KLF4在LPS诱导的心肌细胞损伤中的作用研究

背景:KLF4作为一种转录因子在保持血管内皮功能中发挥重要作用，然而其是否能够保护心肌细胞免受脂多糖诱导的损伤尚不清楚。目的探讨KLF4在脂多糖诱导的心肌细胞损伤中的作用。方法:分离培养原代大鼠乳鼠心肌细胞，将其随机（随机数字法）分为5组：空白组，阴性对照组（NC组），NC+脂多糖刺激组（NC+LPS组），KLF4过表达组，KLF4过表达+LPS组。采用MTT法检测细胞活性，采用试剂盒检测细胞活性氧（ROS），超氧化物歧化酶（SOD2），谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）和丙二醛（MDA）的水平；采用酶联免疫吸附法（Elisa）检测细胞中肿瘤坏死因子（TNFa），白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-6的水平。采用Tunel染色检测细胞凋亡。采用免疫印迹检测TLR4和核因子E2相关因子2（NRF2）的蛋白水平。结果:心肌细胞转染KLF4过表达腺病毒后，细胞中KLF4的表达明显高于NC组（ P<0.05）。NC+LPS组细胞活性明显低于NC组（ P<0.05），KLF4过表达+LPS组细胞活性高于NC+LPS组（ P<0.05）。与对照组相比，NC+LPS组中的心肌细胞TNFα、IL-1β、IL-6蛋白表达水平明显升高（ P<0.0001），KLF4过表达+LPS组心肌细胞TNFα、IL-1β、IL-6蛋白表达水平则显著降低（ P<0.0001）。NC+LPS组心肌细胞ROS和MDA水平明显高于NC组，而SOD2和Gpx的活性低于NC组（ P<0.0001）；KLF4过表达+LPS组心肌细胞ROS和MDA水平的水平明显降低，而SOD2和Gpx的活性明显升高（ P<0.0001）。LPS组心肌细胞凋亡数量明显高于NC组，KLF4过表达+LPS组心肌细胞凋亡数量明显降低（ P<0.001）。LPS组心肌细胞TLR4总蛋白水平高于NC组，NRF2的核蛋白水平低于NC组；KLF4过表达+LPS组心肌细胞TLR4的总蛋白水平降低，NRF2的核蛋白水平显著增高（ P<0.001）。 结论：:KLF4可抑制LPS诱导的心肌细胞损伤，其作用机制可能是通过抑制LPS诱导的心肌细胞中TLR4的表达，促进NRF2向细胞核转移来抑制炎症因子释放，减轻氧化应激损伤及抑制细胞凋亡。     

脓毒症大鼠心肌细胞Toll样受体4和炎症因子基因表达的变化及作用机制

目的 观察脓毒症大鼠心肌细胞凋亡的变化及与Toll样受体4(TLR4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-6(IL-6)基因表达的关系;同时探讨谷氨酰胺(Gln)在脓毒症心肌损伤治疗中的保护作用.方法 采用内毒素脂多糖(LPS)腹腔注射法制备脓毒症大鼠模型.将大鼠随机分为对照组、LPS组及Gln组,再分为术后0、6、12、24 h亚组,每组6只.于相应时间点取心肌组织,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLR4、TNF-α及IL-6的mRNA表达,并观察心肌组织病理学改变.结果 LPS组大鼠心肌细胞凋亡程度增高.LPS组、Gln组各时间点心肌细胞TLR4、TNF-α及IL-6的mRNA表达均较对照组明显增加(P均<0.05).而Gln组心肌细胞凋亡程度较LPS组轻,各时间点TLR4 mRNA表达均较LPS组升高幅度明显降低,且于12 h、24 h差异有统计学意义;TNF-α mRNA表达亦降低,于6 h、24 h差异有统计学意义;IL-6 mRNA表达较LPS组升高幅度降低,且于12 h差异有统计学意义(P均<0.05).结论 TLR4信号转导基因及其调控细胞因子TNF-α、IL-6基因表达在脓毒症心肌细胞损伤的发生发展中起重要作用.Gln通过影响相关基因表达干预脓毒症心肌细胞的凋亡.     

