去抗原异种松质骨作为骨组织工程载体的可行性

目的：对自行研制的去抗原异种松质骨材料与骨髓基质细胞复合培养进行生物相容性进行评价，为骨组织工程中生物材料的选择提供实验依据。 方法：实验于2004—05／2005—05在教育部省部共建新疆民族与地方高发病重点实验室完成。①取新生小牛股骨下端松质骨，锯成15mm&;#215;5mm&;#215;5mm大小骨块，经1：1氯仿，HCl，H2O2和PBS＋NaOH＋NaM混合液等物理化学处理．制成去抗原异种松质骨载体。①选用清洁级健康3月龄新西兰大白兔2只，抽取骨髓．通过密度梯度离心和贴壁筛选法分离纯化骨髓基质细胞，将传代至第3代细胞接种于24孔培养板内，实验分为2组：实验组每孔加入5mm&;#215;5mm&;#215;3mm去抗原异种松质骨材料一块。对照组单纯接种细胞，每组4孔。于4，8d后进行处理．用于观察及检测。③通过扫描电镜、MTT测试法、考马斯亮蓝和碱性磷酸酶活性检测法，观察去抗原异种松质骨材料对细胞生长、增殖及功能表达的影响。 结果：①骨髓基质细胞生长情况：倒置相差显微镜观察，骨髓基质细胞能在去抗原异种松质骨材料上黏附、增殖，细胞形态良好。②骨髓基质细胞在去抗原异种松质骨材料生长结果：扫描电镜观察，骨髓基质细胞在去抗原异种松质骨材料生长良好。③实验组于接种后4和8d骨髓基质细胞增殖、蛋白质含量和碱性磷酸酶活性（A值）分别为0．50&;#177;0．03．0．78&;#177;0．10．0．44&;#177;0．02和0．73&;#177;0．14，1．21&;#177;0．07，0．59&;#177;0．03，与对照组（0．51&;#177;0．02．0．80&;#177;0．15，0．45&;#177;0．01；0．70&;#177;0．11．1．20&;#177;0．04，0．60&;#177;0．02）比较，差异不明显（P〉0．05）。 结论：去抗原异种松质骨对骨髓基质细胞体外增殖和蛋白质合成无不良影响，对骨髓基质细胞的生长增殖无明显的干扰作用，对骨髓基质细胞向成骨细胞转化无影响，即去抗原异种松质骨材料无细胞毒性；同时具有良好的细胞相容性，可用作骨组织工程的支架材料。     

三种去抗原异种松质骨材料生物相容性的比较**

背景：经过一系列理化处理去抗原后的异种骨支架材料,其形态与结构类似于人体骨组织。目的：检测3种不同方法制备去抗原异种骨支架材料的生物相容性。方法：将经过物理、化学及物理联合化学方法制备的去抗原异种骨支架与羟基磷灰石生物陶瓷4组材料分别植入裸鼠背部皮下组织,术后4,8,12周行组织学观察。以经过物理、化学及物理联合化学方法制备的去抗原异种骨支架材料浸提液分别培养羊骨髓间充质干细胞7 d,观察细胞黏附、生长、增殖及基质分泌情况。结果与结论：术后4周时,4组材料周围均有较强的炎症反应;术后12周时,物理及物理联合化学制备的去抗原异种骨支架和羟基磷灰石生物陶瓷材料孔隙内及周围组织炎症反应基本消失,极少量炎症细胞存在,材料降解较术后8周时多。化学制备的去抗原异种骨支架材料孔隙内及周围组织炎症反应仍存在;表明物理及物理联合化学制备的去抗原异种骨支架具有良好的组织相容性。羟基磷灰石生物陶瓷和物理联合化学法制备的去抗原异种骨支架材料周围有少量成骨细胞规则排列,并可见少量成骨,表明有异位成骨的趋势。经过物理或物理联合化学方法去除抗原的异种骨支架材料具有良好的细胞相容性;单纯经过化学方法处理的异种骨材料细胞相容性较差,不符合生物材料安全性标准。     

