分离并培养新生大鼠SGC.激光共聚焦扫描荧光显微镜下观察到腺病毒载体可安全高效转染体外培养的SGC.Ad-bcl-2转染3 d后,Western Blot检测有外源性人bcl-2基因的高效表达,而Ad-GFP转染组和顺铂组未检测到表达.顺铂作用后,A、B、C组部分SGC细胞突起变短、萎缩,胞体缩小、变圆,甚至浮起.A组SGC数目明显多于B组和C组(P值均＜0.01),但少于D组(P＜0.05);A组SGC轴突长度明显长于B组和C组,但短于D组(P值均＜0.01).结论 腺病毒能够安全高效地转染体外培养的新生大鼠SGC.bel-2蛋白过表达对顺铂所致SGC损伤有一定的拮抗作用.     

糖酵解途径在头颈鳞状细胞癌顺铂耐药的相关研究

头颈鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）是严重危害人类生命及健康的疾病之一。糖酵解是一种糖的分解代谢途径,高度活跃的糖酵解代谢是肿瘤细胞的特征之一,异常增加的葡萄糖摄取和乳酸堆积赋予了肿瘤细胞更好的生长优势。但其在HNSCC恶性进展中的生物学功能及其与免疫微环境、信号通路的相互作用有待进一步明确。顺铂是HNSCC最常用的化疗药物之一,肿瘤细胞多药耐药性的产生可能是影响其疗效的主要原因。以往肿瘤耐药的机制研究显示细胞糖酵解水平降低,本文着重探讨HNSCC顺铂耐药的糖酵解特征,以阐明糖酵解对抗肿瘤药物耐药性的影响和作用机制。     

慢病毒介导的基质金属蛋白酶2基因沉默抑制喉癌侵袭生长的实验研究

目的 探讨siRNA(小干扰RNA)重组慢病毒介导的基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)基因沉默对喉鳞癌侵袭生长的抑制作用.方法 采用RNA干扰技术,将MMP-2基因siRNA的重组慢病毒(MMP-2-RNAi-Lentivirus)转染喉鳞癌Hep-2细胞,并运用蛋白印记法检测Hep-2细胞MMP-2基因的蛋白表达;通过博伊登(Boyden)侵袭小室观察MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后喉癌细胞侵袭能力的变化.构建喉癌移植瘤裸鼠模型,瘤内注射MMP-2-RNAi-Lentivirns,观察抑瘤效果;透射电镜观察肿瘤形态;运用免疫组化方法检测移植瘤中增殖细胞核抗原的表达,以评估细胞增殖的情况.结果 MMP-2-RNAi-Lentivirus能高效地转染靶细胞,转染效率在90%以上.蛋白印迹法检测显示,转染后的Hep-2细胞中MMP-2蛋白表达阴性.侵袭实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus转染后的实验组Hep-2细胞中穿过人工基底膜的平均细胞数(x±s,以下同)为(12±4)个,明显少于空载体对照组的(35±6)个(t=14.492,P<0.01).体内实验显示,MMP-2-RNAi-Lentivirus瘤内注射后,裸鼠移植瘤平均重量和平均体积均明显小于对照组,抑瘤率为44.2%.透射电镜观察到MMP-2-RNAi-Lentivims治疗组肿瘤细胞侵袭表型降低,治疗组肿瘤增殖细胞核抗原指数(49.588±6.995)也明显小于对照组(71.434±7.043,t=9.573,P<0.01).结论 siRNA重组慢病毒介导的MMP-2基因沉默能有效地抑制喉癌的侵袭、生长及增殖,为喉癌的基因治疗提供一定的实验依据.     

