高产L-5-甲基四氢叶酸基因工程菌的构建与表达

L-5-甲基四氢叶酸是叶酸最具生物活性的形式,也是唯一可以穿透血脑屏障的叶酸类药物,有极大的应用价值。为提高菌体内L-5-甲基四氢叶酸的含量,将5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因metF插入载体质粒,并将重组质粒pET-22b-metF转化至E.coliBL21(DE3),乳糖诱导蛋白表达。成功构建的重组菌经诱导后,L-5-甲基四氢叶酸量比原始菌株中提高28%,达到66μg/g菌体。本研究成功的为生物合成L-5-甲基四氢叶酸寻找到一种新的途径。     

基因工程法生产L-5-甲基四氢叶酸的研究

目的在E.coli BL21(DE3)中表达5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR),并检测MTHFR的表达情况及L-5-甲基四氢叶酸的增加量。方法采用PCR法获得MTHFR基因(metF)全长DNA,分别在其5'端和3'端加上BamHⅠ和SacⅠ酶切位点。经BamHⅠ和SacⅠ双酶切后,连接到经同样双酶切的表达载体pET-28a(+)中,经限制性酶切、菌落PCR和测序验证正确后,转化至E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测MTHFR表达量,HPLC检测L-5-甲基四氢叶酸量。结果经酶切与测序鉴定证实原核重组载体pET28a-MTHFR构建成功,表达产物相对分子质量约为33 000,与MTHFR大小相符,工程菌的L-5-甲基四氢叶酸的产量显著增加。结论通过将MTHFR的基因导入L-5-甲基四氢叶酸产生菌能够提高L-5-甲基四氢叶酸产量。     

L-5-甲基四氢叶酸钙在SD大鼠体内的药代动力学研究

目的建立测定SD大鼠血浆中L-5-甲基四氢叶酸钙(5-MTHF)浓度的高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS法),初步考察5-MTHF在SD大鼠体内的药代动力学(PK)参数。方法给予6只雄性SD大鼠口服1.5×10^-2mmol·L^-1·kg^-15-MTHF,采集血样用于HPLC-MS/MS分析。用蛋白沉淀法处理血浆样本,色谱柱:Grace Altima HP C₁₈,流动相A:甲醇-乙腈-异丙醇-乙醇-水-甲酸-二甲基亚砜(25∶25∶25∶25∶0.1∶1);流动相B:甲醇-水-甲酸(10∶90∶0.1);梯度洗脱:0.40 mL·min^-1。考察该方法的线性范围、准确度和精密度、回收率、基质效应及稳定性。用WinNonlin软件计算5-MTHF在SD大鼠体内的PK参数。结果 5-MTHF在10.00~1.00×10~4ng·mL^-1内线性关系良好,回归方程为y=1.01×10^-3x+1.82×10^-3(r=0.998 3),日内和日间的准确性和精密度、回收率、基质效应及稳定性符合要求。5-MTHF在SD大鼠体内的PK参数:不扣除本底5-MTHF浓度值的t_1/2为(15.23±5.76)h,AUC_0~t为(2788.52±348.86)ng·mL^-1·h,扣除本底5-MTHF浓度值的t_1/2为(1.57±0.34)h,AUC_0~t平均值为(971.80±237.58)ng·mL^-1·h。结论本研究建立了一种灵敏的、准确的用于SD大鼠血浆中5-MTHF浓度测定的HPLC-MS/MS法。     

平叶酸藤子果实化学成分研究

摘要：目的:研究平叶酸藤子果实的化学成分。方法:采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、重结晶、高效制备液相色谱法等现代分离方法和技术对平叶酸藤子果实乙酸乙酯部位化学成分进行分离纯化,并根据理化性质和波谱数据进行结构鉴定。结果:从平叶酸藤子果实中分离得到6个化合物,分别鉴定为柠檬酸三甲酯（1）、香草酸（2）、5-羟甲基糠醛（3）、1,5-二甲基柠檬酸酯（4）、1,6-二甲基-5-乙基柠檬酸酯（5）、3,4-二羟基苯甲酸（6）。结论:化合物1～6均为首次从平叶酸藤子中分离得到。     

