银杏内酯B抑制高糖诱导内皮细胞凋亡及机制研究

目的探讨银杏内酯B对高糖诱导的内皮细胞凋亡的影响及相关的分子机制。方法使用脐静脉血管内皮细胞作为细胞模型,分为对照组、高糖组、银杏内酯B处理组。用Transwell实验检测内皮细胞迁移,AnnexinⅤ试剂盒检测细胞凋亡,荧光试剂盒检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,Western blot检测Bax,Bcl-2,caspase-3的表达以及p53的磷酸化。结果高糖(30 mmol·L~(-1))处理组内皮细胞迁移数量明显降低,迁移率为(66.6±15.6)%,而银杏内酯B(0.6 g·L~(-1))处理增加了内皮细胞的迁移数量,迁移率为(94.8±11.4)%。高糖处理导致内皮细胞ROS水平增高2.75倍,与高糖处理组比较,0.6 g·L~(-1)银杏内酯B完全抑制了高糖诱导的ROS产生。流式细胞仪分析表明,高糖刺激内皮细胞凋亡率为(53.8±2.6)%,银杏内酯B处理组内皮细胞凋亡率为(44.0±3.1)%。对凋亡相关蛋白的分析表明,高糖组Bax、caspase-3表达增加,Bcl-2表达降低,银杏内酯B处理抑制了Bax、caspase-3表达,并增加了Bcl-2表达。此外,高糖处理增加了内皮细胞p53表达及磷酸化,而银杏内酯B抑制高糖刺激的p53活化。结论银杏内酯B能抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡,改善内皮细胞迁移功能,对高糖引起的内皮细胞损伤具有保护作用。     

过表达THEM4对高糖诱导的人肾小管上皮细胞胶原分泌的影响

目的观察过表达硫酯酶超家族成员4(thioesterase superfamily member 4,THEM4)对高糖诱导的人肾小管上皮细胞胶原分泌的影响。方法体外培养人肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular epithelial cell,HKC),将细胞随机分为正常对照组(5.5 mmol·L~(-1)normal glucose,Control)、高糖组(30 mmol·L~(-1)high glucose,HG)、高糖+p Yrads-4-THEM4质粒转染组(HG+THEM4)、高糖+p Yr-adshuttle-4空质粒对照组(HG+V)。后3组经高糖刺激48 h后终止培养,Western blot检测THEM4、phospho-Akt(Ser473)、TGF-β1、α-SMA的表达;免疫细胞荧光检测THEM4蛋白表达和定位;ELISA方法检测细胞上清液中Ⅰ型胶原(collagenⅠ,ColⅠ)、Ⅲ型胶原(collagenⅢ,ColⅢ)分泌情况。结果高糖刺激可导致人肾小管上皮细胞内THEM4表达降低,phospho-Akt(Ser 473)、TGF-β1、α-SMA的表达增强及ColⅠ、ColⅢ分泌;过表达THEM4能够逆转高糖刺激所导致人肾小管上皮细胞phospho-Akt(Ser 473)蛋白的活化,下调α-SMA、TGF-β1表达,抑制ColⅠ、ColⅢ的分泌。结论过表达THEM4能够降低高糖诱导的胶原分泌,可能是通过抑制phospho-Akt(Ser 473)蛋白的活化,下调α-SMA、TGF-β1表达而实现的。     