当归多糖减轻癫痫幼鼠海马组织炎症及凋亡的作用及机制

目的:研究当归多糖(APS)减轻癫痫幼鼠海马组织炎症及凋亡的作用及机制。方法:3周龄的雄性SD幼鼠随机分为对照组、模型组、模型+APS组、模型+APS+脂多糖(LPS)组。采用戊四氮点燃的方法建立癫痫模型,给予APS或APS+LPS腹腔注射干预;采用脑电图检测脑电频率及波幅,采用TUNEL染色检测海马组织细胞凋亡率,采用Elisa法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的含量,采用Western Blot检测cleaved caspase-3、bax、bcl-2、TLR4、NF-κB的表达水平。结果:与对照组比较,模型组脑电频率及海马组织中bcl-2的表达水平显著降低,脑电波幅、血清中TNF-α、IL-1β、HMGB-1的含量、海马组织的细胞凋亡率及TNF-α、IL-1β、HMGB-1的含量、cleaved caspase-3、bax、TLR4、NF-κB的表达水平显著增加;与模型组比较,模型+APS组脑电频率及海马组织中bcl-2的表达水平显著增加,脑电波幅、血清中TNF-α、IL-1β、HMGB-1的含量、海马组织的细胞凋亡率及TNF-α、IL-1β、HMGB-1的含量、cleaved caspase-3、bax、TLR4、NF-κB的表达水平显著降低;与模型+APS组比较,模型+APS+LPS组比较,脑电频率及海马组织中bcl-2的表达水平显著降低,脑电波幅、血清中TNF-α、IL-1β、HMGB-1含量、海马组织细胞凋亡率及TNF-α、IL-1β、HMGB-1含量、cleaved caspase-3、bax、TLR4、NF-κB的表达水平显著增加。结论:APS能减轻癫痫幼鼠海马组织的炎症及凋亡,作用可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。     

锌离子对脂多糖作用下大鼠腹膜间皮细胞凋亡的影响及机制

目的 研究锌离子对脂多糖（LPS）诱导的大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）凋亡的影响及机制的探索,从而为锌离子在腹膜透析中的应用提供实验基础.方法 胰蛋白酶消化法培养原代大鼠腹膜间皮细胞、传代、经鉴定后分组：①对照组;②LPS组;③ZnSO4组;④ZnSO4/LPS组.应用AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒及流式细胞仪检测RPMC凋亡率,并采用Westen Blot方法检测细胞外信号调节激酶（P-ERK）,BAX,凋亡诱导因子（AIF）,天冬氨酸特异性半胧氨酸蛋白酶3（caspase3）,天冬氨酸特异性半胧氨酸蛋白酶9 （caspase9）蛋白表达.应用流式细胞术,采用活性氧自由基（ROS）检测试剂盒检测各组别的ROS蛋白表达情况.结果 与对照组相比,LPS组RPMC凋亡细胞数量和相关凋亡蛋白（BAX,AIF,caspase3,caspase9）表达升高（P＜0.01）.与LPS组相比,ZnSO4作用组RPMC凋亡细胞数量和相关凋亡蛋白表达明显降低（P＜0.01）.LPS组ROS显著高于对照组而ZnSO4作用组ROS显著低于LPS组（P＜0.01,P＜0.01）.与LPS组相比,ZnSO4作用组P-ERK的表达明显升高（P＜0.01）.结论 ZnSO4可能可以逆转LPS所致的RPMC凋亡,对腹膜透析相关腹膜炎过程中所导致的RPMC损伤具有保护作用,其作用机制可能是通过ERK通路而发挥作用.     

