PCR技术中避免污染的措施

ＰＣＲ的问世为临床诊断提供了一项行之有效的方法，其灵敏度和特异性是其它生化、酶免、放免方法无法比拟的，正是由于这些特征，其技术要求有很高的严密性，污染将会是该技术的一项敌害。本文介绍近年来对ＰＣＲ技术污染采取的措施，并着重介绍方法学的改进，一种新的方法－ＤＩＡＰＯＰＳ法，大大减少了污染。     

预防PCR检测中的污染初探

作为一种新的检测技术，PCR具有其它传统方法无与伦比的优点：灵敏度高、特异性强、操作简便等。也存在着严重的不足，极微量的污染即可导致假阳性结果。因此，PCR污染问题已引起人们极大的关注，如何防止PCR污染已成为整个实验成功的关键，现就我院PCR实验室二年来采取的预防污染办法介绍如下：PCR检测过程中的污染来源有三：一是标本间的交叉污染；二是实验室中克隆质粒的污染；三是扩增产物的污染，其中以第三种为最主要，因此冠以“残留污染”（Carryover）。PCR污染可能来自标本处理过程中所伴随的阳性质粒，通过空气和气溶胶…     

实时荧光定量PCR的研究进展及其应用

多聚酶链反应飞速的发展使其成为了分子生物学实验室重要的工具 ,实时荧光定量PCR(real timequantitativePCR)技术以其敏感性高、重复性好、速度快和污染少使PCR技术又向前迈进了一步。本文对real timeQ PCR技术的原理、五种主要的荧光化学及定量方法作一介绍 ,同时也讨论了此技术存在的不足 ,并对其目前在研究领域中主要的应用进行了概述。     

实时荧光PCR实验过程污染的监测与防范

正实时荧光PCR 技术是一种实时监测PCR扩增产物,通过CT值和标准曲线的关系对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。其优点是扩增量大、特异性强、灵敏度高、精确定量,但易污染,一直是困扰各实验室的大问题,极微量的污染就可能造成假阳性反应,导致实验结果失败。为了保证实验过程稳定、结果可靠,验证整个操作流程中是否存在污染的可能,必须进行污染的监测。通过有效地监测,采取正确的应对措施,防止或消除污染。1 对照实验是监测PCR污染的重     

实时荧光PCR技术的研究及其应用进展

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)是一敏感特异的检测核酸分子的定性方法,在疾病的基因诊断中起重要作用,但传统的PCR技术在临床应用中遇到些难以克服的问题,如PCR后处理需手工操作、难以实现定量、PCR产物的污染等。近年,实时PCR(real-time PCR)技术实现了PCR从定     

免疫PCR:一种极为敏感的抗原测定方法

免疫PCR是近年来出现的一种将免疫测定和PCR技术结合起来的一种极为敏感的抗原测定技术。该文对其基本原理和方法作了较为详尽的介绍。     

聚合酶链反应的质量控制

聚合酶链反应（PCR）用于临床病原微生物检测的质量控制包括室内质量控制和室间质量评价，室内质控的核心问题就是要避免交叉污染，这首先要求有严格的实验室管理和训练有素的操作人员，此外设立阴、阳性对照以及PCR结果的准确判读都是有效的必不可少的室内质控措施。室间质量评价国外只是近几年才开始的一项工作，本文亦对其作了简略的介绍。     

基于高分辨率熔解分析的基因分型新技术

目的 综述基于高分辨熔解分析(HRM)的基因分型新技术.方法 介绍无标记探针、弹回引物、隐蔽探针、温度开关PCR、等位基因特异延伸PCR和低变性温度下共扩增PCR等技术的基本原理并评价其适用性.结果 这些新技术不仅避免了产物污染,提高了HRM基因分型的准确性和敏感度,而且拓展了HRM的应用范围.结论 基于HRM的基因分型新技术有望成为临床分子诊断的新方法.     

实时荧光定量PCR的研究进展及其应用

多聚酶链反应飞速的发展使其成为了分子生物学实验室重要的工具，实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR）以其敏感性高、重复性好、速度快和污染少使PCR技术又向前迈进了一步。本文对real-time Q-PCR技术的原理、五种主要的荧光化学及定量方法作一介绍，同时也讨论了此技术存在的不足，并对其目前在研究领域中主要的应用进行了概述。     

基因检测诊断中的假阴性

基因检测诊断 ,即聚合酶链式反应 (PCR) ,是体外酶促反应合成特异性 DNA的一种方法。它以特异、快速、敏感的核酸分析技术而著称 ,是分子生物学技术的一项新突破。因其高度的灵敏性 ,污染问题已广泛受到人们的关注与重视。不少学者对假阳性的对抗与解除方法已进行过不少的研究与探讨 ,但因其本试验的特殊性操作中标本量的甚微 ,假阴性同样是一个不可忽视的问题。如果在实验操作中对于假阴性不能很好地控制和解除 ,同时不能保证本试验其特异、准确、敏感的特性 ,对于如何预防和解除假阴性分述如下。1　预防假阴性1.1　以预防和解决污染问…     

荧光定量PCR技术及其临床应用

PCR技术是一种体外核酸扩增技术。通过 PCR技术可对待定基因进行扩增 ,其主要应用领域是基因检测和临床基因诊断。但其应用于临床基因诊断还存在许多局限性 ,主要表现在不能准确定量和因交叉污染而易产生假阳性等。荧光定量 PCR(Fluoresence Quantive Polymerase ChainReaction,FQ- PCR)的出现 ,解决了上述问题 ,是 PCR技术的革命性进展。它可以定量分析 DNA或 RNA样本的拷贝数 ,准确检测出样品中的基因数目 ,在临床实践中有着重要的意义和应用前景。FQ- PCR基于荧光共振能量转移 (Fluoresence Reso-nance Energy Transfer,…     