尼妥珠单抗联合顺铂同步放化疗治疗中晚期鼻咽癌的疗效及安全性研究

目的 研究尼妥珠单抗联合顺铂同步放化疗治疗中晚期鼻咽癌的疗效及安全性。方法 选取2018年1月~2021年6月期间本院确诊中晚期鼻咽癌患者92例为研究对象,依据随机动态化分组法分为A组(n=47)、B组(n=45)。A组接受顺铂同步放化疗治疗,B组接受尼妥珠单抗联合顺铂同步放化疗治疗。分析患者治疗效果、血管内皮因子、转化治疗因子、肝功能、血常规指标。结果 (1)B组治疗后完全缓解(9.68%)、部分缓解(51.61%)患者占比升高,稳定(32.26%)、进展(6.45%)患者占比下降,较A组差异有统计学意义,P<0.05。(2)治疗后B组VEGF(187.65±18.95)pg/m、TGF-β1(20.08±4.15)μg/ml、ALT(42.08±5.49)U/L较A组差异有统计学意义,P<0.05;两组治疗后WBC、PLT指标及骨髓抑制发生率组间对比结果无统计学差异,P>0.05。结论 尼妥珠单抗联合顺铂同步放化疗治疗中晚期鼻咽癌效果确切,可在积极延缓患者病理机制进展同时,延长病情进展期及生存期,且具备治疗安全性。     

沉默survivin抑制喉癌细胞Hep-2生长的实验研究

目的 探讨沉默survivin对喉癌细胞Hep-2生长的影响.方法 将重组质粒(psi-survivin)和阴性对照质粒(psi-scramble)用脂质体包裹转染人喉癌细胞株Hep-2,分别用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)从mRNA和蛋白水平检测survivin的表达.四甲基偶氮唑蓝(MTT)观察喉癌细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡.建立裸鼠喉癌移植瘤模型,将psi-survivin和psi-scramble注射于肿瘤周围,观察其抗肿瘤的效果.免疫组化法和Western blot法检测重组质粒对肿瘤Survivin蛋白表达的影响.末端脱氧核苷酸转移酶介导的d-UTP缺口末端标记技术(Tunel)观察肿瘤细胞的凋亡.结果 psi-survivin不仅在mRNA水平(抑制率为54.4%),而且蛋白水平也抑制Survivin表达,抑制率为37.0%.MTT证实psi-survivin明显抑制喉癌细胞的增殖,抑制率达71.7%.流式细胞仪结果显示psi-survivin组细胞凋亡明显增加,凋亡率达(13.05±0.56)%((-x)±s,下同).体内实验表明,质粒注射后第32天,盐水组瘤体积为(1443.9±230.5)mm3,psi-scramble组为(1348.5±198.4)Rim3,而psi-survivin组为(624.6±188.4)mm3,与对照组相比,差异有统计学意义(t=-5.917,P＜0.01).psi-survivin能明显抑制肿瘤survivin的表达,抑制率为41.8%,与对照组相比,差异有统计学意义(t=-80.343,P＜0.01).Tunel染色结果显示psi-survivin组肿瘤组织中出现较多凋亡细胞,而对照组未见凋亡细胞.结论 沉默survivin能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长.     

基质金属蛋白酶-12及其编码基因NM_002426在喉鳞状细胞癌中表达的研究

目的：研究基质金属蛋白酶12（MMP—12）蛋白及其基因片段在喉鳞状细胞癌中的表达情况及其与喉癌生物学行为的关系。方法：选取30例声门上喉癌新鲜组织标本（实验组）及0.5cm外正常黏膜组织（对照组），按标本恶性度低、中、高度不同，分别制作不同恶性度的基因芯片，研究其上游基因NM_002426表达比率；用免疫组织化学的方法检测其在组织中的表达情况。结果：NM_002426基因在3种不同恶性度基因芯片中都为高表达比率，较同族的基因片段比率均高，在中、高度恶性芯片中的比率是相应芯片中测定结果中的最高值；免疫组织化学结果显示实验组与对照组MMP12表达率差异有统计学意义（P〈0．01），实验组中转移者与未转移者表达差异有统计学意义（P〈0．05）；而不同恶性度、不同性别间差异无统计学意义。结论：在喉鳞状细胞癌的发生、发展中，NM_002426基因显著增殖，编码产生的大量MMP-12对肿瘤的转移起到了关键作用；MMP—12及其基因的高表达可作为喉癌的辅助诊断依据。     