叶酸铁质复方软胶囊中叶酸的含量测定

目的建立叶酸铁质复方软胶囊中叶酸的检测方法。方法去除样品的植物油后,用稀盐酸溶解,高效液相色谱法测定。色谱柱为C18分析柱;流动相为5mmol·L-1磷酸二氢钾溶液(用稀磷酸溶液调节pH为3.0)-乙腈(87∶13),检测波长260nm。结果叶酸在0.062～0.619g.L-1质量浓度范围内线性关系良好,r=0.9995,平均回收率为100.7%,RSD为1.2%(n=9)。结论方法操作简便,结果准确,可用于叶酸铁质复方软胶囊中叶酸的检测。     

左亚叶酸及其代谢物的血药浓度测定及其注射用钠盐与钙盐的药动学比较

目的建立同时测定人血浆中左亚叶酸及其代谢物5-甲基四氢叶酸浓度的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法,比较并评价注射用左亚叶酸钠与注射用左亚叶酸钙在健康中国人体内的药动学特征。方法 20例男性健康受试者采用双周期、随机、自身交叉试验设计,两周期分别静脉滴注左亚叶酸钠和左亚叶酸钙100 mg。采用LC-MS/MS法同时测定左亚叶酸和5-甲基四氢叶酸的经时血药浓度,计算两种制剂的药动学参数。结果健康受试者静脉滴注左亚叶酸钠和左亚叶酸钙后,左亚叶酸的ρmax分别为(5.68±0.97)和(5.00±1.10)μg·m L-1,tmax分别为(1.01±0.03)和(1.02±0.04)h,AUC0-9 h分别为(7.45±1.11)和(6.10±1.06)μg·h·m L-1,t1/2分别为(1.1±0.2)和(1.0±0.6)h;5-甲基四氢叶酸ρmax分别为(2.18±0.48)和(1.93±0.46)μg·m L-1,tmax分别为(2.98±0.83)和(2.55±0.69)h,AUC0-24 h分别为(16.88±3.74)和(14.72±3.65)μg·h·m L-1,t1/2分别为(4.2±0.9)和(4.2±1.0)h。结论建立的LC-MS/MS法快速、准确、简便,两制剂药动学参数无显著差异,药动学特征一致。     

高效液相色谱法测定苦参碱氯化钠注射液的有关物质

目的:建立高效液相色谱法测定苦参碱氯化钠注射液有关物质的方法.方法:采用高效液相色谱法测定,用Hypersil ODS2(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.01mol·L-1磷酸二氢钾溶液(5∶95)为流动相;柱温:室温;检测波长为220nm.对苦参碱氯化钠注射液进行了有关物质的专属性试验.结果:检测出的杂质峰均能与苦参碱主峰分离.结论:所研究的方法专属性强,灵敏度高,重现性好,可用于苦参碱氯化钠注射液有关物质的检查.     

高效液相色谱法测定复方醋酸曲安奈德软膏中2组分的含量

目的:建立用高效液相色谱法测定复方醋酸曲安奈德软膏含量的方法.方法:采用高效液相色谱法.色谱柱为ODS-C18,流动相为甲醇-水-乙醚(50∶50∶2),流速为1.0 mL·min-1,检测波长为240 nm.结果:可同时测定2组分的含量.醋酸曲安奈德在0.002 5～0.125 g·L-1、氯霉素在0.05～2.5 g·L-1范围内峰面积与其浓度呈良好线性关系,平均回收率依次为99.8%(RSD=0.8%)、99.4%(RSD=0.8%).结论:高效液相色谱法可简便、快速、准确地同时测定复方醋酸曲安奈德软膏中2组分的含量.     

