重组人BMP-2的基因克隆及原核表达

目的 构建重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)的原核表达质粒并在大肠埃希菌中诱导表达.方法 采用RT-PCR法,从骨髓细胞总RNA中扩增获得人BMP-2成熟肽cDNA,将其克隆入表达载体pBV220,构建BMP-2的重组原核表达质粒.重组质粒经酶切和测序鉴定后,在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白,表达产物采用Western印迹和ELISA进行鉴定.结果 测序表明,重组基因序列与人BMP-2成熟肽基因完全一致.Western印迹和ELISA检测显示,表达产物的相对分子量(Mr)与预期结果相符,与相应抗体有结合活性.结论 获得了人BMP-2成熟肽的编码基因,并构建了含有该基因的重组质粒pBV220/BMP-2,在大肠埃希菌中可高效表达人BMP-2.     

重组人睾丸特异性抗原-1(TSA-1)的基因克隆及原核表达

目的 为了阐明血清中存在的抗精子抗体引起不孕不育的原因,构建重组人睾丸特异性抗原-1(recombinanthuman testis specie antigen-1,rhTSA-1)的原核表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达.方法 采用RT-PCR法,从人睾丸组织总RNA中扩增获得人TSA-1的cDNA,将其克隆入表达载体pGEX-4T-2,构建TSA-1的重组原核表达质粒pGEX/TSA-1.重组质粒经酶切和测序鉴定后,转化大肠杆菌JM109并在大肠杆菌中诱导表达目的 蛋白.结果 测序表明,重组基因序列与人TSA-1基因完全一致.SDS-PAGE电泳显示,表达产物的相对分子量与预期结果相符.结论 获得了人TSA-1的编码基因,并在大肠杆菌中可表达人TSA-1.     

人BLyS基因真核细胞表达载体的构建和鉴定

目的构建人BLyS基因真核细胞表达载体.方法采用RT-PCR方法,从激活的人外周血淋巴细胞的总cDNA中扩增得到876bp的人BLyS cDNA片段,再用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果人BLyS cDNA已经正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中.结论本实验结果为研制抗人BLyS单克隆抗体来研究BLyS与B淋巴细胞功能的关系以及进一步探索自身免疫性疾病的治疗新途径奠定了基础.     

人受精相关抗原-1的基因克隆及原核表达

目的为了阐明免疫性不孕不育的原因,检测血清中存在的抗精子抗体的种类,构建重组人受精相关抗原-1（recombinant human Fertilization antigen-1,rhFA-1）的原核表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达。方法采用RT-PCR法,从人睾丸组织总RNA中扩增获得人FA-1的cDNA,将其克隆入表达载体pBV220,构建人源性FA-1的重组原核表达质粒pBV220/FA-1。重组质粒经酶切和测序鉴定后,转化大肠杆菌JM109并在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白。结果测序表明重组基因序列与人FA-1基因完全一致。SDS-PAGE电泳显示,表达产物的相对分子量为14.6KDa与预期结果相符。结论获得了人FA-1的编码基因,并在大肠杆菌中表达了人的FA-1蛋白。     

大鼠巨噬细胞移动抑制因子的基因克隆及原核表达

巨噬细胞移动抑制因子 (ＭＩＦ)是激活的Ｔ细胞、脑垂体细胞、巨噬细胞和脑细胞等产生的一种细胞因子 ,其主要生物学活性是抑制巨噬细胞移动 ,增强粘附吞噬能力 ,促使巨噬细胞分泌多种细胞因子及化学物质 ,共同参与调节炎症反应等[1] 。ＭＩＦ也是糖皮质激素抗炎作用的内源性拮抗物 ,在某些疾病如感染、内毒素血症及迟发型超敏反应的病理过程中有重要作用[2 ,3] 。本文采用逆转录ＰＣＲ技术克隆了大鼠ＭＩＦ (ｒＭＩＦ)ｃＤＮＡ ,并且在大肠杆菌中表达了有活性的蛋白。现将结果报告如下。1　材料和方法1 1　主要材料　ｐＣＲＩＩ Ｔ载体为本…     

人MASP-2N端片段的原核表达

目的 克隆并表达人MASP-2N端片段,为制备单克隆抗体及其临床应用奠定基础.方法 采用RT-PCR技术从人胎肝组织总RNA中扩增人MASP-2N端cDNA,克隆入pGEX-6p-2表达载体,在E.coli中表达GST- MASP-2N融合蛋白.结果 酶切图谱分析和DNA测序分析表明,成功构建了含人MASP-2N端片...     

