环磷酰胺或塞替派诱导人支气管上皮细胞恶性转化的形态计量学

以永生化人支气管上皮细胞 (BEAS- 2 B)分别受环磷酰胺 (BEAS- CP) ,塞替派 (BEAS- TE)暴露并发生转化的细胞为模型 ,对转化细胞进行形态计量学研究 ,期望寻找人类上皮细胞恶性转化的形态计量指标 .结果表明 :BEAS- 2 B经两种药物处理后可生成转化型和非转化型细胞集落 .转化细胞的形态计量参数中 ,细胞和细胞核面积 ,最大直径 ,最小直径 ,等效直径 ,形状因子的数值按 BEAS- 2 B,BEAS- CP,BEAS- TE的组序递升 .表达细胞形态为异形的指标 :细胞和细胞核异形指数 ,核浆比则沿BEAS- 2 B,BEAS- CP,BEAS- TE的顺序递减 .结果提示 ,上述改变可能是细胞由正常趋向恶性增殖的形态特征     

环磷酰胺及塞替派诱导的人支气管上皮恶性转化细胞的p16INK4a及p15INK4b基因突变

目的了解环磷酰胺(CP)和塞替哌(TEPA)诱导永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)的恶性转化株内BEAS-CP和BEAS-TE细胞p16和p15基因的突变情况.方法采用聚合酶链反应(PCR)、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)及DNA序列分析技术.结果 BEAS-CP细胞p15基因的外显子1和外显子2都出现了异常带型.BEAS-TE细胞p16基因的外显子1及外显子2a出现了异常带型和迁移率滞后现象;p15基因外显子1的2条单链带之间出现异常条带.DNA序列分析发现BEAS-CP细胞的p15基因外显子1的182位有C的插入,206位有G的插入;外显子2的第308位密码子有C→T(TCC→TTC)转换(Ser→Phe),第327位密码子有T→A(AAT→AAA)颠换(Asn→Lys).BEAS-TE细胞的p16基因外显子2a的第125位密码子有G→A(CGC→CAC)转换(Arg→His).结论 p15基因在CP诱导BEAS-2B发生恶性转化的过程中发挥了重要作用.在TEPA诱导BEAS-2B细胞发生恶性转化的过程中可能涉及了p16基因的失活.     

1-02 塞替派诱发永生化人支气管上皮细胞的恶性转化

目的研究塞替派对人类上皮细胞的致癌转化效应.方法利用永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)为基本细胞模型,首次进行了塞替派诱导BEAS-2B细胞的恶性转化实验;平行于细胞的转化进程研究了塞替派转化细胞(BEAS-TE)的增殖动力学、细胞周期和锚着独立生长能力等转化表型特征.结果经传代和软琼脂培养基筛选BEAS-TE已具有较为稳定的转化表型和细胞生物学特性,可能是具有较强裸鼠致瘤性的恶性转化细胞.结论塞替派对人支气管上皮细胞具有较强的恶性转化效应.     

环磷酰胺及塞替派诱导的人支气管上皮恶性转化细胞的p16INK4a及p15INK4b基因突变

目的 了解环磷酰胺（CP）和塞替哌（TEPA）诱导永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)的恶性转化株内BEAS-CP和BEAS-TE细胞p16和p15基因的突变情况。方法 采用聚合酶链反应(PCR)、聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)及DNA序列分析技术。结果 BEAS-CP细胞p15基因的外显子1和外显子2都出现了异常带型。BEAS-TE细胞p16基因的外显子1及外显子2a出现了异常带型和迁移率滞后现象；p15基因外显子1的2条单链带之间出现异常条带。DNA序列分析发现BEAS-CP细胞的p15基因外显子1的182位有C的插入，206位有G的插入；外显子2的第308位密码子有C→T(TCC→TTC)转换（Ser→Phe），第327位密码子有T→A(AAT→AAA)颠换(Asn→Lys)。BEAS-TE细胞的p16基因外显子2a的第125位密码子有G→A(CGC→CAC)转换(Arg→His)。结论 p15基因在CP诱导BEAS-2B发生恶性转化的过程中发挥了重要作用。在TEPA诱导BEAS-2B细胞发生恶性转化的过程中可能涉及了p16基因的失活。     