HPLC法测定L-肌肽中的游离氨基酸的含量

目的采用柱前衍生高效液相色谱法对L-肌肽原料药中的游离氨基酸进行测定。方法采用异硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate,PITC)柱前衍生高效液相色谱法,使L-肌肽中游离的β-丙氨酸和L-组氨酸衍生物达到完全分离,并测定其含量。色谱柱为DiamonsilTM C18(200 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-0.05 mol.L-1醋酸钠溶液(体积比为13∶87),流速为1.0 mL.min-1,检测波长为254 nm,柱温为35℃。结果HPLC法测定β-丙氨酸和L-组氨酸的线性范围分别为2.01～20.10 mg.L-1(r=0.999 7)和2.00～20.00 mg.L-1(r=0.999 3);平均回收率分别为110.6%和98.2%。结论HPLC法无需专业的氨基酸分析仪,可用于L-肌肽中游离氨基酸的检查。     

HPLC法检查右旋糖酐40氯化钠注射液中5-羟甲基糠醛的限量

目的建立高效液相色谱法检查右旋糖酐40氯化钠注射液中5-羟甲基糠醛限量。方法采用十八烷基硅烷键合硅胶柱(250mm×4.6mm,5μm);以1g.L-1磷酸溶液-甲醇(90︰10)为流动相;流速为1.0mL.min-1;检测波长为284nm;柱温为35℃。结果 5-羟甲基糠醛在0.248 4～24.84mg.L-1质量浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系,线性方程为Y=152 947.8X-9 816.5,r=1.000,方法回收率为99.2%(n=6),RSD为0.7%。结论该法简便准确,适用于右旋糖酐40氯化钠注射液中5-羟甲基糠醛限量测定。     

高效液相色谱法与容量分析法测定发酵液中L-赤藓酮糖含量的比较

目的：建立高效液相色谱法（ HPLC）测定发酵液中L-赤藓酮糖含量的方法,并与测定还原糖常用的容量分析法（ VA）斐林试剂滴定法进行了比较。方法 HPLC法的色谱条件为：色谱柱：Lichrospher 5-NH2（4．6 mm ×250 mm）;柱温：32℃;流动相：甲醇—水（85∶15,V／V）;流速：1．0 mL· min－1。用紫外检测器室温下检测L-赤藓酮糖,检测波长为277 nm,检测器温度为35℃。结果所得L-赤藓酮糖的线性范围为1．00～100．00 g· L－1,R2为0．9999,最低检测限为0．50 g· L－1,最低定量限为0．85 g· L－1。 F检验和t检验结果显示：在各自的线性范围内, VA法与HPLC法在95％的置信区间上存在显著性差异。结论与VA法相比,HPLC法精密度好,准确性高,不受发酵液中其它组分干扰,更适用于测定发酵液中L-赤藓酮糖的含量。     

HPLC测定复方吲哚美辛栓中的吲哚美辛

目的采用HPLC法测定复方吲哚美辛栓中吲哚美辛的含量。方法采用C18色谱柱,流动相为0.05 mol·L-1乙酸-乙腈(50∶50),测定波长260 nm。结果吲哚美辛25.59～307.13 mg·L-1与峰面积的线性关系良好(r=0.9999),回收率为98.9%(RSD=2.0%,n=6)。结论所用方法准确、可靠,可用于复方吲哚美栓的质量控制。     

异甘草酸镁单剂量与多剂量静脉滴注的药动学(英文)

目的:研究10名健康志愿者按单剂量和多剂量静脉滴注异甘草酸镁100mg后的药动学特性。方法:多剂量给药方案为每日1次,连续9d。采用高效液相色谱法测定异甘草酸镁的血药浓度。色谱条件包括:HypersilODS2色谱柱(5μm,300mm×4.6mm),流动相为0.23mol·L-1磷酸盐 缓冲液(pH=7.4)∶乙腈=79∶21,柱温40°C,流速 为1.0mL·min-1,紫外检测波长为250nm。数据 用3P87软件处理,按二室模型拟合并求算药动学参 数。结果:单剂量给药后的药动学参数分别为:cmax=(29±3)mg·L-1;t12α=(1.72±0.27)h; t12β=(23±3)h;AUC0～72(以梯形法计算)=(448±75)mg·L-1·h-1。多剂量给药达稳态后的药动 参数分别为:cssmin=(13±3)mg·L-1;cssmax=(43± 6)mg·L-1;cav=(21±4)mg·L-1;t12α=(1.6± 0.4)h;t12β(24±4)h;AUCss0～τ=(513± 108)mg·L-1·h-1。结论:该药在人体内的分布和 消除速度不随连续给药而变化。     