骨髓基质细胞与快速成形仿生人工骨支架载体的体外附着实验

目的：探讨具有良好生物相容性的聚乳酸-羟基乙酸与磷酸三钙人工合成仿生复合材料骨移植支架材料的可行性.方法：实验于2004-11在温州医学院附属第二医院完成.新西兰兔,雌性,体质量2.5～3.0 kg.仿生人工骨材料为清华大学机械学院快速成形实验室提供,将其剪成2 mm&;#215;4 mm&;#215;1 mm大小,750 mL/L乙醇浸泡消毒30 min,紫外灯照射2 h灭菌,烘干备用.在新西兰兔股骨上端,抽取约1.5 mL骨髓,进行骨髓基质细胞的分离和培养.将第3代骨髓基质细胞以4&;#215;1010L-1细胞密度接种于仿生人工骨材料中,第7天取材,透射显微镜及其扫描电镜下观察细胞粘附情况.结果：仿生人工骨复合物表面及其孔隙内长满细胞,透射显微光镜下可见细胞覆盖的光照影.扫描电镜下观察：3 d时,仿生人工骨复合物载体表面细胞生长密集,胞体呈不规则的球形、梭形或多角形,从胞体生出的细胞突长短不一,有的与其他细胞相连.第7天时细胞在孔洞中长满,有大量的胶原纤维分泌.结论：快速成形仿生人工骨复合材料与骨髓基质细胞有较好的生物相容性,具备作为细胞支架骨移植材料的性质.     

快速成形的多孔材料作为骨髓基质细胞支架材料的生物相容性特征

目的：采用体外细胞培养法对聚乳酸／聚羟乙酸共聚物／磷酸三钙(Poly-lactic-co-glycolic and Tri-calcium phosphate，PLGA／TCP)和聚乳酸／聚羟乙酸共聚物(PLGA)的生物相容性进行研究，探讨其作为组织工程支架材料的可行性。方法：将传代培养的新西兰兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)分别接种于快速成形的三维支架材料PLGA和PLGA／TCP，单纯接种细胞作为对照组，于接种后不同时间通过倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞生长、黏附情况，并绘制细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果：骨髓基质细胞可以在PLGA／TCP和PLGA支架材料表面黏附、生长并连接成片，分泌细胞外基质，对照组与实验组、各实验组之间生长曲线相近，统计学分析无显著性差异。结论：PLGA／TCP和PLGA对兔骨髓基质细胞的形态学、细胞生长增殖等均无影响，具有良好的生物相容性，可作为组织工程的支架材料而安全应用。     

冻干去抗原羊松质骨支架的生物相容性评价

背景：异种骨具有与人类骨类似的天然多孔结构,在治疗骨缺损时可引导骨组织再生,但植入过程中也会引起不同程度的免疫反应。目的：采用冻干法制备去抗原羊脊椎松质骨支架材料,并评价其生物相容性。方法：取羊脊椎松质骨,制备两组去抗原异种骨支架,化学组经H2O2、甲醇/氯仿混合液等化学试剂处理;冻干组将经化学处理的羊松质骨在-80℃冰箱中低温冷冻4周,真空干燥,60结果与结论：冻干组支架无细胞毒性、急性毒性及热源反应,皮内刺激实验阴性;化学组支架有细胞毒性及轻微急性毒性反应,有致热源作用及轻度皮肤刺激性。结果表明经过化学处理羊脊椎松质骨支架的生物相容性相对较差,而化学处理配合低温冷冻、真空干燥及Co照射消毒。①细胞毒性实验：分别采用化学组材料浸提液、冻干组材料浸提液与DMEM/F12培养基培养羊骨髓间充质干细胞。②热源实验、急性毒性实验：从兔耳缘静脉分别注射化学组材料浸提液、冻干组材料浸提液与生理盐水。③皮内刺激实验：分别在兔脊柱背部皮下注射化学组材料浸提液、冻干组材料浸提液、生理盐水及乙醇。60 Co照射的羊脊椎松质骨生物相容性较好,基本能达到骨组织工程支架材料的要求。     

冷冻异种骨膜引导骨组织的再生

目的:探讨应用冷冻异种骨膜作为引导骨组织再生膜的可能性。方法:实验于2002-03/12在北京世纪坛医院动物实验室完成。①冷冻异种骨膜的制备:取新鲜猪头颅顶部骨膜或肋骨骨膜以生理盐水反复漂洗,拭干置于体积分数为0.75的乙醇中浸泡脱脂,然后放置于液态氮中冷冻10min,反复3次后,用γ射线辐照3kGy,储存于低温冰箱内备用。②动物实验:在30只日本大耳白兔下颌骨造成贯穿骨缺损两处,一孔表面覆盖经处理的骨膜为实验组,另一孔不覆盖为对照组。③指标观察:分别在2,4,8,12,16周处死兔,进行大体、X射线片及组织学观察。结果:30只白兔全部进入结果分析。①实验组及对照组大体标本观察:8周,可见引导膜,膜边界已不整齐。实验组平坦,骨质较硬。对照组愈合,但骨质较软;12周,引导膜与周围界限不清,但仍可见。实验组平坦,骨质较硬。对照组骨质较软,仍可见凹陷。②组织病理学观察结果:8周实验组缺损处为新生骨边缘变致密,移植膜内炎症细胞消失,膜内纤维开始水肿,断裂;12周,实验组骨小梁粗大,排列整齐。对照组缺损处成骨量较少,骨小梁比实验组细小。移植膜内无明显炎症,移植膜与周围组织界限不清。③X射线片观察:4,8周实验组明显较对照组密度增高。12,16周实验组基本与周围骨质相似,对照组仍显密度较低。结论:经冷冻处理的异种骨膜在体内不产生明显的排斥反应,可在体内维持8￣12周,具有较好的阻挡纤维组织长入创面、分隔不同细胞及引导组织再生的功效,是一种可以利用的引导组织再生膜材料。     