重组人促红素对高糖诱导乳鼠心肌细胞凋亡的影响

目的研究重组人促红素(EPO)对高糖诱导乳鼠心肌细胞凋亡的影响,以及内质网应激(ERS)在其中的作用。方法分离新生SD大鼠心肌细胞,培养72 h后用高糖诱导心肌细胞凋亡,以甘露醇作为高渗对照,并用不同浓度EPO(5、10、20、40 U·m L-1)预处理心肌细胞48 h,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,选取EPO最佳干预浓度;将实验分成五组即正常糖(NG)组、EPO+NG组、高糖(HG)组、EPO+HG组和ERS抑制剂4-苯基丁酸(PBA)+HG组,流式细胞仪测各组凋亡率,激光共聚焦显微镜检测各组钙离子的平均荧光强度,Real-time PCR和Western blot分别检测各组促红素受体(EPOR)、ERS标志物GRP78、钙内流蛋白Serca2a的m RNA和蛋白表达。结果高糖诱导后心肌细胞凋亡率(41.36±10.49)%,显著高于正常心肌细胞凋亡率(16.08±3.97)%(P<0.05),甘露醇组对正常心肌细胞凋亡无显著影响(P>0.05);20 U·m L-1 EPO预处理高糖诱导的心肌细胞后凋亡率为(20.97±10.55)%,为最佳干预浓度。与NG组比较,EPO+NG组各指标均无显著差异(P>0.05),HG组凋亡率和钙离子荧光强度显著增加,EPOR、Serca2a的m RNA及蛋白表达降低,GRP78 m RNA及蛋白表达升高(均P<0.05);与HG组相比,PBA+HG组和EPO+HG组凋亡率和钙离子荧光强度降低,EPOR、Serca2a的m RNA及蛋白表达升高,GRP78 m RNA及蛋白表达降低(均P<0.05);PBA+HG组和EPO+HG组各指标均无显著差异(P>0.05)。结论高糖可通过介导ERS并引发钙稳态失衡诱导心肌细胞凋亡;EPO能够抑制高糖诱导心肌细胞的凋亡,该作用可能与抑制ERS,增强钙内流蛋白表达、维持细胞内钙离子平衡有关。     

瓜蒌皮提取物对高糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响及机制研究

目的探讨瓜蒌皮提取物(extractive pericarpium trichosanthes,EPT)对体外高糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞株(HUVECs),观察不同浓度瓜蒌皮提取物干预高糖处理的HUVECs凋亡的变化。MTT法检测HUVECs的存活率、采用Hoechst染色法检测细胞凋亡、采用比色法测定细胞内Caspase-3的活性、Western blot法以及免疫荧光染色法检测核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的蛋白表达和p65核移位情况。结果 30 mmol·L-1葡萄糖处理内皮细胞48h能引起细胞活性明显降低,细胞凋亡率及caspase-3的活性明显增加,细胞中NF-κB蛋白表达升高及p65核移位增加。用瓜蒌皮提取物(12.5、25、50 mg·L-1)预处理细胞1 h,可以增加细胞活性;降低细胞凋亡率、caspase-3的活性及NF-κB蛋白表达,呈浓度依赖性,且对高糖诱导的p65核移位有抑制作用。结论瓜蒌皮提取物对体外高糖诱导的HUVECs凋亡有抑制作用,其作用机制与下调NF-κB表达和降低caspase-3活性有关。     

坏死性凋亡和p38 MAPK通路的相互作用介导高糖引起的H9c2心肌细胞损伤

目的研究坏死性凋亡(necroptosis,Nec)和p38丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路的相互作用在高糖引起H9c2心肌细胞损伤中的作用。方法应用细胞计数盒检测心肌细胞存活率;双氯荧光素染色荧光显微镜照相法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;罗丹明123染色荧光显微镜照相法测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP);蛋白质免疫印迹法测定RIP3蛋白(反映Nec的指标)和p38MAPK蛋白的表达水平。结果高糖(35 mmol·L~(-1)葡萄糖,HG)作用H9c2心肌细胞24 h可引起明显的细胞损伤,表现为细胞存活率降低,ROS生成及MMP丢失增多;应用100μmol·L~(-1)necrostatin-1(Nec-1,Nec特异性抑制剂)和HG共处理心肌细胞24 h或3μmol·L~(-1)SB203580(p38MAPK抑制剂)预处理心肌细胞60 min,再予HG作用24 h可减轻高糖引起的上述损伤。此外,HG作用心肌细胞1、3、6、9、12、24、36和48 h均能明显增加RIP3蛋白的表达水平,其中24 h时表达水平增加最明显。应用100μmol·L~(-1)Nec-1共处理或3μmol·L~(-1)SB203580预处理心肌细胞均能明显地抑制HG对RIP3蛋白表达的上调作用。另一方面,应用100μmol·L~(-1)Nec-1共处理心肌细胞能阻断HG对磷酸化(p)-p38MAPK表达的上调作用。结论 Nec和p38 MAPK通路的相互作用介导高糖引起H9c2心肌细胞损伤。     