HPLC法测定大鼠UGT1A6的酶活性及体外动力学分析

目的:建立灵敏、稳定的高效液相色谱法,以对硝基酚为探针底物,评价体外大鼠肝微粒体中UGT1A6酶活性。方法:色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为20 mmol.L-1磷酸二氢钾缓冲液-甲醇(50∶50,V/V),流速0.8 mL.min-1,柱温30℃,检测波长280 nm。对硝基酚与大鼠肝微粒体在37℃共同孵育一段时间后,加入冰乙腈终止反应,于4℃下12000 r.min-1离心15 min后,吸取上清进行HPLC分析,以双倒数作图法计算酶动力学参数。结果:对硝基酚保留时间为8.95 min,线性范围为0.5～100μmol.L-1,回归方程为Y=5973.12X+571.58(r=0.9999),最低检测限(LOD)为0.1μmol.L-1(S/N≥3),最低定量限(LLOQ)为0.5μmol.L-1,回收率为104.5%～105.5%,日内、日间RSD均小于10%,温孵体系中其他内源性物质不干扰测定;计算酶动力学参数Km为24.63μmol.L-1,Vmax为18.87 nmol.min-1.mg.protein-1。结论:该方法灵敏度高、稳定性好,适合体外对硝基酚的测定,可用于大鼠体外UGT1A6酶活性的评价及酶动力学研究。     

反相高效液相色谱法测定茚地那韦2种制剂在健康人体的相对生物利用度(英文)

目的:建立高效液相色谱法测定血浆中茚地那韦2种制剂的浓度,并比较相对生物利用度。方法:采用反相高效液相色谱法测定18名男性健康受试者单剂量交叉口服800 mg两种茚地那韦胶囊后不同时间血浆中的药物浓度。萃取溶剂为乙腈。色谱条件:Hypersil ODS C18,流动相为乙腈∶0.01 mol.L-1磷酸盐缓冲液(pH 5.5)=43∶57。检测波长为210 nm。线性范围为0.03~16.38 mg.L-1。结果:两者药-时曲线均符合一房室模型。试验制剂和参比制剂的药动学参数如下:cmax分别为(10.6±s2.4)mg.L-1和(9.8±2.2)mg.L-1;tmax分别为(0.71±0.19)h和(0.8±0.3)h;t12ke分别为(1.30±0.24)h和(1.31±0.23)h;AUC0~10分别为(23±6)mg.h.L-1和(22±5)mg.h.L-1;AUC0~∞分别为(24±6)mg.h.L-1和(22±5)mg.h.L-1。双向单侧t检验证明,两制剂的主要药动学参数无明显差异。结论:所建立的HPLC法适用于测定人血浆中茚地那韦的浓度,试验制剂与参比制剂具有生物等效性。     

FMOC-Cl柱前衍生化HPLC法测定注射用帕米膦酸二钠的含量

目的:建立氯甲酸-9-芴甲酯(FMOC-Cl)柱前衍生化HPLC法测定注射用帕米膦酸二钠的含量。方法:碱性条件下供试品与FMOC-Cl进行衍生化反应,采用Hypersil ODS2(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈-0.4%EDTA溶液(用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH至7.2)(25∶75),流速1 mL·min-1,检测波长为265 nm。结果:帕米膦酸二钠浓度在0.05～1.00 mg·mL-1范围内与峰面积呈良好关系(r=0.9998),平均回收率为101.0%(n=9)。结论:该方法专属性好,适合用于注射用帕米膦酸二钠的含量测定。     