用“热启动”多聚酶链反应检测HCV

巢式多聚酶链反应(PCR)检测丙型肝炎病毒(HCV)RNA已非常盛行。虽然这项技术有其独特的灵敏性,但由于从第一轮向第二轮扩增的转步,增加了污染的机会。作者报告,用新近介绍的“热启动”(hot start)技术,省去不必要的第二轮扩增,在一轮PCR中就可获得几个分子的灵敏性。     

检测血小板浓缩物中的细菌:比较宽范围适时16S rDNA聚合酶链反应(PCR)和自动化培养

背景作者在适时聚合酶链反应(PCR)技术的基础上,发展出一种宽范围的16s rDNA检测法,将其与自动培养技术进行比较,以分析其在快速常规监测血小板浓缩物(PCs)的实用性。研究设计和方法混合PCs中细菌测定的常规方法是自动培养系统(BacT／ALERT,bioMerieux)。PCR检测是从上述培养标本提取的DNA进行的,DNA提取用的是一种自动提取系统(MagNA Pure,Roche Diagnostics)。PCR扩增使用的是一套通用引物,探针针对真细菌16S rDNA。结果共测定2146 份PCs,发现18(0．83％)份有污染,这些样本在两种方法检查时均为阳性。所有的污染菌为普通人类皮肤菌丛,包括丙酸杆菌(n=7),葡萄球菌(n=6),杆菌(n=2),微球菌(n=2)和消化道链球菌(n=1)。适时PCR检测PCs的细菌负荷初始污染水平相当于13．6～9×101集落形成单位／PCR。结论与BacT／ ALERT体系培养法比较,PCR法的灵敏性和特异性均为 100％。这种适时PCR技术分析周期短至4小时,为在PCs发放前或是在输血的当天进行测定并得到结果提供了可能。     

HBV五项血清学标志与HBV-DNA关系初探

<正> 许多资料证明乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)可以引起乙型肝炎,HBV停止复制的标志为HBV-DNA阴性。多聚酶链式反应(PCR)是检测HBV-DNA的特异和敏感的方法。我们用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了血清五项乙型肝炎病毒标志物(HBVM)阳性各种模式452份及五项HBVM皆为阴性31份,同时用PCR检测血清其HBV-DNA,并对现行的血源排除HBV污染标准进行了探讨。     

聚合酶链反应中假阴性的探讨

聚合酶链反应,英文缩写PCR,是体外酶促反应合成特异性DNA的一种方法.它利用人工合成引物介导的DNA聚合酶促反应,扩增位于两端已知序列之间的DNA区段,它以快速、特异、敏感的核酸分析技术而著称,是分子生物学技术的一项新突破.因其高度的灵敏性,污染问题已广泛受到人们的观注与重视.但又因本实验的特殊性,假阴性同样是一个不可忽视的问题,如果对于假阴性不能很好地控制和解决,同样不能保证其特异、准确、敏感的特性,对于如何预防和解除假阴性分述如下:     

真菌PCR中的污染问题

近年来从临床标本中扩增真菌DNA的技术已经成功地建立。有五个欧州的研究机构,联合对真菌PCR中由气溶胶和试剂携带污染的危险性和频度作了分析。发现在150次PCR实验中有12次,共2800价标本被真菌污染（3．3％的阴性对照在提取DNA时被污染;4．7％在PCR扩增过程中被污染）,其污染的真菌种类有：烟曲霉菌、酿酒酵母菌以及支顶孢属菌。进一步分析表明,像酵解酶粉或10倍浓缩的缓衡液等市售产品中,可能也含有真菌DNA。总之,如果注意操作,真菌PCR中的污染危险性并不会比其他PCR诊断更高的。真菌PCR中的污染问题…     

实时定量PCR在干细胞及肿瘤研究中的应用

实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,已广泛用于生物医学及临床医学等多个领域。而在干细胞研究和肿瘤诊断的研究中,国内外文献报道较少,本文就其中方法原理、研究进展及其在干细胞和肿瘤研究方面的应用作一简要综述。     

热启动PCR

热启动PCR技术是近几年发展起来的,是对传统PCR技术的革新。它的问世较圆满地解决了传统PCR中的非特异性扩增问题。其应用范围越来越广,使传统PCR技术较难扩增的单拷贝基因和超长片段等变得更简便。本文较系统地介绍了热启动PCR的原理及方法学进展。     

聚合酶链反应中污染环节的分析

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,该技术通过重复94℃～95℃变性、37℃～55℃复性、72℃延伸等简单的3个温度,能将靶DNA扩增数百万倍,获得极高的检测敏感性,操作者稍不注意就会造成污染,极微量的污染便可导致假阳性结果,现分别对污染和如何判断污染及污染源的追踪等3个部分进行阐述。1污染为了使读者重视操作堆积化及其重要性,我们将PCR整体绘制成PCR污染示意图,并分别叙述各区的相互关系,图中分为4个区,即污染1区、清洁区、污染2区、交叉污染区等。见图1。     

临床免疫检测技术的进展

随着免疫学的迅速发展，临床免疫检测技术日新月异，许多新的检验技术替代了原先传统的实验方法。现简略作一介绍。1、聚合酶链反应（PCR）又称体外基因扩增，是一项1985年首次报道的分子生物学新技术。PCR是一种模拟天然DNA复制的体外扩增法，以酶促反应的方式使位于两个寡核青酸引物之间的DNA片段（靶序列）特异性扩增上百万倍，其扩增后产物用一般方法即可检测，使分子诊断学发生了革命性的变化。PCR的优点是反应灵敏、快速、简便、所需标本量极少。一个淋巴细胞、一个细菌或病毒；血液、尿液等各类标本，均可作为PCR的材料。但P…