人退变椎间盘髓核组织中 miR-146a的表达及对 NP细胞增殖、凋亡和炎性细胞因子的影响作用机制

目的　检测人退变椎间盘髓核组织中 miR-146a的表达变化,并探讨其可能的作用机制。方法　实时荧光定量 PCR (qRT-PCR) 检测人退变腰椎间盘髓核组织中 miR-146a表达。用脂多糖（LPS）刺激人髓核（nucleus pulposus,NP）细胞模拟椎间盘变性,qRT-PCR检测 NP细胞中 miR-146a的表达变化。将 miR-146a mimics或 miR-146a inhibitor转染至 NP细胞,然后 LPS刺激 NP细胞,观察 miR-146a对 NP细胞增殖活性、凋亡、 TLR4蛋白表达及 IL-1β,TNF-α和 IL-6等炎性因子水平的影响。结果　miR-146a在椎间盘退变（intervertebral disc degeneration, IVDD组）椎间盘髓核组织中表达（0.65±0.12）明显低于对照组（ 1.01±0.10）,miR-146a在 LPS组 NP细胞中表达（ 0.29±0.11）明显低于阴性对照组（1.06±0.07）,差异均有统计学意义（ t=11.856,10.229,均 P＜ 0.01）。与阴性对照组比较, LPS组上清液中的 IL-1β, TNF-α和 IL-6含量明显升高,差异均有统计学意义（ t=15.572~23.354,均 P＜ 0.001）。上调 NP细胞 miR-146a表达,能够提高 LPS刺激的 NP细胞的增殖活性（ t=4.436~7.995, 均 P＜ 0.05）,降低其凋亡率（ t=9.255,P=0.001）,降低 TLR4蛋白（ t=5.881,P=0.004）和 IL-1β,TNF-α和 IL-6等炎性细胞因子水平（ t=8.854~10.772,均 P＜ 0.01）;而下调 NP细胞 miR-146a表达则出现相反的结果（ t=2.977~6.777,均 P<0.05）。结论　miR-146a在退变椎间盘髓核组织中表达降低, miR-146a可能能够通过靶向 TLR4调控 NP细胞的增殖、凋亡和炎症反应,为椎间盘退变的生物治疗提供了新的方向。     

PRP通过NRF2/HO-1通路对LPS诱导的BV2小胶质细胞神经炎症的保护作用

目的 探究富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的BV2细胞炎症反应保护作用与机制。方法 BV2小胶质细胞分成正常对照组、10%PRP对照组、LPS组(LPS诱导)、3%PRP+LPS组(LPS诱导，3%PRP预处理)、5%PRP+LPS组(LPS诱导，5%PRP预处理)和10%PRP+LPS组(LPS诱导，10%PRP预处理),CCK-8测定BV2细胞增殖。共聚焦显微镜测定BV2细胞线粒体膜电位水平，荧光法检测ROS生成情况，Griess法测定NO水平。Western blot检测IL-6、TNF-α、BACH1、GPX4、NRF2和HO-1蛋白表达。此外，用HO-1抑制剂处理BV2小胶质细胞后实验分为正常对照组，LPS组，ZnPP+LPS组，10%PRP+LPS组，ZnPP+LPS+10%PRP,Western blot检测HO-1、IL-6和TNF-α蛋白表达。结果 与正常对照组相比，PRP促进BV2细胞增殖(P<0.01);LPS组线粒体膜电位下降，ROS生成增多，NO、IL-6、T...     

全氟化碳通过下调TLR4/NF-κB信号通路抑制脂多糖刺激A549细胞分泌TNF-α的研究

目的探讨全氟化碳对内毒素诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549细胞)炎症因子TNF-α表达的影响及机制。方法人肺泡Ⅱ型上皮细胞,传代培养后,均分为3组:空白对照组(C组)、脂多糖(LPS)组、全氟化碳+LPS(P+LPS组),P+LPS组在给予LPS同时加入全氟化碳,LPS的终浓度为10μg/ml,全氟化碳的终浓度为12.5%,各组分别孵育30 min、2 h、4 h、12 h、24 h,结束后用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测核转录因子-κB(NF-κB)、Toll样受体4(TLR4)蛋白表达水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清中TNF-α的水平。结果 (1)Western blot结果显示,C组人肺泡Ⅱ型上皮细胞上有TLR4蛋白的表达,但表达量较低;LPS组人肺泡Ⅱ型上皮细胞在30 min、2 h、4 h、12 h、24 h点TLR4及NF-κB蛋白的表达量明显高于C组(P<0.05);与LPS组比较,P+LPS组人肺泡Ⅱ型上皮细胞30 min、2 h、4 h、12 h、24 h点TLR4及NF-κB蛋白表达明显下降(P<0.05),C组人肺泡Ⅱ型上皮细胞的TLR4及NF-κB蛋白表达量与P+LPS组相比,无明显差异(P>0.05)。(2)ELISA结果显示,与C组比较,LPS组人肺泡Ⅱ型上皮细胞30 min、2 h、4 h、12 h、24 h点TNF-α均明显升高(P<0.05)。P+LPS组人肺泡Ⅱ型上皮细胞30 min、2 h、4 h、12 h、24 h点TNF-α较LPS组均明显降低(P<0.05)。结论 (1)TLR4可能介导了LPS诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞的炎症反应。(2)全氟化碳减轻LPS诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞的炎症反应,可能与抑制细胞表面TLR4的信号活化,进一步抑制下游NF-κB的转导路径,从而降低TNF-α的产生有关。     