骨髓基质细胞与快速成形仿生人工骨支架载体的体外附着实验

目的:探讨具有良好生物相容性的聚乳酸-羟基乙酸与磷酸三钙人工合成仿生复合材料骨移植支架材料的可行性。方法:实验于2004-11在温州医学院附属第二医院完成。新西兰兔,雌性,体质量2.5～3.0kg。仿生人工骨材料为清华大学机械学院快速成形实验室提供,将其剪成2m m×4m m×1mm大小,750mL/L乙醇浸泡消毒30m in,紫外灯照射2h灭菌,烘干备用。在新西兰兔股骨上端,抽取约1.5mL骨髓,进行骨髓基质细胞的分离和培养。将第3代骨髓基质细胞以4×1010L-1细胞密度接种于仿生人工骨材料中,第7天取材,透射显微镜及其扫描电镜下观察细胞粘附情况。结果:仿生人工骨复合物表面及其孔隙内长满细胞,透射显微光镜下可见细胞覆盖的光照影。扫描电镜下观察:3d时,仿生人工骨复合物载体表面细胞生长密集,胞体呈不规则的球形、梭形或多角形,从胞体生出的细胞突长短不一,有的与其他细胞相连。第7天时细胞在孔洞中长满,有大量的胶原纤维分泌。结论:快速成形仿生人工骨复合材料与骨髓基质细胞有较好的生物相容性,具备作为细胞支架骨移植材料的性质。     

脱蛋白松质骨作为异种骨移植材料的修复作用

背景：采用脱蛋白处理后的松质骨可见大小不等、相互交通、开放孔隙的网架结构,其无机成分为羟基磷灰石,有机成分为胶原,力学性能保存良好,有良好的细胞相容性,可能是一种新型骨移植材料。目的：介绍异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程载体的性能,以及其用于骨融合的作用。方法：分别以＂异种脱蛋白松质骨、骨融合、载体＂,为检索词,应用计算机检索重庆维普（VIP）期刊全文数据库及Pubmed数据库1998-01/2009-12有关文章,排除与研究目的无关和内容重复者,保留33篇文献做进一步分析。结果与结论：动物骨均有相似的生物材料结构和造型,较人工合成材料骨具有极好的细胞贴附性和细胞生长增殖环境。但由于异种骨移植时种属间的抗原差异,存在剧烈的免疫排斥反应,骨组织兼容性差,关键问题是植入体内免疫问题。如能克服免疫原性,异种脱蛋白松质骨是一种良好的组织工程骨载体材料,可为再血管化和成骨细胞的分化提供一个稳定的环境。     

脱蛋白松质骨作为异种骨移植材料的修复作用

背景:采用脱蛋白处理后的松质骨可见大小不等、相互交通、开放孔隙的网架结构,其无机成分为羟基磷灰石,有机成分为胶原,力学性能保存良好,有良好的细胞相容性,可能是一种新型骨移植材料.目的:介绍异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程载体的性能,以及其用于骨融合的作用.方法:分别以"异种脱蛋白松质骨、骨融合、载体",为检索词,应用计算机检索重庆维普(VIP)期刊全文数据库及Pubmed 数据库1998-01/2009-12有关文章,排除与研究目的无关和内容重复者,保留33篇文献做进一步分析.结果与结论:动物骨均有相似的生物材料结构和造型,较人工合成材料骨具有极好的细胞贴附性和细胞生长增殖环境.但由于异种骨移植时种属间的抗原差异,存在剧烈的免疫排斥反应,骨组织兼容性差,关键问题是植入体内免疫问题.如能克服免疫原性,异种脱蛋白松质骨是一种良好的组织工程骨载体材料,可为再血管化和成骨细胞的分化提供一个稳定的环境.     

