铜绿假单胞菌oprI基因的反向斑点杂交检测法

目的 建立一种早期快速检测铜绿假单胞菌的方法。方法 根据铜绿假单胞菌特异的oprI基因设计引物,聚合酶链反应合成特异探针,光敏生物素标记细菌DNA,应用反向斑点杂交法检测铜绿假单胞菌。结果 所合成的探针具有高度特异性,能鉴别铜绿假单胞菌,与其他细菌、病毒、真菌间无交叉反应。该方法能检测出100 ng细菌DNA。结论 反向斑点杂交法具有快速、特异的优点,对铜绿假单胞菌的早期检测具有重要意义。     

反向斑点杂交法快速检测嗜肺军团菌

目的　探讨早期、快速检测嗜肺军团菌的方法。方法　根据嗜肺军团菌特异的巨噬细胞感染增强子mip基因设计引物 ,通过聚合酶链反应合成一段特异的 2 6 0bp长链DNA探针 ,采用反向斑点杂交法检测生物素标记细菌DNA ,并应用于痰标本的检测。结果　所合成的 2 6 0bpDNA探针具有高度特异性 ,只和嗜肺军团菌杂交 ,与其他细菌、真菌、病毒无交叉反应 ,该探针最低可检测出 1ng的细菌DNA。杂交法和培养法分别检测 10 0份痰标本 ,两者的阳性率分别为 8%和 2 %。结论　该方法快速、特异 ,对嗜肺军团菌的早期诊断具有较高的应用价值。     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应（PCR）合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16S rRNA的通用探针，并用生物素标记DNA探针，分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交，细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA，100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌，其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异，具有较高的应用价值．可应用于临床检测。     

铜绿假单胞菌lasR基因反义肽核酸序列筛选及其抑制生物被膜形成的研究

目的 筛选靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸序列,探讨其对铜绿假单胞菌的生物被膜形成能力的影响.方法 针对铜绿假单胞菌lasR基因设计4条反义寡核苷酸序列,利用斑点杂交筛选出与lasR基因结合最佳的反义寡核苷酸序列,以此合成与穿膜肽连接的肽-肽核酸序列.分别用不同浓度的肽-肽核酸导入铜绿假单胞菌生物被膜模式菌PAO1中,测定不同时相点细菌生长光密度[D(600)]值并进行菌落计数,观察肽-肽核酸对其生长的抑制作用.利用光学显微镜和扫描电镜观察生物被膜形成情况.qPCR方法检测lasR mRNA表达.结果 斑点杂交实验结果显示:4条反义寡核苷酸序列中3条有杂交信号产生,其中第1条序列信号最强,以此为基础合成反义肽核酸.不同浓度的肽-肽核酸对铜绿假单胞菌表现出不同程度的体外抗菌活性,且随着浓度增加,抗菌活性增强.结论 有效筛选出高效反义核苷酸序列,经筛选出的靶向铜绿假单胞菌lasR基因的反义肽核酸对铜绿假单胞菌的生长及生物被膜形成能力有明显抑制作用,同时抑制lasR mRNA的表达.     

基于颜色判定的环介导恒温扩增技术快速检测铜绿假单胞菌的研究

目的建立了一种基于颜色判定的,能够快速准确地检测铜绿假单胞菌的LAMP方法。方法针对铜绿假单胞菌OprL基因设计3对LAMP引物,通过引物特异性识别OprL的8个独立区域来快速检测铜绿假单胞菌。如果在反应前添加荧光染料羟基萘酚蓝(HNB)或钙黄绿素(Calcein),其结果可以通过肉眼观察反应前后颜色变化来判定并经琼脂糖凝胶电泳验证。对该技术进行特异性、灵敏度分析,利用LAMP和PCR同时检测临床标本。结果设计出针对铜绿假单胞菌OprL基因的恒温扩增检测方法。本恒温扩增检测法只扩增铜绿假单胞菌DNA,对其他菌不扩增,显示出良好的特异性。其最低检测限为17.414 pg/μl,PCR方法最低检出限为174.414 pg/μl,LAMP方法检测灵敏度是PCR方法检测灵敏度的10倍,灵敏度高。LAMP法对临床阳性标本检出率与PCR法相当(27/27)。结论 LAMP方法用于快速检测铜绿假单胞菌具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果肉眼可辨别、灵敏度高和特异性强的特点,适合用于现场和基层检疫及医疗单位的快速诊断。     