自杀基因载体对体外鼻咽癌细胞杀伤作用的研究

目的检测pcDNA3.1-Egr-CD（简写为pEC）、pcDNA3.1-hTERT-Survivin（简写为pTS）、pcDNA 3.1-Egr-CD-hTERT-Survivin（简写为pEC-TS）真核表达载体对体外鼻咽癌细胞杀伤作用。方法 pEC、pTS、pEC-TS真核表达载体分别转染CNE-2细胞,在放射线照射后用RT-PCR检测和比较胞嘧啶脱胺酶（CD）、Survivin基因的表达,并通过高效液相色谱（HPLC）检测前体药物5-FC转化成5-FU转化效率。结果检测发现用pEC、pEC-TS转染的CNE-2细胞中CD有效表达,HPLC检测前体药物5-FC转化成5-FU;pTS、pEC-TS转染的CNE-2细胞中Survivin基因表达明显降低。结论在CNE-2细胞转染pEC-TS载体后,CD基因能将5-FC转化成5-FU,并通过hTERT启动子特异性降低Survivin基因的表达,有效的提高了CNE-2肿瘤细胞对5-FU的敏感性;为鼻咽癌基因治疗提供了一种新的思路。     

苯乙酸联合化疗药物对Hep-2细胞凋亡及Bax表达的影响

目的初步探讨苯乙酸联合化疗药物促喉癌细胞凋亡的可能机制。方法体外培养Hep-2细胞,将苯乙酸(phenylacetate,PA)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、顺铂(CDDP)及PA分别联合5-Fu、CDDP,5组药物作用于Hep-2细胞24小时,以无用药Hep-2细胞做为对照组,进行吖啶橙染色,分别检测喉癌细胞凋亡百分率,同时通过Bax免疫组织化学染色,观察Hep-2细胞中Bax的表达。结果①单一用药组及联合用药组与对照组相比,细胞凋亡百分率明显高于对照组(P<0.05),联合用药组与单一用药组相比,细胞凋亡百分率高于单一用药组(P<0.05);②单一用药组及联合用药组与对照组相比,Bax蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05),联合用药组与单一用药组相比,Bax蛋白表达水平明显高于单一用药组(P<0.05)。结论①PA联合5-Fu、CDDP对喉癌细胞的作用与单一化疗药物组比,具有明显促进细胞凋亡的作用;②PA联合CDDP、5-Fu抗喉癌细胞的机制与凋亡有关;③PA联合5-Fu、CDDP促进Hep-2细胞凋亡的机制可能与促进促凋亡基因Bax蛋白的表达有关。     

苯丁酸钠对喉癌Hep-2细胞株诱导化疗的影响

目的:研究苯丁酸钠(PB)与诱导化疗药物对体外喉癌Hep2细胞株的联合作用,探讨PB对喉癌诱导化疗的影响。方法:采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测PB分别与5氟脲嘧啶(5FU)和顺铂(CDDP)联合作用时对喉癌细胞的生长抑制作用。结果:5FU和CDDP分别与PB联合应用时,两药各个剂量组与对照组比较及各个剂量组之间比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);当5FU和CDDP的浓度一定时,PB的各个剂量组之间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:PB能增强诱导化疗药物对体外喉癌细胞的细胞毒作用,为临床增强喉癌诱导化疗的疗效,减少并发症和毒性反应的发生提供了新的思路。     

肿瘤转移抑制基因KAI1在喉鳞状细胞癌中表达的研究

目的　探讨肿瘤转移抑制基因KAI1在喉鳞状细胞癌 (简称鳞癌 )中的表达及其与之发生、发展的关系。方法　采用原位杂交方法检测 84例原发性喉鳞癌 (primarylaryngealsquamouscellcarcinoma ,PLSCC)、2 7例喉癌前病变不典型增生 (laryngealprecancerouslesion ,LPL)、10例声带息肉(vocalcordpolyp ,VCP)和 10例正常喉黏膜 (normallaryngealtissues ,NLT)石蜡标本组织细胞中KAI1mRNA的表达。结果　NLT、VCP、LPL和PLSCC 4种组织中KAI1阳性表达的积分吸光度值 ( x±s)分别为 (136 2 0 6 8± 36 6 75 5 )、(1336 74 5± 4 2 85 8 5 )、(90 36 8 8± 2 5 70 1 9)和 (6 7880 6± 2 8189 5 ) ,其中NLT组和VCP组之间差异无显著性 (t=0 14 2 ,P >0 0 5 ) ,NLT组和LPL组之间差异有显著性 (t =4 2 81,P <0 0 1) ;PLSCC组中KAI1表达普遍下调 ,且病理分化G1 2组阳性表达水平高于G3组 ;T1 2病变组高于T3 4组 ;颈淋巴结NO组高于N1及N1以上组 ;临床Ⅰ Ⅱ期组高于临床Ⅲ Ⅳ期组 (P值均 <0 0 1)。KAI1表达与患者性别无关 (P >0 0 5 )。结论　KAI1低表达在喉鳞癌的发生、发展中可能起着重要作用 ,可望作为喉鳞癌早期诊断、评估肿瘤细胞侵袭转移潜能及患者病程发展阶段的指标之一。     