雌激素相关受体α对脂多糖诱导的内皮细胞凋亡及连接蛋白降解的影响

目的:探讨雌激素相关受体α（ERRα）对脂多糖（LPS）诱导的内皮细胞凋亡及连接蛋白降解的影响。方法:体外培养ERRα敲低的稳转细胞株,并通过LPS处理,将细胞分为四组：正常对照组（Ctr组）;shERRα敲低组（shERRα组）;正常细胞+LPS处理组（LPS组）：六孔板中的细胞用无血清的培养基饥饿培养12 h后,用20 μg/mL LPS处理12 h;shERRα+LPS组：ERRα敲低的细胞按LPS组处理。使用ROS荧光试剂盒检测细胞内ROS的水平;利用TUNEL、AnnexinV-FITC和PI双染检测细胞凋亡情况;细胞荧光检测连接蛋白ZO-1在细胞膜表达情况,Western Blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Smac、细胞色素c和连接蛋白ZO-1,Occludin、JAM-A及E-Ca在分子水平的表达情况。结果:与Ctr组及shERRα组相比,LPS组ROS水平增加,细胞凋亡率增加（TUNEL检测为16.44±2.55,流式细胞术检测结果为23.56±2.22）,促凋亡蛋白Bax、Smac及细胞色素c表达量增高,而抗凋亡蛋白Bcl-2和紧密连接蛋白表达量降低,细胞荧光结果显示连接蛋白ZO-1在包膜发生降解,网状结构断裂。而与LPS组相比,在shERRα+LPS组中,抑制ERRα的表达加剧上诉细胞损伤。结论:ERRα能够通过负性调节肺微血管内皮细胞内的细胞凋亡,影响肺微血管内皮的功能,从而调控脓毒症诱导的急性肺损伤。     

基于TLR4-NF-κB信号通路的槐果碱改善人支气管上皮细胞炎症和黏液高分泌的机制

目的 基于TLR4-NF-κB信号通路探讨槐果碱（SC）体外抗炎作用及其抗哮喘的潜在效应机制。方法 采用脂多糖（LPS）刺激人支气管上皮细胞NCI-H292诱导体外炎症模型，给予不同浓度SC进行治疗。采用MTT法筛选LPS和SC对NCI-H292细胞的安全浓度；设Control组、LPS组（10μg/mL LPS）、SC组（10μg/mL LPS+不同浓度SC）,ELISA法检测细胞中黏蛋白5AC(MUC5AC)的表达和上清液中白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)的分泌情况；RT-PCR法检测细胞中MUC5AC、IL-6、IL-8、髓样分化因子（MyD88）和核因子-κB(NF-κB p65)mRNA的表达；Western blot方法检测细胞中Toll样受体4(TLR4)、肿瘤坏死因子受体相关蛋白6(TRAF6)、磷酸化p38(p-p38)和磷酸化p65(p-p65)以及细胞核内NF-κB p65的蛋白表达。结果 MTT结果显示，LPS和SC分别在0～10μg/mL、0～40μg/mL浓度范围内对细胞活力无影响；ELISA结果表明，与Control组相比，LPS组细...     