高糖增强过氧化氢诱导牛主动脉内皮细胞凋亡(英文)

目的:研究高糖对过氧化氢(H_2O_2)诱导牛主动脉内皮细胞(BAEC)凋亡作用。方法:BAEC培养并传代于正常葡萄糖(5.5 mmol·L~(-1))和高糖(25mmol·L~(-1))中,经H_2O_2处理24 h后,Hoechst 33258染色,荧光显微镜观察形态学变化及凋亡细胞计数;琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解,Western blot法检测磷酸化p38 CCDPK表达。结果:H_2O_2诱导BAEC产生典型的凋亡细胞形态学变化(核浓染,核碎裂)。在100-300 μmol·L~(-1)范围内,正常糖和高糖BAEC经H_2O_2处理后,浓度依赖性诱导细胞凋亡和磷酸化p38 CCDPK表达。高糖条件下诱导BAEC DNA降解浓度低于正常糖BAEC,细胞凋亡率和磷酸化p38 CCDPK表达均显著高于正常糖组(p<0.05)。结论:高糖促进H_2O_2诱导BAEC凋亡,可能与其增强磷酸化p38 CCDPK的表达相关。     

尼可地尔对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤和炎症反应

目的探讨尼可地尔(nicorandil,Nic)能否通过调控核因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)/环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)通路对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤和炎症。方法应用细胞计数盒(CCK-8)检测心肌细胞存活率;蛋白质免疫印迹法测定NF-κB、COX-2和cleaved caspase-3蛋白的表达水平;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测细胞培养液中LDH的活性;双氯荧光素染色荧光显微镜照相法测定胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相法测定凋亡细胞数量;罗丹明123染色荧光显微镜照相法检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP);ELISA法检测细胞培养液中白介素~(-1)β(IL~(-1)β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。结果 35 mmol·L~(-1)葡萄糖(高糖,HG)作用H9c2心肌细胞24 h能明显降低心肌细胞存活率。在HG作用前,应用20~100μmol·L~(-1)Nic预处理60 min或50μmol·L~(-1)Nic预处理30~120 min均可明显对抗HG对心肌细胞存活率的抑制作用。另一方面,HG可上调心肌细胞磷酸化(p)-NF-κB p65和COX-2的表达,50μmol·L~(-1)Nic预处理心肌细胞60 min能抑制HG诱导的p-NF-κB p65和COX-2表达的上调。此外,HG作用心肌细胞24 h可引起明显的心肌细胞损伤和炎症反应,使培养液中LDH活性、ROS生成、凋亡细胞数量、cleaved caspase-3表达、MMP丢失及炎症因子IL~(-1)β和TNF-α的分泌均增加;在HG作用前,应用50μmol·L~(-1)Nic预处理心肌细胞60 min或应用100μmol·L~(-1)PDTC(NF-κB抑制剂)或10μmol·L~(-1)NS-398(COX-2抑制剂)和HG共处理心肌细胞24 h能明显拮抗HG引起的上述损伤和炎症反应。结论 Nic通过抑制NF-κB/COX-2通路对抗HG引起的H9c2心肌细胞损伤和炎症。     