环磷酰胺及塞替派诱导人支气管上皮细胞恶性转化的超微结构

为了解抗癌化疗药环磷酰胺(CP)及塞替派(TE)诱导的永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中的细胞超微结构的动态变化,采用透射电镜方法观察的细胞模型由对照永生化人支气管上皮细胞（BEAS-2B）,受环磷酰胺（BEAS-CP）和塞替派（BEAS-TE）诱导的恶性转化细胞组成. 发现经CP和TE暴露的细胞可出现细胞死亡,凋亡和转化,它们具有各自的超微结构特征．说明逃逸细胞死亡,凋亡的支气管上皮基细胞呈增生性改变,这种增生性基细胞经过扩增后将成为转化细胞群主体并且具有肿瘤细胞的增生特性.     

塞替派诱发人支气管上皮细胞恶性转化

目的观察抗癌药物塞替派诱发永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中相关基因的突变并分析其意义.方法以塞替派作为致癌原诱导永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B),获得转化细胞(BEAS-TE)和克隆化多倍体癌前转化细胞(BEAS-STE).采用PCR-SSCP法检测上述3种细胞p53、p16和Ki-ras 3种基因是否出现点突变,进一步测序确定其突变情况.结果 SSCP结果阳性的有BEAS-TE细胞p53第7外显子,BEAS-STE细胞p53第8外显子以及这二种细胞的p16基因第1外显子;Ki-ras基因第1外显子的结果仅为可疑阳性.测序证明,p53、Ki-ras基因存在多位点的碱基突变,而p16基因仅为单位点的碱基突变.结论塞替派可诱发人支气管上皮细胞p53、Ki-ras多位点的碱基突变和p16的单位点突变.分析前者为塞替派诱导细胞转化过程中发生的重要分子事件,后者是次要分子事件.     

1-03 塞替派诱发人支气管上皮细胞恶性转化的基因突变

目的了解药物致癌过程中的基因突变情况.方法利用以塞替派为致癌原诱导永生化人支管上皮细胞(BEAS-2B)发生恶性转化建立的癌前转化细胞(BEAS-TE)以及从软琼脂上筛选到了克隆化多倍体细胞,沿转化细胞代龄进行了转化进程中p53、p16和Ki-ras基因突变情况的动态观察.结果p53、Ki-ras基因存在多位点、p16基因单位点的的碱基突变.结论p53和Ki-ras基因的多位点突变是塞替派诱导细胞转化过程中发生的重要分子事件,p16基因非编码区单个碱基的缺失是细胞转化过程中的次要分子事件.     

环磷酰胺及塞替派诱导人支气管上皮细胞恶性转化的超微结构

为了解抗癌化疗药环磷酰胺 (CP)及塞替派(TE)诱导的永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中的细胞超微结构的动态变化 ,采用透射电镜方法观察的细胞模型由对照永生化人支气管上皮细胞(BEAS- 2 B) ,受环磷酰胺 (BEAS- CP)和塞替派(BEAS- TE)诱导的恶性转化细胞组成 .发现经 CP和 TE暴露的细胞可出现细胞死亡 ,凋亡和转化 ,它们具有各自的超微结构特征 .说明逃逸细胞死亡 ,凋亡的支气管上皮基细胞呈增生性改变 ,这种增生性基细胞经过扩增后将成为转化细胞群主体并且具有肿瘤细胞的增生特性     