类泛素蛋白FAT10通过Nrf2/HO-1通路对心肌细胞缺血缺氧修复损伤的保护作用

目的 探讨类泛素蛋白人类白细胞抗原F介导转录因子10(FAT10)在心肌细胞缺氧修复损伤中的作用及机制。方法 采用H9C2大鼠心肌细胞构建缺氧复氧模型,将心肌细胞分为对照组、缺氧4 h组、复氧2 h组及复氧4 h组。采用细胞活力检测试剂盒（CCK-8）检测细胞活性,采用Annexin V-FITC/PI法检测心肌细胞凋亡,采用微量酶标法检测乳酸脱氢酶（LDH）。将阴性对照RNA序列（si-CON）和FAT10沉默序列转入心肌细胞,将细胞分为对照组、缺氧4 h+si-CON组、缺氧4 h+siRNA组、复氧4 h+si-CON组、复氧4 h+siRNA组。Western-blot检测细胞FAT10、Nrf2、HO-1蛋白表达水平。结果 随复氧时间延长,心肌细胞存活率下降,心肌细胞损伤加重,细胞凋亡率升高,在复氧4 h后最低。复氧4 h组细胞存活率低于对照组,而LDH水平及细胞凋亡率高于对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。FAT10蛋白表达水平：复氧4 h+siRNA组<缺氧4 h+siRNA组<缺氧4 h+si-CON组,差异均有统计学意义（P<0.05）...     

高容量血液滤过对内毒素休克犬心肌组织Toll样受体4表达的影响

目的 探讨高容量血液滤过(HVHF)对内毒素休克心肌组织Toll样受体4(TLR4)mRNA表达的影响.方法 健康犬16只,静脉注射脂多糖(LPS)650 μg/kg诱导犬内毒素休克模型.将制摸成功的动物按随机数字表法分为对照组和HVHF治疗组,每组8只.用放射免疫法测定血中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-10含量,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定心肌TLR4 mRNA表达,电镜下观察心肌组织病理改变.结果 治疗组HVHF后1、2、4 h血清TNF-α(μg/L:0.59±0.15、0.51±0.12、0.41±0.10)、IL-6(ng/L:11.08±2.83、9.82±2.58、8.25±2.05)、IL-10(μg/L:57.28±5.93、53.81±5.83、50.67±6.33)的含量显著低于本组成模时[(0.84±0.16)μg/L、(16.97±2.50)ng/L、(70.86±5.43)μg/L]和对照组相应时间点[TNF-α(μg/L):0.75±0.14、0.74±0.11、0.72±0.11,IL-6(ng/L):15.33±3.20、14.66±3.24、14.20±3.33,IL-10(μg/L):71.54±4.73、70.71±4.34、69.35±4.60],差异均有统计学意义(均P<0.01).治疗组较对照组心肌TLR4 mRNA表达明显下调(t=3.58,P<0.01).相关分析显示,TLR4 mRNA表达与循环血中TNF-α、IL-6、IL-10浓度呈正相关(r1=0.785,r2=0.569,r3=0.635,均P<0.05).电镜下观察治疗组心肌病理损伤较对照组减轻.结论 HVHF能下调内毒素诱导休克犬心肌TLR4mRNA 表达,减轻心肌炎症反应和心肌损伤.     

吡格列酮抑制肺组织TLR2、TLR4的mRNA表达进而减轻重症急性胰腺炎肺损伤的机制探索

目的:探讨吡格列酮减轻重症急性胰腺炎肺损伤的机制。方法:将30只健康雄性SD大鼠,随机（随机数字法）分为假手术组、模型组、吡格列酮组,每组10只。假手术组大鼠麻醉后,胰胆管逆行注射生理盐水。模型组麻醉后,胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠构建重症急性胰腺炎肺损伤模型。吡格列酮组腹腔注射吡格列酮后再构建模型。每组随机选择6只大鼠于手术后12 h剖杀,留取肺组织及静脉血。检测并比较三组大鼠血清淀粉酶水平及肺组织匀浆中TNF-α、NO水平;采用RT-PCR检测并比较三组肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达情况;比较三组间肺组织病理损伤评分和肺渗漏指数。分析TLR2和TLR4的mRNA表达情况与肺病理损伤评分、肺渗漏指数的相关性。结果:模型组血清淀粉酶及肺组织匀浆中TNF-α、NO水平均显著高于假手术组,吡格列酮组上述指标水平均显著低于模型组,差异均有统计学意义（ P<0.05）。模型组肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达水平以及肺组织病理损伤评分、肺渗漏指数均显著高于假手术组,吡格列酮组上述指标均显著低于模型组,差异均有统计学意义（ P<0.05）。由Spearman相关分析可见肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达水平与肺组织病理损伤评分呈显著正相关关系（rs=0.959, P<0.001;rs=0.924, P<0.001）;由Pearson相关分析可见肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达水平与肺渗漏指数均呈显著正相关关系（r=0.957, P<0.001;r=0.958, P<0.001）。 结论:吡格列酮可能通过抑制肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA的表达进而减轻重症急性胰腺炎肺损伤程度。     