骨髓基质细胞载体支架的细胞相容性特点

目的:近年来,尽管骨组织工程发展迅速,但目前缺乏理想的支架材料,体外构建的组织工程化活性骨在体内的成骨能力各家报道不一,探讨骨髓基质细胞与L-聚乳酸/聚磷酸钙纤维复合支架的细胞相容性,为骨组织工程选择可降解支架材料提供依据.方法:实验于2002-03/06在第三军医大学中心实验室完成.将兔骨髓基质细胞与L-聚乳酸/聚磷酸钙纤维复合后在体外进行培养,观察细胞形态学变化,并对细胞黏附、细胞活度及接种细胞上架率进行测定.结果:扫描电镜下见支架上黏附细胞较多,接种前与接种支架后消化洗脱细胞的苏木精-伊红(HE)染色可见细胞形态无明显变化,接种支架前的细胞活度为97.08&;#177;1.06,接种后的细胞活度为96.87&;#177;0.96,接种支架的细胞上架率为(61.5&;#177;0.41)%.表明兔骨髓基质细胞能在L-聚乳酸/聚磷酸钙纤维复合支架上贴附、细胞活度不受影响及较高的细胞上架率.结论:L-聚乳酸/聚磷酸钙纤维复合支架具有良好的细胞相容性,可作为骨髓基质细胞的载体应用于骨组织工程.     

松质骨基质材料应用于牙周组织工程的可行性

背景：松质骨基质材料具有骨诱导性和骨传导性双重特性,已被成功应用于骨再生及骨组织工程研究。目的：分析松质骨基质材料的细胞相容性与毒性,探讨其应用于牙周组织工程的可行性。方法：采用改良组织块法体外培养人牙周膜细胞,将其接种于松质骨基质三维支架上复合培养,采用细胞计数方法和扫描电镜观察人牙周膜细胞在松质骨基质支架上的附着、生长情况,并通过MTT测试法和碱性磷酸酶活性检测法观察松质骨基质浸提液对人牙周膜细胞增殖及功能表达的影响。结果与结论：扫描电镜可见松质骨基质具有良好的多孔网状结构,人牙周膜细胞在松质骨基质上贴附紧密,生长旺盛,伸展充分,而人牙周膜细胞在不同浓度材料浸提液中的生长、增殖及碱性磷酸酶活性与阴性对照组相比差异无显著性意义。表明松质骨基质具有良好的三维空间结构和细胞相容性,且无细胞毒性,有望应用于牙周组织再生及牙周组织工程研究。     

物理联合化学或化学方法处理去抗原异种松质骨支架与骨髓间充质干细胞的细胞相容性

背景：研究证明去抗原异种松质骨支架具有良好的理化性能和三维立体多孔结构,但应用于临床还需要考虑其安全性和生物相容性。目的：比较物理联合化学及化学方法处理去抗原异种松质骨支架与羊骨髓间充质干细胞的细胞相容性。方法：用梯度密度离心法分离培养羊骨髓间充质干细胞,四甲基偶氮唑盐比色法检测物理联合化学及化学方法处理去抗原异种松质骨支架材料对骨髓间充质干细胞增殖的影响。取第3代骨髓间充质干细胞,接种在两种支架上共同培养,倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在两种支架材料上的形态、黏附、生长和增殖情况。结果与结论：物理联合化学组细胞毒性为0或1级,细胞能在材料上良好地黏附、增殖、生长,细胞活性未受到支架材料的影响。化学组细胞毒性为3级,细胞在材料上生长受到抑制,支架孔隙内无细胞黏附。提示经过物理联合化学处理的去抗原异种松质骨支架材料与羊骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性;单纯经过化学处理的支架材料生物相容性较差,不符合生物材料安全性标准。     

