人源结缔组织生长因子单链可变区抗体片段的筛选

目的:从人源单链可变区片段(ScFv)文库中筛选与结缔组织生长因子(CTGF)特异结合的噬菌体克隆,获得ScFv氨基酸序列。方法:以重组硫氧化还原蛋白-结缔组织生长因子(TrxA-CTGF)融合蛋白为靶目标,用差异吸附法,逐步增加选择压力,经过4轮亲和筛选后随机挑取8个克隆,提取DNA后测序;测序阳性的DNA转化E.coliHB2151,IPTG诱导后用间接ELISA方法检测培养上清单链抗体的活性。MTT法测定单链抗体对CTGF促人近曲肾小管上皮HK-2细胞增殖作用的影响。结果:从8个克隆中获得7个完全一致的DNA序列(W0616);另有1个克隆丢失了重链,且轻链框架区(FR)和互补决定区(CDR)序列与W0616不一致;阳性克隆经诱导后,培养上清用间接ELISA试验证实能与CTGF发生特异性结合,与TrxA及阴性对照比较差异显著(P<0.001)。同时,该单链抗体片段能明显抑制CTGF引起的HK-2细胞的增殖。结论:成功获得与CTGF特异结合的人源单链抗体可变区序列,为CTGF抑制剂的研究奠定基础。     

结缔组织生长因子特异性结合肽的表达及分离纯化

目的:利用基因工程技术获得与结缔组织生长因子(CTGF)特异性结合的小肽。方法:设计并合成带有肠激酶切割位点的基因片段,插入pET-32(a) 质粒载体中硫氧化还原蛋白基因下游,构建重组质粒,转入E.coliBL21表达菌中,用终浓度1mmol.L-1的IPTG诱导表达融合蛋白;用热变性和硫酸铵分级沉淀对融合蛋白进行初步纯化,然后用亲和层析进一步纯化,经肠激酶切割,最后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽;用反相色谱对所获小肽进行纯度鉴定。结果:所构建的重组质粒测序结果与预期一致;诱导表达后用SDS-PAGE鉴定,发现在相对分子质量20 000处有浓密的表达条带出现,与预期一致;融合蛋白用热变性和硫酸铵分级沉淀进行初步纯化,得率分别为78.6%和52.3%;用亲和层析纯化得率为50.5%;经肠激酶切割后用凝胶过滤层析分离获得目的小肽,用反相色谱鉴定其纯度大于95%;最终每升发酵液获得3.4 mg目的肽。结论:成功制备CT-GF特异性结合肽,为进一步研究该小肽的生物学活性打下基础。     

结缔组织生长因子单链抗体对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化程度及羟脯氨酸含量的影响

目的:研究结缔组织生长因子(CTGF)单链抗体(ScFv)对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠的治疗作用.方法:昆明小鼠36只,随机分为对照组、模型组和治疗组,每组12只;对照组气管内滴入生理盐水,模型组和治疗组气管内滴入博莱霉素(5 mg·kg-1)制备肺纤维化模型.第2天开始治疗组尾静脉注射ScFv(4 mg·kg-1),对照组和模型组给予等量的生理盐水(约100 μl·次-1),3次·周-1.第14、28天分两批处理动物,用HE染色行病理组织学检查并进行纤维化分级,用酸水解法测定肺组织羟脯氨酸的含量.结果:对照组小鼠肺组织无纤维化形成;模型组肺组织可见肺泡破坏,肺泡间隔大量纤维化,肺组织中羟脯氨酸含量及纤维化程度较对照组明显增高(P<0.01).治疗组肺组织纤维化程度较模型组明显减轻,且羟脯氨酸含量较模型组显著降低(P＜0.01).结论:ScFv作为CTGF单链抗体可明显减轻纤维化程度,有可能成为治疗肺纤维化一种新的药物.     

人源化抗CD3单链抗体在大肠杆菌中的GST融合表达

目的为构建新一代的小分子、高效的基因重组抗CD3/抗胶质瘤双特异性抗体提供一个合适的构件.方法从质粒pZZ3中克隆出人源化抗CD3抗体的VH、VL基因后,构建人源化抗CD3单链抗体基因,将其克隆入表达载体pGEX-5Xl中后转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达.结果SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量为55kd,与其理论推算值相符.表达形式均以包涵体为主,表达量占菌体总蛋白的30%左右.Westem blot证实,诱导后菌体总蛋白在55kd处出现特异性显色印迹.结论人源化抗CD3单链抗体可以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达,为构建人源化双特异性抗体奠定了基础.     