CSC诱导BEAS-2B细胞恶性转化中miRNA表达谱变化

目的通过烟草烟雾凝集物(cigarette smoke condensate, CSC)慢性染毒永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B体外构建恶性转化细胞模型,miRNA芯片技术筛选模型中差异表达的miRNAs,发现与恶性转化相关的miRNAs,为进一步研究CSC诱导恶性转化的作用机制提供实验基础。方法 CCK-8检测细胞存活率,确定CSC染毒终浓度。划痕实验、克隆形成实验、MTT实验及凋亡检测评估细胞恶性转化情况。MiRNAs芯片检测BEAS-2B和CSC30组细胞,明确差异表达谱。表达下调的hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521进行RT-PCR验证。结果 CSC诱导的恶性转化细胞迁移能力、克隆形成能力和增殖活力明显增强,凋亡率明显下降。相对于BEAS-2B组,CSC30组细胞中有78种miRANs差异表达,其中52种表达上调,26种表达下调。RT-PCR验证hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521表达下调与芯片结果一致。结论 CSC可诱导BEAS-2B细胞发生恶性转化,采用miRNA芯片技术筛选到miRNA差异表达谱,其可能与CSC诱导恶行转化的发生发展有关。     

DNMTs在长期氡暴露致BEAS-2B细胞恶性转化过程中的作用

目的检测经长期氡暴露而发生恶性转化的人永生化支气管上皮细胞(BEAS-2B)中甲基化转移酶(DNMT)基因的动态变化,从表观遗传学层面探索氡致肺癌的作用机制。方法应用流式细胞仪分析法,软琼脂集落形成及裸鼠成瘤实验鉴定长期氡暴露过程中BEAS-2B细胞的恶性转化程度,以QPCR方法检测DNMT1、DNMT3A的mRNA表达量。结果与对照组细胞相比,染氡30代传代至40代的细胞软琼脂克隆形成率已升高至27.27%±1.10%(P<0.05),转化细胞在裸鼠体内成瘤率达到30%(P<0.05),呈低分化癌;QPCR结果显示各染氡组传至40代细胞DNMT1 mRNA表达量均低于对照组,DNMT3A mRNA表达量均高于对照组。结论建立并确认了体外染氡诱发BEAS-2B细胞恶性转化模型,且细胞恶性程度随染氡代数和传代代数的增加呈现剂量-效应关系,细胞出现移植成瘤。本试验条件下,DNMTs表达的改变导致细胞增殖失控,打破内环境平衡,这可能是在表观遗传学中,长期氡暴露致BEAS-2B细胞恶性转化的机制之一。     

塞替派、环磷酰胺诱发的人支气管上皮恶性转化细胞的致瘤性

目的　观察塞替派 (TE)及环磷酰胺 (CP)能否诱发永生化人支气管上皮恶性转化细胞成瘤。方法以永生化人支气管上皮细胞 (BEAS 2B)为对照 ,以TE诱发转化细胞 (BEAS TE)的琼脂糖克隆扩增细胞(BEAS STE)及CP诱发转化细胞 (BEAS CP)的琼脂糖克隆扩增细胞 (BEAS SCP)为靶细胞接种于 3～ 4周龄裸鼠 ,每组接种 6只 ,♂♀各半。结果　接种后2 6周 ,对照组无一长出肿瘤 ,BEAS STE组有 5只长出肿瘤 ,BEAS SCP组有 1只长出肿瘤 ,其中BEAS STE组有 3只裸鼠的肿瘤直径在 1cm以上。经病理组织形态和免疫组织化学检查证实肿瘤为低分化癌肉瘤组织。结论　TE、CP诱发恶性转化的人支气管上皮转化细胞均具有裸鼠致瘤性。     

环磷酰胺及塞替派诱导的人支气管上皮恶性转化细胞的细胞周期相关蛋白表达

目的　了解细胞周期调控系统各正、负调节因子在细胞发生恶性转化过程中的变化情况。方法　采用免疫组化技术分别检测了经环磷酰胺(CP)和塞替派 (TEPA)诱导永生化人支气管上皮细胞 (BEAS 2B)发生恶性转化的BEAS CP和BEAS TE细胞中P5 3、P16、P15、细胞周期蛋白 (cyclin)D1和RB蛋白的表达。结果　BEAS 2B细胞中表达阳性的P16、P15及RB蛋白 ,在BEAS CP和BEAS TE细胞中表达缺失 ;BEAS 2B细胞中检测呈阴性的P5 3蛋白 ,在BEAS CP和BEAS TE细胞中呈阳性 ;cyclinD1蛋白在 3株细胞中检测均为阳性。结论　转化细胞中P16、P15及RB蛋白的表达异常可能影响了细胞周期中P16 (P15 ) /cyclinD1 CDK4 /pRB调控途径的自稳平衡。两转化细胞P5 3蛋白的阳性表达提示转化细胞P5 3蛋白的功能已发生改变。     