异种脱蛋白松质骨作为支架材料的性能分析

背景:异种脱蛋白松质骨因其来源广泛和独特的生物学特性有望成为较好的骨组织工程支架,其关键点为免疫原问题,如能解决免疫原问题,则有望开发出一种新型植骨材料.目的:通过理化方法制备脱蛋白松质骨,对其结构、组成及生物安全性能进行分析,探讨异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程载体可行性.设计、时间及地点:对比观察实验,于2008-02/2009-01在黑龙江省纤维化生物治疗重点实验室完成.材料:取成年猪和山羊股骨远端松质部分,1:1氯仿甲醇液脱脂、体积分数30%H2O2脱蛋白,制得脱蛋白松质骨.方法:①通过红外光谱仪、X射线衍射分析仪、氨基酸分析仪、力学测试仪进行载体性能测试.②取第3代人髂骨骨髓间充质干细胞调整浓度为2×108 L-1 细胞悬液,接种到载体至饱和,倒置显微镜和扫描电镜观察种子细胞黏附及生长增殖情况.③40只BALB/C小鼠随机分为实验组和对照组,每组20只.分离小鼠股后肌肉制成肌袋,实验组植入猪脱蛋白松质骨,对照组直接缝合.术后1,2,4,8周检测分析血清肌苷、谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平.④采用免疫酶组织染色方法分析猪脱蛋白松质骨和植入小鼠体内4周脱蛋白松质骨标本的免疫原性.主要观察指标:体外实验分析脱蛋白松质骨理化性能、免疫原性.动物实验分析生物安全性能.结果:脱蛋白松质骨载体无机成分主要是与人骨天然成分相同的羟基磷灰石,经过一系列处理后,胶原蛋白并没有被脱除,这种结构保持了较好的力学性能.脱蛋白松质骨由于脱除了主要的免疫原性物质,其免疫原性较弱,毒性低.人骨髓间充质干细胞接种于载体后生长分化良好.结论:异种脱蛋白松质骨是一种良好骨组织工程载体.     

Feasibility of ceramic-polymer composite cryogels as scaffolds for bone tissue engineering

The purpose of the current study was to investigate whether the cryopolymerization technique is capable of producing suitable scaffolds for bone tissue engineering. Cryopolymers made of 2-hydroxyethyl methacrylate and acrylic acid with (W1 and W20) and without (W0) wollastonite particles were prepared. The elastic modulus of the specimens rose one order of magnitude from W1 to W20. Total porosity reached 56% for W0, 72% for W1 and 36% for W20, with pore sizes of up to 2 mm, large interconnection sizes of up to 1 mm and small interconnection sizes of 50-80 μm on dry specimens. Cryogels swell up to 224 ± 17% for W0, 315 ± 18% for W1 and 231 ± 27% for W20 specimens, while maintaining the integrity of the bodies. Pore sizes > 5 mm can be observed for swollen specimens. The biocompatibility of the samples was tested using human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and adipose tissues. Both types of cells attached and grew on the three tested substrates, colonized their inner regions and organized an extracellular cell matrix. Fibronectin and osteopontin levels decreased in the media from cells cultured on W20 samples, likely due to increased binding on the ECM deposited by cells. The osteoprotegerin-to-receptor activator of nuclear factor-κB ligand secretion ratios increased with increasing wollastonite content. Altogether, these results indicate that an appropriate balance of surface properties and structure that favours stromal cell colonization in the porous cryogels can be achieved by modulating the amount of wollastonite.     

异种骨支架材料的制备及其理化性能

目的:对比观察猪骨支架材料与同种异体骨支架材料的理化性能及力学性能。方法:实验于2006-03/12在南方医科大学人体解剖教研室(暨南方医科大学临床解剖学研究所和广东省组织构建与检测重点试验室)完成。实验材料:低温深冻6个月的6只成年猪(雌雄各3只)和4具新鲜健康成人尸体(男女各2具,由广州市红十字会南方医科大学遗体捐献接收点提供,家属知情同意)髂骨。实验方法:剔除软组织,刮除骨髓和骨膜,用锯骨机将松质骨切成5mm×5mm×40mm左右的骨条,超声清洗、H2O2和乙醇浸泡、甩干、冻干、辐照处理得到异种骨支架材料和同种异体骨支架材料。实验评估:①对2种材料进行扫描电镜观察。②对比2种材料孔隙率、蛋白质和钙磷含量及力学性能。结果:①扫描电镜观察结果:2种材料均具有骨本身的骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统,具有天然网状结构。三维支架系统形态完整。其中猪源性异种骨支架材料较人同种异体骨支架材料具有更多的三维孔隙,2种材料的孔隙大小接近,均在400μm左右。②材料蛋白质、钙磷含量及力学性能检测结果:异种骨支架材料的孔隙率高于同种异体骨[(57.20±1.37)%,(53.21±1.63)%,P<0.005],但蛋白含量低于同种异体骨[(23.36±0.48)%,(26.50±0.23)%,P<0.005],钙、磷含量与同种异体骨比较差异无显著性[钙:(1.7×105),(1.8×105)μg/g;磷:(1.0×105),(1.0×105)μg/g],2种材料弹性模量差异无显著性。结论:猪源性异种骨支架材料在理化性能方面与人骨支架材料极相近,可为骨细胞的生成提供基本的保证。