结缔组织生长因子单链抗体对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的影响

目的:研究结缔组织生长因子(CTGF)单链抗体(ScFv)对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型各阶段的支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞数及纤维化程度的影响.方法:昆明小鼠36只,随机分为对照组、模型组和ScFv组,每组12只;后2组麻醉后气管内滴入博莱霉素制备模型,滴药后第2天开始尾静脉分别注入生理盐水或ScFv(4 mg·kg-1),3次·周-1,对照组给予等量的生理盐水;气管内滴药后第7、14、28天分3批处死小鼠,收集左肺BALF,进行炎症细胞计数和分类;肺组织HE染色后观察肺纤维化程度.结果:(1) 第7天模型组有明显的肺泡炎,ScFv组小鼠肺泡炎症病变轻微;第28天模型组出现肺纤维化,ScFv组纤维化程度明显低于模型组(P<0.05);(2) 第7、14天模型组小鼠BALF中细胞总数及巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞均明显高于对照组(P<0.05),ScFv组明显低于模型组(P<0.05).结论:CTGF ScFv可减少肺纤维化模型BALF中的炎症细胞,减缓肺纤维化的发生发展.     

人源化抗CD3单链抗体在大肠杆菌中的GST融合表达

目的 为构建新一代的小分子、高效的基因重组抗CD3/抗胶质瘤双特异性抗体提供一个合适的构件。方法 从质粒pZZ3中克隆出人源化抗CD3抗体的VH、HL基因后,构建人源化抗CD3单链抗体基因,将其克隆入表达载体pGEX-5X1中后转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达。结果 SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量为55kd,与其理论推算值相符。表达形式均以包涵体为主,表达量占菌体总蛋白的30%左右。Western blot证实,诱导后菌体总蛋白在55kd处出现特异性显色印迹。结论 人源化抗CD3单链抗体可以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达,为构建人源化双特异性抗体奠定了基础。     

CEA单链抗体表达质粒构建及产物纯化

目的"单链抗体基因的构建并在大肠杆菌中进行表达以及表达产物的纯化研究. 方法"采用重组PCR技术将已获得的抗癌胚抗原(CEA)鼠源单克隆抗体E7B10重、轻链可变区基因(VH、Vk )经(Gly4Ser)3编码的寡核苷酸拼接成单链抗体基因,并在大肠杆菌中表达了单链抗体C端融合6×His蛋白,表达产物经Ni2+-IDA Sepharose 6B亲和柱纯化. 结果"表达的融合蛋白在胞内主要以可溶性存在,其表达量达到菌体总蛋白的10%,SDS-PAGE和Western印迹图谱显示表达产物分子量为27kd,与其基因编码蛋白的理论推算值相符.表达产物经Ni2+-IDA Sepharose 6B亲和柱纯化,纯度可达90%以上,得率为0.8mg/100ml. 结论"纯化后的融合蛋白具有CEA结合活力,其亲和常数为5.4×107/M(抗体结合浓度),略低于其亲本单抗E7B102.7×109/M.     

抗人Endoglin胞外段单链抗体的可溶性表达和鉴定

目的用E.coli HB 2151表达抗人Endoglin胞外段单链可变区片段（single chain variable fragment,scFv）,并鉴定其抗原结合活性,为卵巢癌的体内诊断和治疗研究提供靶向载体分子。方法用呈现scFv抗体的重组噬菌体感染E.coli HB 2151进行抗体的可溶性表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定可溶性scFv的表达,竞争性ELISA检测可溶性scFv的抗原结合活性。结果抗人Endoglin胞外段scFv得到了可溶性表达,表达产物主要位于周质腔中,其分子量约为29kD。该周质提取物中scFv能与抗Endoglin单克隆抗体竞争性结合同一抗原表位,且竞争作用随scFv浓度增加而加强。结论用E.coliHB2151成功表达了具有抗原结合活性的抗人Endoglin胞外段scFv,为其应用研究奠定了基础。     

一种大容量天然人源核糖体展示单链抗体文库的构建

目的 构建大容量天然人源核糖体展示单链抗体(single chain Fv,scFv)文库,为抗体研究提供方便有效的技术平台.方法 收集健康献血志愿者的白细胞悬液,离心分离单个核细胞,抽提其总RNA,逆转录成cDNA、PCR及重叠延伸PCR法构建scFv文库,并通过第2次重叠延伸PCR在scFv DNA序列5'端添加T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点,其3'端添加6×His标签、间隔序列(基因Ⅲ)、茎环结构等改造成核糖体展示天然人源scFv文库.结果 成功构建了可用于筛选抗体的核糖体展示文库容量达1013以上.结论 成功构建了大容量天然人源核糖体展示scFv文库,为筛选到高亲和力和特异性抗体提供了技术平台.     