环磷酰胺诱导永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中的基因突变

环磷酰胺 (CP)是国际癌症研究署确认的人类I组致癌原 ,目前缺乏适宜的人类细胞模型开展致癌相关的细胞和分子机理的研究 .本室已经进行了CP诱导永生化人支气管上皮细胞 (BEAS 2B)恶性转化的工作 ,建立了CP的癌前转化细胞 (BEAS CP) ,以此为细胞模型 ,本实验运用聚合酶链式反应单链构象多态性和序列分析的方法进行了细胞转化进程中基因突变的动态分析 .分别关注了p5 3基因第5～ 8,p16基因第 1～ 2和ki ras基因第 1外显子的突变情况 .研究结果表明 :BEAS CP细胞存在p16基因第 1外显子多位点和ras基因第 1外显子单位点的碱基突变 ,晚代龄的转化细胞没有测到p5 3基因的突变 .综上实验结果认为 :p16基因突变可能与BEAS CP细胞周期的增殖性改变有关 ,ki ras基因的突变则可能具有转化启动效应 ,两者都是细胞转化过程中的重要分子事件     

塞替派诱发人支气管上皮恶性转化成瘤细胞的染色体畸变

目的　旨在了解转化细胞在成瘤过程中的细胞遗传学改变。方法　运用染色体G显带技术研究永生化人支气管上皮细胞 (BEAS 2B)恶性转化后的裸小鼠接种成瘤细胞 (BEAS TT)的染色体畸变。结果　瘤细胞在传代早期基本以近二倍体细胞为主 ,随着细胞代龄的增加 ,各肿瘤细胞系的细胞染色体数目变化趋势不同 ,其中BEAS TTa逐渐形成以多倍体细胞为主的细胞群 ,而BEAS TTb ,BEAS TTc则以近二倍体细胞为主份额细胞。核型分析表明 3个瘤细胞系的核型与BEAS TE不同 ,在其基础上有新的染色体 (14号染色体 )丢失和标记染色体 (M4 )的增加。结论　细胞染色体数目不稳定 ,14号染色体的丢失和M4染色体的增加 ,可能与BEAS TE的裸小鼠成瘤性有关     

Aldehyde dehydrogenase 1A1 up-regulates stem cell markers in benzo[a]pyrene-induced malignant transformation of BEAS-2B cells

Recently, Aldehyde dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) has been proposed to be a common marker of cancer stem cells and can be induced by benzo[a]pyrene (B[a]P) exposure. However, the underlying mechanism of how ALDH1A1 contributes to B[a]P-induced carcinogenesis in human bronchial epithelial cells remains unclear. Here, we found that B[a]P up-regulated expression levels of stem cell markers (ABCG2, SOX2, c-Myc and Klf4), epithelial-mesenchymal transition (EMT) associated genes (SNAIL1, ZEB1, TWIST and β-CATENIN) and cancer-related long non-coding RNAs (lncRNAs; HOTAIR and MALAT-1) in malignant B[a]P-transformed human bronchial epithelial cells (BEAS-2B-T cells), and these up-regulations were dependent on increased expression of ALDH1A1. The inhibition of endogenous ALDH1A1 expression down-regulated expression levels of stem cell markers and reversed the malignant phenotype as well as reduced the chemoresistance of BEAS-2B-T cells. In contrast, the overexpression of ALDH1A1 in BEAS-2B cells increased the expression of stem cell markers, facilitated cell transformation, promoted migratory ability and enhanced the drug resistance of BEAS-2B cells. Overall, our data indicates that ALDH1A1 promotes a stemness phenotype and plays a critical role in the BEAS-2B cell malignant transformation induced by B[a]P.