聚合酶链反应检测铜绿假单胞菌感染性角膜溃疡的实验研究及临床应用

目的：探索聚合酶链反应（PCR）技术对铜绿假单胞菌感染性角膜溃疡快速诊断的可行性。优越性及其在临床应用中的价值。方法：建立PCR检测标准铜绿假单胞菌方法，对兔铜绿假单胞菌感染性角膜溃疡模型研究并应用于临床，并与细菌培养做比较。结果：铜绿假单胞菌扩增出一条长504bp的阳性条带，其他常见细菌，人和兔正常角膜组织均为阴性，动物模型PCR敏感性为93.8%。特异性为100.0%；细菌培养敏感性为68.7%。特异性为93.7%。临床标本PCR阳性率为66.7%；细菌培养阳性率为38.1%。结论：PCR技术对快速检测实验室和临床标本中的铜绿假单胞菌具有重要的应用价值。     

乙酰胺快速检定药品中铜绿假单胞菌方法考察

乙酰胺快速检定药品中铜绿假单胞菌方法考察马静芬，高岩铜绿假单胞菌是外科常见的致病菌，规定外用药品不得检出。乙酰胺法基于铜绿假单胞菌具有乙酰胺酶，能分解乙酰胺产生ＮＨ３，使乙酰胺斜面培养基变红，并能与Ｎｅｓｓ试剂反应，生成黄色或棕红色碘化氧双汞铰沉淀，...     

呼吸道生物被膜菌体外生长群感效应的研究

目的:观察体外细菌群感效应对呼吸道生物被膜菌的生物膜形成和铜绿假单胞菌色素产生的影响。方法:从呼吸道感染患者痰标本中分离铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌与肺炎链球菌,用改良平板法建立铜绿假单胞菌生物膜及上述混合菌的生物膜,观察两者形成生物膜的差别。用液体培养法观测混合菌对铜绿假单胞菌色素产生的影响。结果:铜绿假单胞菌单独培养需7 d可形成生物膜,与其他细菌混合培养48 h即可形成生物膜;肺炎链球菌与铜绿假单胞菌混合培养24 h可促进其绿色素的形成。结论:不同菌种之间的群感效应能改变细菌某些生物学性状。     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应(PCR)合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16SrRNA的通用探针,并用生物素标记DNA探针,分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交,细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA,100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌,其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异,具有较高的应用价值,可应用于临床检测。     

液态芯片监测铜绿假单胞菌多重耐药基因的研究

目的建立以液态芯片为检测手段的快速、高通量的铜绿假单胞菌多重耐药基因监测技术平台,探索建立能够常规应用于临床并解决现行临床表型测定局限性的分子生物学技术。方法针对铜绿假单胞菌中常见的OPRD2、TEM、OXA10、AAC3、AAC6、VIM、VEB、IMP共8个耐药基因序列进行分析,依次对这8个耐药基因设计多重PCR扩增引物和序列特异的核酸探针,选取临床鉴定的含各耐药基因的耐药菌株作为阳性参比品进行检测工艺优化,进行铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片监测平台的研发。结果初步建立了铜绿假单胞菌多重耐药基因液态芯片监测平台,组装了铜绿假单胞菌多重耐药检测液态芯片试剂盒1套。选择了8株含各耐药基因铜绿假单胞菌阳性菌株,用组装的试剂盒重复检测10次,耐药基因检测阳性率为100%,各耐药基因检测信号间无交叉,灵敏度﹑特异度以及重复性都很好。利用此平台进行了一定数量的临床标本检测分析。从检测结果来看,40份标本中,18份标本耐药基因阳性,其中含多耐药基因的标本有9份,占50%。18份阳性标本的耐药基因与耐药表型分析结果一致。结论此监测平台是将一种多重扩增技术和芯片技术-悬浮阵列技术相结合的方法,具有特异性高、可组合筛查、检测通量高的优势。     

斑点杂交法检测SEN病毒感染

目的:探讨斑点杂交法检测SEN病毒(SENV)感染的应用价值.方法:应用地高辛标记、制备SENV部分基因探针并用斑点杂交技术检测SENV DNA,与聚合酶链反应(PCR)检测结果相比较. 结果: 在191份血清中,采用斑点杂交法检出6份阳性,检出率为3.1%. PCR方法检测出11份阳性,阳性率5.8%. 结论: 制备的地高辛探针具有SENV特异性,以地高辛标记的SENV探针可用于检测SENV感染.     