抗人肝细胞癌单链抗体基因的构建和表达

目的：构建抗人肝细胞癌单链抗体基因，并在大肠杆菌中表达．方法：采用RT-PCR法扩增抗体重链和轻链可变区基因，用(Gly4Ser)，肽段连接VH基因和VL基因，构建克隆载体，将测序完全正确的ScFv基因克隆到分泌性表达载体pCANTAB 5E中诱导表达转化的TG1和HB2151细胞．用SDS-PAGE和免疫组化方法分析检测表达产物．结果：DNA测序证实ScFv基因结构正确，可在大肠杆菌中成功表达，游离ScFv相对分子质量大约为30ku，与HC-108，HepG-2和SMMC-7721肝癌细胞有特异性的结合反应．结论：重组制备的抗人HCD78分子单链抗体在人肝癌的基础和临床研究中具有潜在的应用价值．     

特异性抗肝癌单链抗体的表达及意义

目的优化表达条件，荻取有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体。方法以ITPG诱导大肠杆菌HB2151表达可溶性抗肝癌单链抗体；利用HiTrap Anti—E Tag素和层析拄对阳性克隆表达的单链抗体进行纯化；纯化后的单链抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，以Bradford检测法测定其浓度，ELISA法及免疫组化法鉴定其生物学活性；结果在培养基中加入0．4M蔗糖，以IPTG 1mmol／L于30℃诱导12h，抗肝癌scFv可溶性表达量较多，纯化后可溶性抗肝癌scFv含量为325μg／L。纯化的抗肝癌scFv与肝癌组织、肝癌细胞抗原特异性结合，与肝硬化、正常肝组织无阳性结合。结论成功获得具有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体，为肝癌靶向诊断及治疗的开发与应用奠定了基础。     

重组腺病毒载体介导结缔组织生长因子对人腴腺癌细胞系的抑制作用

目的:研究结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)对人胰腺癌细胞(Pancreatic cancer cell-1,PANC-1)生长的影响.方法:采用重组腺病毒介导CTGF(Recombinant adenodrus mediated CTGF,rAd-CTGF)感...     

阿尔茨海默病Aβ人抗体可变区片段基因的克隆和表达

目的 筛选出β淀粉样蛋白40 (Aβ40)的人源抗体单链可变区片段,克隆单链抗体的基因并在原核生物大肠杆菌表达,为阿尔茨海默病的诊断和治疗开辟新的途径。方法 先将Aβ40包被在免疫反应板上,后用来自正常人外周血淋巴细胞的单链抗体文库结合。经过5轮的生物淘金法筛选,从最后一轮噬菌体感染的大肠杆菌TGl中随机挑选55个克隆进行ELISA测试,筛选出Aβ40特异的单链抗体并对其进行基因测序。将人源抗体单链可变区片段基因克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,转化大肠杆菌BL21表达谷胱甘肽-s-转移酶(GST)融合的单链抗体。结果 ELISA测试表明,55个克隆中有33个克隆能结合Aβ40,Aβ40对10个克隆的竞争抑制率达到50％以上,而其中5个克隆的抗原结合表位在Aβ40的氨基端1-16个氨基酸之间。DNA测序结果发现,Aβ40单链抗体基因由768bp组成,推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构。将单链抗体基因克隆到原核表达系统中诱导表达,得到相对分子质量为55000的GST融合抗体表达产物。结论利用非免疫途径筛选出阿尔茨海默病发病中起关键神经元毒性作用的Aβ40的人源抗体单链可变区片段,为该抗体的表达和临床应用打下了基础。     

人源抗Rh(D)单链抗体基因的克隆和表达

目的:构建人源抗红细胞Rh(D)抗原单链噬菌体抗体库。方法:应用噬菌体展示技术,从分泌抗Rh(D)抗体的细胞中提取总RNA,逆转录合成cDNA第一条链,多次PCR扩增和克隆抗体可变区基因(VH/VLcDNA),经重叠延伸拼接(SOE)用编码连接肽(Gly4Ser)3的互补序列组成scFv基因,经酶切克隆入载体pCANTAB5E,使之呈现于噬菌体表面。使用完整Rh+型红细胞进行四轮淘汰筛选,ELISA对所获抗体进行初步鉴定。结果:构建的噬菌体抗体库库容为1.2×107,噬菌体DNA中全长scFv基因的插入率为0.80,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为3×108pfu/ml的初级噬菌体抗体库。以完整Rh+型红细胞进行四轮淘汰筛选,出现特异性富集。经DotELISA实验鉴定,得到1株与Rh+型红细胞特异结合的scFv噬菌体抗体。结论:运用噬菌体抗体库技术构建了人源抗红细胞Rh(D)抗原的噬菌体抗体库,为进一步对所获克隆株进行序列分析、可溶性抗体表达和纯化奠定了基础。     

抗骨形成蛋白单链抗体的构建与表达

目的:构建抗骨形成蛋白单链抗体并获得表达.方法:应用一段人工合成的含15个氨基酸的连接肽,采取亚克隆技术,将一株鼠抗BMP单克隆抗体的重链可变区(VH)的N端和轻链可变区(VL)的C端连接起来;将连接产物克隆入融合蛋白表达载体pEGX-4T-l,在大肠杆菌JM109中进行表达.结果:构建的单链抗体(ScFv)全长705 bp,并获得融合表达产物约52×103u.结论:亚克隆方法是一种构建单链抗体快速、简便、可靠的方法.     