人Bcl-2蛋白的基因克隆、表达及初步活性分析

目的：以特定形式对高度疏水性的人Bcl-2(hBcl-2)蛋白进行可溶性表达，获得非疏水性hBcl-2蛋白并具备生物学结合活性，为进一步研究hBcl-2三维结构并在此基础上研发特异性小分子药物提供充足的蛋白样品。方法：用PCR方法对hBcl-2基因进行克隆重组，插入原核表达载体pET28a( )中。用Western Blot和MALDI-TOF生物质谱鉴定，采用荧光极化方法进行活性测定。结果：重组hBcl-2在E．Coli中实现了高效、可溶性的融合表达，重组蛋白经纯化至电泳纯，具备了与Bcl-2家族Bak蛋白BH3功能域特异结合的能力，表明原核表达的重组hBcl-2具有较好的结合活性。结论：成功地对重组hBcl-2蛋白进行了可溶性表达和活性测定。     

人Cyclin E原核表达载体的构建及表达

目的：构建人Cyclin E基因原核表达载体,并在E.coli BL21中表达并纯化。方法：PCR扩增人Cyclin E基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET32a（＋）中,构建重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E。经限制性内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得全长约为1200bp的人的Cyclin E基因片段。以构建的重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E转化E.coli BL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约60000的融合蛋白。经SDS-PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为Cyclin E。结论：成功地构建了表达载体pET32a（＋）-Cyclin E,并表达出重组蛋白His-Cyclin E,为进一步筛选在体内外能与Cyclin E和CDK2结合的新蛋白奠定了基础。     

小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2的原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠睾丸特异表达基因Biot2的原核表达载体,表达pQE30-Biot2融合蛋白。方法提取小鼠睾丸组织总RNA,经RT-PCR扩增Biot2基因片段,并将其克隆入原核表达载体pQE30中,构建重组质粒pQE30-Biot2。经限制性内切酶BamHI、HindIII双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliXL-Blue,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测。结果构建pQE30-Biot2重组原核表达质粒,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量(Mr)约17700处出现了1条蛋白条带,该表达蛋白具有与His-tag单克隆抗体(mAb)特异性的结合能力。结论成功地构建了Biot2基因的原核表达载体,并表达出pQE30-Biot2重组蛋白,为下一步制备多克隆抗体和蛋白功能的深入研究奠定了实验基础。     

人CD154基因真核细胞表达载体的构建、鉴定于序列分析

目的 构建人CD154基因真核细胞表达载体。方法 采用RT-PCR方法,从激活的人外周血淋巴细胞的总cDNA中扩增得到820bp的人CD154cDNA片段,再用BamHI和EcoRI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体PcDNA3.1中,限制性内切酶酶切分析重组质粒和DNA序列分析。结果 人CD154cDNA已经正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论本研究为探讨CD154分子与淋巴细胞活化的关系及其信号传导机制。为进一步用于抗移植排斥反应的研究,或对由于CD154遗传缺陷所致的免疫缺陷病的基因治疗奠定了基础。     

KIR2DL4-IgFc融合蛋白基因真核细胞表达载体的克隆及鉴定分析

目的：构建人KIR2DL4－IgFc段融合蛋白基因真核细胞表达载体。方法：用RT－PCR从孕妇蜕膜组织单个核细胞的总mRNA中逆转录扩增KIR2DL4细胞外段cDNA，经Nhe I和BamH I双酶切后，定向插入真核细胞表达载体CD5lnegl中，然后经酶切和测序鉴定。结果：限制性内切酶切酶 切和序列分析表面已成功构建CD5lnegl-KIR2DL4载体，结论：本研究成功构建KIR2DL4－IgFc融合蛋白真核细胞表达载体，为研究KIR2DL4与其配体之间的关系奠定了基础。     

抗血小板膜糖蛋白单抗SZ—21嵌合Fab片段基因的构建和表达研究

目的 为降低抗血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ－21的免疫原性,克隆了SZ－21可变区基因,构建并表达人－鼠嵌合Fab基因工程抗体。方法 利用基因克隆技术,从杂交瘤细胞系SZ－21克隆出轻、重链可变区基因,然后亚克隆到质粒pSW1中,构建成人－鼠嵌合Fab片段基因质粒pSZ-21,在大肠杆菌中表达。结果 pSZ－21基因构建正确,在大肠杆菌中表达出可溶性抗体片段,表达产物具有与血小板结合的活性。结论 成功地克隆了SZ－21可变区基因,并表达了可溶性人－鼠嵌合Fab基因工程抗体。     