吡格列酮抑制肺组织TLR2、TLR4的mRNA表达进而减轻重症急性胰腺炎肺损伤的机制探索

目的:探讨吡格列酮减轻重症急性胰腺炎肺损伤的机制。方法:将30只健康雄性SD大鼠,随机（随机数字法）分为假手术组、模型组、吡格列酮组,每组10只。假手术组大鼠麻醉后,胰胆管逆行注射生理盐水。模型组麻醉后,胰胆管逆行注射牛磺胆酸钠构建重症急性胰腺炎肺损伤模型。吡格列酮组腹腔注射吡格列酮后再构建模型。每组随机选择6只大鼠于手术后12 h剖杀,留取肺组织及静脉血。检测并比较三组大鼠血清淀粉酶水平及肺组织匀浆中TNF-α、NO水平;采用RT-PCR检测并比较三组肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达情况;比较三组间肺组织病理损伤评分和肺渗漏指数。分析TLR2和TLR4的mRNA表达情况与肺病理损伤评分、肺渗漏指数的相关性。结果:模型组血清淀粉酶及肺组织匀浆中TNF-α、NO水平均显著高于假手术组,吡格列酮组上述指标水平均显著低于模型组,差异均有统计学意义（ P<0.05）。模型组肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达水平以及肺组织病理损伤评分、肺渗漏指数均显著高于假手术组,吡格列酮组上述指标均显著低于模型组,差异均有统计学意义（ P<0.05）。由Spearman相关分析可见肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达水平与肺组织病理损伤评分呈显著正相关关系（rs=0.959, P<0.001;rs=0.924, P<0.001）;由Pearson相关分析可见肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达水平与肺渗漏指数均呈显著正相关关系（r=0.957, P<0.001;r=0.958, P<0.001）。 结论:吡格列酮可能通过抑制肺组织TLR2 mRNA、TLR4 mRNA的表达进而减轻重症急性胰腺炎肺损伤程度。     

锌指蛋白A20对脂多糖诱导的大鼠腹膜间皮细胞炎症效应的影响

目的 探讨锌指蛋白A20（zinc finger protein A20）对脂多糖（LPS）诱导的大鼠腹膜间皮细胞（RPMCs）炎症效应的影响及可能机制. 方法 分离及培养RPMCs,常规传代及鉴定.取第2代细胞用于实验研究.将细胞随机分成对照组、LPS组、转染A20组、空载体组.脂质体转染A20质粒（pGEM-T easy A20）至RPMCs 12h后分别在LPS刺激不同时间点收获细胞提取蛋白及细胞上清液.用Western b]otting检测细胞TLR4、p-Iκ Bα、IκBα蛋白的表达;用ELISA法检测培养上清液IL-18蛋白水平. 结果 LPS刺激8h后,转染A20组RPMCs TLR4蛋白表达水平无明显增高,与对照组相比,P=0.223;与LPS组及空载体组相比,差异有显著性（P=0.003,0.002）.LPS刺激1h后,转染A20组RPMCs p-IκB α蛋白无明显降解,p-I κ Bα/I κ Bα比值与对照组相比,P=0.553.与LPS组及空载体组相比,差异有显著性（P=0.001,0.001）.在LPS刺激12h后,转染A20组RPMCs IL-18蛋白分泌水平（479.12±85.79）pg/ml高于对照组（274.34±47.21） pg/ml （P=0.012）,但明显低于LPS组（1049.45±185.01）pg/ml及空载体组（1028.77±192.90） pg/ml （P=0.011,0.015）.结论 A20通过对LPS信号通路中多个相关功能蛋白的负性调控作用,阻抑LPS诱导的RPMCs炎症效应.     

