丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3抗原模拟表位的筛选和鉴定

目的 筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3(HCV NS3)特异性噬菌体模拟表位，为抗—HCV的疫苗研究探索新途径。方法 以抗—HCV NS3的单克隆抗体作为固相筛选分子，对人工合成的噬菌体随机七肽库进行3轮“吸附—洗脱—扩增”的筛选过程，随机挑取60个克隆，经噬菌体酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验，最后对所选克隆进行DNA序列分析，以确定HCV NS3抗原的模拟表位。结果 经噬菌体富集后，从随机筛选的60个克隆中得到13个阳性克隆，确定氨基酸序列SRNTxKL为HCV NS3的模拟表位。结论 用噬菌体七肽库成功筛选得到HCV NS3的模拟表位。     

日本血吸虫特异性IgE抗体相关肽表位的筛选与免疫学鉴定

目的　从噬菌体表面显示肽库筛选并鉴定日本血吸虫特异性IgE抗体相关表位。 方法用ABC 酶联免疫吸附 (ELISA)法检测日本血吸虫病流行区居民血清 15 0份 ,选择其中 15份具高滴度血吸虫特异性IgE抗体的血清 ,混合后经蛋白G柱亲和层析祛除IgG抗体 ,用于对 12肽的噬菌体表面显示肽库进行 5轮免疫亲和淘筛。从所获噬菌体克隆中挑取 35个克隆 ,经DNA序列测定 ,对各独立肽表位进行免疫学鉴定。结果　经 5轮筛选 ,DNA序列测定显示共有 4个独立噬菌体克隆 ,其中 phage 3和 phage 6有较多重复克隆存在 ,为优势克隆 ;Westernblot分析显示 ,筛库血清中特异性IgE抗体能有效识别各噬菌体克隆。分别用各克隆噬菌体免疫小鼠 ,均能诱导特异性IgE抗体产生。结论　从 12肽噬菌体表面显示肽库中成功筛选到日本血吸虫特异性IgE抗体相关肽表位。     

日本血吸虫童虫表膜结合多肽的亲和筛选与初步鉴定

目的筛选噬菌体十二肽库中与日本血吸虫(Schistosoma japonicum)童虫表膜特异性结合的多肽并鉴定。方法利用噬菌体十二肽库与日本血吸虫活童虫靶分子之间的亲和力结合,经3轮吸附-洗脱-扩增,从末次回收的结合噬菌体中随机挑取20个克隆进行测序。根据测序结果 ,选取出现次数最多的噬菌体克隆作为目标噬菌体,免疫组化检测目的噬菌体,并回输到已感染日本血吸虫的小鼠体内,2.5h后处死小鼠,回收肝脏和日本血吸虫童虫,分别洗脱与肝脏和童虫结合的噬菌体,进行统计学分析。结果经3轮筛选后,噬菌体回收率从第1轮的0.77×10-8到第3轮的0.75×10-5,说明噬菌体得到了有效富集。DNA测序结果表明,20个噬菌体克隆中的15个克隆呈现QHPRIRKOOOOO序列。免疫组化结果显示,表达该序列的噬菌体能与童虫表膜有效结合;体内回输试验证实,该噬菌体能有效地靶向结合于体内日本血吸虫童虫表膜。结论筛选获得的短肽QHPRIRKOOOOO能有效地靶向结合日本血吸虫童虫表膜。     

日本血吸虫雌虫抗原模拟表位的筛选及免疫保护性

目的　筛选日本血吸虫雌虫抗原的模拟表位 ,并探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果。　方法　用日本血吸虫雌虫免疫兔血清IgG作配体对噬菌体随机 12肽库进行 3轮亲和筛选 ,随机挑取 18个噬菌体克隆用Dot ELISA检测其特异性 ,并对其中的 4个阳性克隆进行测序。分别在 0、2、4周用混合噬菌体克隆免疫小鼠 3次 ,第 6周每鼠经腹部感染 40条日本血吸虫尾蚴 ,42d后剖杀冲虫 ,计数虫数和每克肝卵数。　结果　经 3轮筛选 ,特异性噬菌体富集了 2 0 0多倍 ,随机挑取的 18个克隆经Dot ELISA鉴定有 17个能与雌虫抗原免疫兔血清呈阳性反应。DNA自动测序的 4个序列与GenBank的已知序列均无同源性。与对照组相比 ,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为 2 6.5 7% ,减卵率为 65 .3 4%。　结论　采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟日本血吸虫雌虫特异性抗原表位的短肽分子 ,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫。     