喉癌患者树突状细胞的体外培养和功能研究

目的 体外分离培养喉鳞状细胞癌患者外周血来源的树突状细胞（dendritic cell,DC）,并研究其功能.方法无菌条件下常规采集外周血20 ml,密度梯度离心分离淋巴细胞,去除悬浮细胞后获得外周血单核细胞.加入GM-CSF、TNF-α、IL-4三种诱导因子,孵育7天后,行透射电镜检查、流式细胞仪检测DC表面活化T细胞所必须的共刺激分子CD80及MTT法检测负载肿瘤抗原后的DC对自体混合淋巴细胞的刺激增殖作用.结果喉癌患者外周血来源的单核细胞经体外培养7天后形态上具有典型的DC特征,高表达DC活化T细胞所必须的共刺激分子CD80为69.15%,且较未在体外诱导培养前（33.76%）明显增高.少量负载肿瘤抗原的DC即可激发强烈的T淋巴细胞增殖作用.结论喉癌患者外周血来源的DC前体细胞可通过体外的分离和培养得到功能正常的DC.     

NP及HN和F基因抗人喉癌的实验研究

目的：探讨基因治疗喉癌的新方法。方法：采用RT-PCR方法及基因重组技术,将新城疫病毒（NDV）的NP、HN及F基因克隆于真核表达质粒pcDNA。中。将体外培养的人喉上皮癌细胞系Hep-2细胞注射给15只裸鼠,制作人喉癌裸鼠模型。肿瘤细胞接种3周后,随机将裸鼠分成2组：实验组（8只）,将pcDNA3-NP、pcDNA3-HN及pcDNA3-F混合注射于肿瘤局部进行治疗;对照组（7只）：将同量空质粒pcDNA。注射于肿瘤局部进行治疗。将2组治疗后的肿瘤组织在光镜和电镜下进行组织病理学及超微结构观察;提取裸鼠各种组织染色体DNA为模板,以成功克隆NP基因的引物为引物,进行PCR检测是否存在NP基因;取裸鼠血清,以NDV V4株作为抗原,进行血清酶联免疫吸附（ELISA）测定。结果：实验组与对照组间的鼠重、瘤重、瘤体积和抑瘤率的差异均有统计学意义（均P〈0．01）。对照组裸鼠死亡1只,其余裸鼠呈恶液质状态,肿瘤呈结节状,表面有破溃。实验组肿瘤较对照组小,肿瘤呈圆形,质地较硬,与皮肤及深部组织无粘连;光、电镜下可见肿瘤细胞坏死与凋亡。实验组未检测到NP基因;实验组血清中抗NDV的免疫球蛋白为阳性,对照组为阴性。结论：NP、HN及F基因具有抗肿瘤作用。     

Dose-dependent access of murine anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody to tumor cells in patients with advanced laryngeal and hypopharyngeal carcinoma

The murine IgG2a monoclonal antibody (mAb) EMD 55900 was produced against the human epidermoid carcinoma cell line A431, with binding occurring to the polypeptide chain of the external domain of human epidermal growth factor receptor (EGF-R). In the present clinical study, 12 patients with advanced squamous cell carcinoma of the larynx or hypopharynx received a single dose of either 20, 100 or 400 mg EMD 55900 3 days prior to laryngectomy and neck dissection. Clinical signs and laboratory parameters of toxicity, development of human anti-mouse antibodies, and mAb plasma concentrations were monitored. In tumor specimens studied from primary tumors and lymph node metastases, expression of EGF-R, distribution of EMD 55900, and occupation of EGF-R by EMD 55900 (double staining) were determined by immunohistochemistry. Single-dose administration of EMD 55900 was very well tolerated in all patients, and good (100 mg) to excellent (400 mg) homogeneous binding of mAb to EGF-R was obtained in the advanced laryngeal and hypopharyngeal carcinomas studied.