水飞蓟宾对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞中结缔组织生长因子及Ⅲ型胶原表达的影响

目的:了解水飞蓟宾(silibinin)对转化生长因子(TGF)-β_1诱导的人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)结缔组织生长因子(CTGF)表达及Ⅲ型胶原分泌的影响。方法:将体外培养的HK-2细胞分为3组:①对照组;②TGF-β_1组(TGF-β_1的终浓度为5 ng/ml);③TGF-pβ_1 水飞蓟宾组(TGF-β_1的终浓度为5 ng/ml,水飞蓟宾终浓度分别为5、10、20μg/m1)。48 h后,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞内CTGFmRNA的水平,ELISA方法检测培养上清中胶原Ⅲ及CTGF的浓度。结果:与对照组比较,TGF-β_1刺激使HK-2细胞CTGF基因表达和蛋白分泌及Ⅲ型胶原分泌均显著增加(P<0.01)。与TGF-β_1组比较,加用5～20μg/ml水飞蓟宾可以抑制TGF-β_1刺激所诱导的CTGF基因表达和蛋白分泌及Ⅲ型胶原分泌(P<0.01),以20μg/ml水飞蓟宾效果最显著。结论:水飞蓟宾能部分抑制TGF-β_1诱导CTGF的基因和蛋白的表达及Ⅲ型胶原分泌,提示水飞蓟宾可能通过阻抑CTGF表达及减少细胞外基质的积聚,具有潜在的抗肾纤维化作用。     

通心络对糖尿病肾病大鼠肾脏CTGF、BMP-7的影响

目的  研究通心络对糖尿病肾病大鼠肾脏组织结缔组织生长因子(CTGF)及骨形态蛋白7 (BMP-7)表达的影响,并探讨其对糖尿病大鼠肾脏保护作用及机制。方法  采用链脲佐菌素(STZ) 诱导建立糖尿病大鼠模型,造模成功后随机分为糖尿病组(DM组),通心络治疗组（TXL组）,正常大鼠为对照组（C组）,于24周末检测各组大鼠、24h尿微量蛋白、空腹血糖（FPG）、血清糖基化血红蛋白I(HbA1c)、晚期糖基化终末产物（AGEs）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、肾质量/体质量(KW/BW),光镜PAS染色,采用RT-PCR及Western blot测定CTGF、BMP-7mRNA及蛋白的表达水平。结果  与C组比较, DM组大鼠24周后KW/BW、尿微量蛋白、血清AGEs、BUN、Cr、HbA1c均显著性升高(P<0.05);TXL组较DM组KW/BW、尿微量蛋白显著降低(P<0.05);肾脏组织学观察显示,DM组肾小球基底膜增厚,系膜区细胞外基质(ECM)沉积增多,肾小管上皮细胞水肿现象明显,经通心络治疗后,肾脏病理改变显著减轻。另外,DM组大鼠肾组织BMP 7基因和蛋白表达下降,而CTGF基因和蛋白表达升高;与DM组比较TXL组能够抑制CTGF表达,使BMP 7表达升高。结论  通心络可以减轻糖尿病大鼠尿微量蛋白、改善肾脏组织病理,对DN大鼠肾脏具有保护作用,其机制可能与抑制CTGF,上调BMP-7表达有关。     

蛋白连接组织生长因子表达腺病毒的构建及其基因功能

目的构建及鉴定蛋白连接组织生长因子(CTGF)基因过表达腺病毒,初步探究CTGF在糖脂代谢方面的功能。方法克隆CTGF过表达质粒,定向克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV,Pme I酶切线性化穿梭质粒转化改造的E.coliBJ5183(含腺病毒载体pAdEasy-1)感受态细菌产生重组腺病毒载体,用Pac I线性化重组质粒,回收转染293A细胞包装病毒颗粒,经过3轮扩增,感染肝原代细胞,观察感染效率及检测基因表达情况。通过对小鼠不同时间段的饥饿处理,提取肝脏RNA做RT-PCR,实时定量PCR检测CTGF基因在不同营养条件下的变化情况。结果成功包装CTGF的腺病毒,感染效率达90%以上。CTGF在不同营养条件下表达情况不同,并且与糖脂代谢重要基因过氧化物酶体增值激活受体γ共激活因子1α表达情况一致。饥饿24h,CTGF上调(3.38±0.51)倍;饥饿48h,CTGF上调(5.26±1.25)倍(P<0.05)。结论初步认定CTGF可能参与糖脂代谢。