LncRNA NEAT1/miR-23b-3p/KLF3 轴调控结直肠癌细胞的生物学功能研究

目的 探究长链非编码核糖核酸（long non-coding RNAs,LncRNAs）NEAT1/miR-23b-3p/KLF3 调控轴对结直肠癌细胞生物学功能的影响。方法 利用癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）数据库分析结直肠癌组织和癌旁组织NEAT1,miR-23b-3p 和KLF3 表达水平,并计算三者之间的相关性。以结直肠癌细胞系（HT29 细胞）作为实验对象,实验被分为Control 组（空白对照组）、NC 组（空载体组）和si-NEAT1 组（NEAT1 干扰组）。CCK8 检测各组细胞的增殖情况,流式细胞术检测各组细胞的凋亡、周期情况,Transwell 检测各组细胞的侵袭情况,划痕实验检测各组细胞的迁移情况。在线工具starbase 等预测能与miR-23b-3p 靶向结合的基因,采用人胚胎肾细胞293（humanembryonic kidney cells 293,HEK293）进行双荧光素酶报告基因实验验证。qRT-PCR 检测NC 组、si-NEAT1 组、si-NEAT1+miR-23b-3p inhibitor 组（共转染si-NEAT1 和miR-23b-3p inhibitor）的miR-23b-3p 和KLF3 转录水平,免疫印记法检测以上三组KLF3 蛋白质表达水平。结果 结直肠癌组织NEAT1[5.29（4.55,5.95）], KLF3[4.94（4.62,5.24）] 表达高于癌旁组织[4.79（4.26,5.19）, 4.49（4.24,4.80）],差异有统计学意义（U=6 677, P=0.001;U=28 257.5, P ＜ 0.001),miR-23b-3p 表达低于癌旁组织[9.99（9.49,10.6） vs 10.80（10.62,10.88）],差异有统计学意义（U=2 906, P=0.004）。结直肠癌组织中,NEAT1 和KLF3 表达呈正相关（r =0.26, P ＜ 0.01）,miR-23b-3p 和NEAT1, KLF3 表达量均呈负相关（r=-0.14, P=0.008; r =-0.17, P=0.001）。与对照组相比,si-NEAT1 组使结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭的能力降低,凋亡增加,细胞被阻滞在S 期,结果差异均有统计学意义（均P ＜ 0.05）。starbase 预测miR-23b-3p 靶基因为NEAT1 和KLF3。双荧光素酶报告基因实验也证实miR-23b-3p 分子能互补结合NEAT1 和KLF3 3’UTR。与NC 组相比,si-NEAT1组miR-23b-3p 表达上调,KLF3 转录和蛋白水平下调;与si-NEAT1 组相比,si-NEAT1+miR-23b-3p inhibitor 组miR-23b-3p 表达下调,KLF3 转录和蛋白水平上调。结论 NEAT1 可通过直接靶向HT29 细胞中的miR-23b-3p 上调KLF3 表达,增强结直肠癌细胞的增值、侵袭和迁移等。     

类风湿性关节炎患者早期外周血单个核细胞Toll样受体2、4表达及意义

目的探讨类风湿性关节炎(RA)早期患者外周血单个核细胞(PBMC)Toll样受体(TLR)2、TLR4对其配体双糖链蛋白多糖(BGN)、脂多糖(LPS)的刺激反应性,阐明PBMC TLR2、TLR4在RA疾病早期中的作用。方法采用流式细胞术、实时荧光定量逆转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测BGN和LPS刺激前后,RA组和健康对照组外周血CD14+单核细胞TLR4+细胞频率、PBMC TLR2 mRNA和TLR4mRNA及上清液白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的含量变化。结果 RA早期患者TLR2 mRNA明显升高、TLR4 mRNA下降(P<0.01);经LPS刺激后,RA患者TLR4 mRNA升高3.50倍,而健康对照组下降到0.11倍;LPS和BGN促进了各组PBMC产生IL-6、TNFα,但RA早期患者组上升的倍数明显高于健康对照组。结论 PBMC TLR2、TLR4参与早期RA的发生、发展。     