高效液相色谱法同时检测小鼠血浆中皮质酮和去氢皮质酮的浓度

目的:建立HPLC法测定血浆中的皮质酮和去氢皮质酮浓度。方法:小鼠血浆样品在酸性条件中用乙酸乙酯萃取;采用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱分离,流动相为乙腈-水-0.1%三氟乙酸,流速为1 mL·min-1,柱温25℃,检测波长为246 nm。结果:皮质酮浓度在0.05～8 mg·L-1;范围内线性关系良好(r=0.9995),定量下限为0.05 mg·L-1。去氢皮质酮浓度在0.05～8 mg·L-1范围内线性关系良好(r=0.9994),定量下限为0.05 mg·L-1。结论:本方法准确可靠,适用于皮质酮及其代谢产物去氢皮质酮的血药浓度检测。     

RP-HPLC法测定替加环素的有关物质

目的建立高效液相色谱法测定替加环素的有关物质.方法方法 1:色谱柱:采用安捷伦Agilent ZORBAXSB-C8柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为0.2 mol爛L-1醋酸铵溶液(含0.01 mol爛L-1乙二胺四乙酸二钠)-N,N-二甲基甲酰胺-四氢呋喃(67∶29∶4)(用三乙胺调pH值至7.9);检测波长为254 nm.方法 2:色谱柱:采用岛津Shim-pack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为0.01 mol爛L-1磷酸二氢钠缓冲液(含0.02 mol爛L-1辛烷磺酸钠及0.5%三乙胺,以磷酸调节pH值至3.0)-乙腈(75∶25);检测波长为246 nm.流速均为1 mL爛min-1;进样体积均为20μL.结果使用方法 1,杂质与替加环素能达到基线分离,替加环素与相邻峰的分离度为3.4,理论塔板数为3 446.线性范围为0.49～19.42μg爛mL-1,r=0.999 9.结论采用反相高效液相色谱法,专属性强,能准确、快速检测替加环素的有关物质,可用于替加环素的质量控制.     

大鼠血浆中山奈酚的HPLC测定法及其在药物动力学研究中的应用

目的建立测定大鼠血浆中山奈酚质量浓度的HPLC法,并用于山奈酚经灌胃给药后在大鼠体内药动学研究。方法大鼠灌胃给予200 mg.kg-1山奈酚混悬液,于给药后不同时间采集血样,以非那西丁为内标,VC为抗氧剂,采用2 mol.L-1盐酸,80℃水浴水解30 min后用乙醚萃取的方法处理血浆样品。采用RP-HPLC法测定山奈酚血药质量浓度,色谱柱为Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-体积分数为0.05%磷酸溶液(体积比40∶60),流速为1.0 mL.min-1,检测波长为370 nm,柱温为40℃。结果血浆中内源性物质对山奈酚测定无干扰,线性范围为0.050～10 mg.L-1,r=0.998 5,回收率、准确度及日内、日间精密度均符合生物样品测定要求,定量下限(LLOQ)为50μg.L-1。山奈酚主要药动学参数为AUC0-t=129.2 mg.h.L-1,ρmax=7.39mg.L-1,tmax=9.0 h,t1/2=8.3 h。结论该方法简便、快速、重复性好,适用于山奈酚大鼠血药质量浓度测定及体内药动学研究。     

复方硫酸双肼屈嗪片的含量均匀度考察

目的:建立复方硫酸双肼曲嗪的含量均匀度方法,评价药品质量。方法:采用Aglient Eclipse XDB-CN柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.01 mol·L-1庚烷磺酸钠溶液(用20%磷酸调节pH至2.7)(55∶45),流速为0.8 mL·min-1,检测波长316 nm。结果:硫酸双肼屈嗪在34.38～343.8 mg·L-1的范围内线性关系良好(r=0.9999,n=6),测得平均回收率为100.1%(RSD=0.70%);氢氯噻嗪在25.70～257.0 mg·L-1的范围内线性关系良好(r=0.9999,n=6),测得平均回收率为100.9%(RSD=0.33%)。结论:本方法简便、快速,专属性强,可用于复方硫酸双肼屈嗪片的质量控制。