碱性磷酸酶直接标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒DNA方法的建立及应用

目的 :建立碱性磷酸酶直接 (AlkPhosDirec)标记核酸探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸 (DHBVDNA)方法。方法 :应用AlkPhosDirec[TM] 将碱性磷酸酶直接标记纯化的DHBVDNA全基因制备探针 ,与目标核酸杂交后加入CDP -Star化学发光试剂 ,用胶片放射自显影检测DHBVDNA。同时检测了探针的灵敏度和特异性。比较了AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针与地高辛标记的DHBVDNA探针检测鸭血清标本 10 0份结果。并用AlkPhosDirec标记探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸的方法考核了活性肽类物质保尔佳 (Polyerga)及其 8种单体体内抗鸭乙型肝炎病毒作用。 结果 :探针灵敏度为10 pg ,无非特异性的结果出现 ,与地高辛探针比较 ,用AlkPhosDirect标记探针检测方法的敏感性为 10 0 % ,特异性为 10 0 % ,符合率为 10 0 % ;抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验表明 ,保尔佳 0 0 1号单体 (CMS0 0 1)能使血清中DHBVDNA明显降低 (P<0 .0 5 )。结论 :AlkPhosDirec标记DHBVDNA探针检测血清中鸭乙型肝炎病毒核酸方法灵敏、特异 ,与地高辛标记的DHBVDNA探针检测结果完全相符合 ,可作为药物抗鸭乙型肝炎病毒作用动物实验疗效评价的手段。     

聚合酶链反应和DNA探针杂交法检测沙眼衣原体的比较

目的：探讨聚合酶链反应（PCR）和DNA探针杂交法检测泌尿生殖道沙眼衣原体（Ct)的临床诊断价值。方法：应用这两种方法对未使用过抗衣原体药物的80例宫颈炎患者同时进行Ct检测。结果：PCR法检出Ct基因的阳性率（23．8％）高于探针杂交法（15．0％），两者比较有显著性差异。结论：PCR法检测Ct较DNA探针杂交法敏感，如将两法结合应用结果将更可信。     

产黑色素普氏菌DNA探针用于口腔颌面部脓液标本检测的初探

目的：评价产黑色素普氏菌（ATCC25845）DNA探针的准确性。方法：采用产黑色素普氏菌DNA探针直接对26例口腔颌面部的脓液标本杂交,放射自显影照片确定杂交率,并与传统方法加以对照。结果：深外法与传统法的结果一致。结论：产黑色素普氏菌可用于临床脓液标本的直接检测。     

早孕绒毛Y基因的快速诊断

许多伴性遗传疾病需在孕早期进行胎儿性别鉴定,报告一种不经Southern转移的分子杂交方法,即利用凝胶原位杂交法对早孕绒毛Y基因进行快速诊断。该方法是在提取孕8周绒毛DNA,经微型琼脂糖凝胶电泳后,直接将凝胶抽干成凝胶膜,尔后以Y染色体3.4 kb DNA片段为特异性探针,直接在凝胶膜上进行分子杂交。本文成功地在48 h内对 1例DMD携带者早孕绒毛的胎儿性别进行了基因诊断。     

2011-2016年临床常见血培养分离病原菌的菌群分布及耐药性变迁

目的:分析医院血培养检出细菌的菌群分布及耐药性变迁,为临床治疗用药提供参考。方法:收集医院2011-2016年间血培养阳性的数据,依据CLSI2014年标准,用WHONET5.6软件对其进行回顾性分析。结果:血培养分离出的菌株中革兰阴性菌依次为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌。阳性菌依次为凝固酶阴性的葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌。主要分布在重症医学科、老年病房、普外科、血液科。据6年的药敏结果可见,除铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率有下降以外,其他革兰阴性常见菌对头孢哌酮舒巴坦及碳青霉烯类抗生素的耐药性基本都呈上升趋势。常见革兰阳性球菌对红霉素的耐药率均大于50%。屎肠球菌对大多数测试药物的耐药率均较高。除粪肠球菌和金黄色葡萄球菌外,革兰阳性常见菌对青霉素类药物耐药率均大于80%。共发现30株耐亚胺培南的肠杆菌,1株耐万古霉素的屎肠球菌。结论:密切关注血流感染常见菌的菌群分布、耐药情况、耐药性变迁,可为临床感染早期合理使用抗生素及防控耐药菌株的暴发流行提供帮助。