白杨素对高糖损伤血管内皮的影响

目的探讨急性高糖条件下,白杨素(chrysin,Ch)对血管内皮舒张功能的影响。方法 (1)采用离体血管环实验,设立正常对照组(control)、白杨素处理组(Ch),观察正常糖浓度时,白杨素对大鼠离体主动脉的舒张作用;设立正常糖浓度组(NG,11 mmol·L~(-1) Glu)、高糖实验组(HG,44 mmol·L~(-1) Glu)、甘露醇对照组(M,11 mmol·L~(-1) Glu+33 mmol·L~(-1) Man)和白杨素急性给药组(HG+Ch,44 mmol·L~(-1) Glu+chrysin 1.0μmol·L~(-1) ),观察急性高糖孵育后,白杨素对大鼠离体主动脉舒张功能的影响。(2)采用HUVEC细胞系,设立正常糖浓度组(NG,5.5 mmol·L~(-1) Glu)、高糖实验组(HG,33.3 mmol·L~(-1) Glu)、甘露醇对照组(M,5.5 mmol·L~(-1) Glu+27.8 mmol·L~(-1) Man)以及不同浓度白杨素处理组(Ch 25、50μmol·L~(-1) ),观察白杨素对高糖孵育HUVEC细胞存活率的影响,并检测各组NO释放量。结果 (1)正常糖浓度时,白杨素能浓度依赖性地舒张大鼠主动脉环,其Emax和EC50为(58.94±9.61)%、51.9μmol·L~(-1) (P<0.01);高糖浓度时,HG组ACh诱导的血管舒张反应性明显降低,其Emax与EC50值分别下降至(32.12±3.92)%、78.0μmol·L~(-1) (P<0.01),但硝普钠(SNP)诱导的血管舒张无变化;白杨素急性干预后,可以明显改善高糖对ACh诱导的血管内皮依赖性舒张功能的损伤,其Emax与EC50值分别为(70.7±3.87)%和0.852μmol·L~(-1) (P<0.01)。(2)HUVEC高糖处理后,细胞存活率降低至(82.56±3.97)%,白杨素(25、50μmol·L~(-1) )干预后能浓度依赖地增强HUVEC的细胞存活率,其细胞存活率可分别增至(103.4±4.78)%、(107.6±11.58)%;并且能提高高糖处理后细胞培养液NO的释放量。结论白杨素可以保护急性高糖损伤的血管内皮舒张功能,并增加内皮NO释放。     

乙酰胆碱抑制自噬保护高糖诱导的H9c2细胞损伤

目的研究乙酰胆碱(ACh)对高糖诱导的心肌细胞损伤的影响及机制。方法应用高糖处理H9c2细胞72 h,建立心肌细胞损伤模型。实验分为:①对照组(control);②高糖组(HG);③HG+ACh(10-4nmol·L~(-1))组;④HG+ACh+AICAR(0. 5 nmol·L~(-1))组;⑤HG+ACh+雷帕霉素(rapamycin,Rap)组(Rap 50 nmol·L-1);⑥HG+3-MA(2 mmol·L~(-1))组。MTT及ATP含量检测,评估各组细胞活性;Western blot观察各组自噬、凋亡及AMPK/m TOR信号通路相关蛋白表达变化;透射电镜观察各组细胞自噬小体的数量变化。结果与对照组相比,HG组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、pAMPK/AMPK比值降低(P <0. 05),p-mTOR/m TOR、Bax/Bcl-2比值升高(P <0. 05);与HG组相比,HG+3-MA组Bax/Bcl-2比值降低(P <0. 05),HG+ACh组心肌细胞活性增加(P <0. 05),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-AMPK/AMPK、Bax/Bcl-2比值降低(P <0. 05),p-mTOR/m TOR比值升高(P <0. 05);与HG+ACh组相比,HG+ACh+AICAR组p-AMPK/AMPK比值升高(P <0. 05),p-mTOR/m TOR比值降低(P <0. 05),而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高(P <0. 05),HG+ACh+Rap组Bax/Bcl-2比值升高(P <0. 05)。结论 ACh通过AMPK信号通路抑制自噬,保护高糖诱导的心肌细胞损伤。