脊柱术后细菌感染过程中脂多糖通过TLR-4/NF-кB途径诱导降钙素原的机制

目的探究脊柱术后细菌感染过程中脂多糖通过TOLL样受体4(TLR-4)/核因子κB(NF-κB)途径诱导降钙素原(PCT)的机制。方法 60只雌性C57BL/6小鼠(9周龄,18～22 g)按照随机数字表法分为对照组、革兰阴性(G^-)感染组和革兰阳性(G⁺)感染组,每组20只。通过体内生物发光测量小鼠细菌感染数量。通过蛋白印迹法分析小鼠组织脂多糖、TLR-4、NF-κB和PCT的蛋白表达。通过酶联免疫试剂盒检测小鼠血清炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)的浓度。通过蛋白印迹法分析Bax和B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)的蛋白表达。通过定量逆转录PCR(RT-q PCR)分析核因子Kappa B抑制剂的激酶(IKK)α/β、IκB和p65的mRNA表达。结果术后第1天,各组小鼠细菌感染数量比较差异无统计学意义(P>0.05),第2天和3天,G^-感染组和G⁺感染组的细菌数量较对照组升高,差异均有统计学意义(P <0.05); G<...     

慢性盆腔炎模型大鼠中miR-29 及炎症信号通路分子的表达水平及其作用机制研究

目的 探究微小核糖核酸(micro RNA,miR)-29 对大鼠慢性盆腔炎模型的作用并探究其作用机制。方法 将80 只SPF 级SD 大鼠随机分为四组,分别为对照组(n=20)、模型组(n=20)、阴性对照组(n=20)和试验组(n=20)。模型组、阴性对照组和试验组通过机械损伤及接种混合菌构建大鼠慢性盆腔炎模型,阴性对照组和试验组造模后通过尾静脉注射5nmol 阴性对照(negative control, NC)antagomiR 和miR-29 antagomiR。HE 染色检测大鼠子宫组织病理特性;酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测各组大鼠外周血炎症相关指标:白细胞介素(interleukin,IL)-1β,白细胞介素(IL)-6,白细胞介素(IL)-8 和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α 水平;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测子宫组织miR-29,Toll 样受体4(Toll-like receptors,TLR)4,核因子κB(nuclear factor,NF-κB)及NK-κB 抑制蛋白α(IκB α)表达水平;WesternBlot 检测子宫组织TLR4,NF-κB 和IκB α 蛋白表达水平。结果 HE 染色结果表明,与对照组相比,模型组、阴性对照组和试验组大鼠出现明显慢性盆腔炎症状,试验组子宫组织损伤显著缓解;ELISA 结果表明:模型组大鼠外周血IL-1β,IL-6,IL-8 和TNF-α 水平显著高于对照组,与模型组和阴性对照组相比,试验组炎症因子IL-1β,IL-6,IL-8 和TNF-α 释放显著降低,差异有统计学意义(t=3.021 ～ 6.878,均P ＜ 0.05);qPCR 结果表明,与对照组相比,模型组miR-29,TLR4,NF-κB 和IκB α 的mRNA 表达显著上升,与模型组和阴性对照组相比,试验组miR-29 ,TLR4,NF-κB 和IκB α的 mRNA 表达显著降低,差异有统计学意义(t=3.917 ～ 8.095,均P ＜ 0.05)。Western Blot 结果表明:与对照组相比,模型组TLR4,NF-κB 和IκB α 蛋白表达显著上升,与模型组和阴性对照组相比,试验组TLR4,NF-κB 和IκBα 蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(t=2.987 ～ 8.045,均P ＜ 0.05)。结论 慢性盆腔炎模型大鼠子宫组织中miR-29 显著高表达,下调miR-29 具有对大鼠子宫的保护作用,其机制可能与抑制炎症因子释放及TLR4/NF-κB 信号通路的调控相关。