人源性羧肽酶 A突变体基因的构建及表达

目的从人正常肺组织中提取羧肽酶A基因并进行定点突变。方法从人正常肺组织中提取RNA,并进行逆转录得到人羧肽酶A(hCPA)。以计算机模拟hCPA的结构,寻找合适的突变位点。用PCR重叠延伸法,对羧肽酶A进行定点突变,并在大肠杆菌中表达。结果序列分析表明,所获hCPA的核苷酸序列为1251bp,编码417个氨基酸。hCPA突变体(mhCPA)基因的1126位核苷酸由G变为A,其余核苷酸序列均未发生变化,相应的此突变体蛋白质的376位核苷酸残基由丙氨酸突变为苏氨酸。将mhCPA基因在E.coli中诱导表达3h后,表达量高达30％左右。结论成功地构建并表达了mhCPA基因,为hCPA在肿瘤的“抗体导向酶前药疗法”(ADEPT)中的应用奠定了基础     

重组载体pEGFP-ANG的构建及ANG基因在HUVEC中的表达

目的 :建立血管生成素 (angiogenin ,ANG)基因的真核表达系统。方法 :采用化学合成拼接法 ,获得人ANG全长cDNA并测序 ,构建重组荧光真核细胞表达质粒 pEGFP ANG ,然后经脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)。应用荧光显微镜观测及免疫组化染色 ,对转染细胞内 pEGFP ANG的表达进行鉴定。结果 :测序表明 ,编码的氨基酸序列与人ANG完全一致。荧光显微镜下可见转染的HUVEC内发出强绿色荧光。免疫组化检测显示 ,转染的HUVEC中有棕色颗粒。结论 :获得了人ANG的全长编码基因。构建的重组体pEGFP ANG转染HUVEC后 ,可表达人ANG蛋白     

Transient expression assay in a baculovirus system using firefly luciferase gene as a reporter

Transient gene expression assays were developed to assess the function of the regulatory sequences of baculovirusesBombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) andAutographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) in insect cells ofBombyx mori andSpodoptera frugiperda, respectively. DNA sequences encoding luciferase (luc) of the fireflyPhotinus pyralis was successfully employed in the expression assay as a reporter gene. Recombinant plasmids were constructed containing the luc gene under control of baculovirus-specific or heterologous promoters. Cotransfection ofBombyx mori andSpodoptera frugiperda cells with recombinant plasmids carrying virus-specific promoter sequences and BmNPV and AcNPV DNA, respectively, gave rise to efficient synthesis of luciferase (Luc), while heterologous promoters induced a low level of luc expression. We found that flanking sequences of the AcNPV DNA in the transfer plasmid contained an unknown promoter conferring an efficient luc expression. The activity of this promoter was modulated by the polh promoter sequences. The assay allows one to conduct highly sensitive monitoring of the transient expression of foreign genes from the transfecting plasmids prior to construction of recombinant viruses.     

HAI-1基因不同功能域的原核表达载体构建及融合蛋白表达

目的:分段克隆1型肝细胞生长因子激活剂抑制因子(HAI-1)基因的功能域并在大肠杆菌中表达,为进一步研究HAI-1的生物学功能打下基础。方法:针对HAI-1的不同功能域设计相应的5对引物,分别扩增KD1、KD1 LDLR、KD2、LDLR KD2和KD1 LDLR KD2片段。将PCR产物克隆至pGEM-TEasy载体中并经测序鉴定。将5个cDNA片段亚克隆至具有6个组氨酸标签(His-Tag)的原核表达载体pIVEX2.3-MCS中。以上述表达不同功能域的载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物以Westernblot进行鉴定,并进一步通过镍亲和层析柱纯化His-Tag标记的KD1 LDLR KD2融合蛋白。结果:成功地构建了HAI-1各功能域基因片段的原核表达载体。Westernblot分析证实,在大肠杆菌BL21(DE3)中分段表达了5种HAI-1不同功能域的His-Tag融合蛋白,并通过亲和层析法纯化到了相对分子质量为22200的KD1 LDLR KD2融合蛋白。结论:重组质粒pIVEX2.3-MCS/HAI-1能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,纯化的融合蛋白可用于研究HAI-1不同功能域的生物学作用。