日本血吸虫雌虫抗原模拟表位的筛选及免疫保护性

目的筛选日本血吸虫雌虫抗原的模拟表位，并探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果。方法用日本血吸虫雌虫免疫兔血清IgG作配体对噬菌体随机12肽库进行3轮亲和筛选，随机挑取18个噬菌体克隆用Dot-ELISA检测其特异性，并对其中的4个阳性克隆进行测序。分别在0、2、4周用混合噬菌体克隆免疫小鼠3次，第6周每鼠经腹部感染40条日本血吸虫尾蚴，42d后剖杀冲虫，计数虫数和每克肝卵数。结果经3轮筛选，特异性噬菌体富集了200多倍，随机挑取的18个克隆经Dot-ELISA鉴定有17个能与雌虫抗原免疫兔血清呈阳性反应。DNA自动测序的4个序列与GenBank的已知序列均无同源性。与对照组相比，混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为26．57％，减卵率为65．34％。结论采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟日本血吸虫雌虫特异性抗原表位的短肽分子，这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5抗原模拟表位的筛选和鉴定

目的 筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5（HCV NS5）特异性噬菌体模拟表位，为抗HCV的疫苗研究探索新途径。方法 以抗－HCV NS5的单克隆抗体作为固相筛选分子，对人工合成的噬菌体随机七肽库进行5轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选过程，随机挑取30个克隆，经噬菌体酶联免疫吸附法（ELISA）鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验，最后对所选克隆进行DNA序列分析，以确定HCV NS5抗原的模拟表位。结果 经噬菌体富集后，从随机筛选的30个克隆中得12上阳性克隆，确定氨基酸序列QIRPTRQ为HCV NS5的模拟表位。结论 用噬菌体七肽库成功筛选得到HCV NS5的模拟表位，为用HCV模拟表位探索HCV感染的研究创造了条件。     

东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关靶基因筛选

目的 寻找东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关靶基因。方法利用东方田鼠血清以亲和淘洗方法筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库，将所得阳性克隆进行测序及生物信息学分析，确定目的基因。结果经3轮筛选，特异性噬菌体得到有效富集（857倍），随机挑取58个克隆进行序列测定，获得了10条表达序列标签（EST）序列，其中7条与GenBank中登陆的日本血吸虫基因序列具有99％～100％同源性，1条与类人猿锌指蛋白基因有82％同源性。功能预测结果表明，大部分EST编码蛋白或多肽的功能主要是参与血吸虫基因表达调控。结论发现了多个可能与东方田鼠抗血吸虫抗性相关的靶基因，为进一步阐述东方田鼠抗血吸虫病的分子机理奠定了基础。     

抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体,并鉴定抗体性质。方法以重组表达纯化的日本血吸虫信号蛋白14-3-3为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用酶联免疫吸附试验及免疫印迹法对获得的单克隆抗体进行类和亚类、效价、浓度、纯度、亲和常数、特异性和检测灵敏度的测定与鉴定。结果共获得6株针对日本血吸虫信号蛋白14-3-3的单克隆抗体,分别为5G9、3F1、3F7、5C6、5D1和1G6,抗体类型分别为IgG1、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG1和IgG1。对其中的单克隆抗体5G9分析显示,制备的腹水抗体效价为1∶1.28×105,亲和层析纯化后的浓度为5.3 mg/ml,纯度95%,亲和常数为5.1×107mol/L。免疫印迹试验结果表明,该单克隆抗体可与体外重组表达纯化的日本血吸虫14-3-3蛋白特异性结合,同时也能与日本血吸虫可溶性虫卵抗原、成虫排泄分泌抗原和成虫抗原特异性反应,而与大肠埃希菌、健康人血清和华支睾吸虫抗原均无明显交叉反应。HRP标记的单克隆抗体5G9检测14-3-3蛋白的灵敏度为31.25 ng/ml。结论本研究获得了6株能稳定分泌抗日本血吸虫14-3-3蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为建立新的日本血吸虫活动性感染检测方法奠定了良好的基础。     

用噬菌体随机肽库鉴定日本血吸虫22.6kDa抗原分子的表位

目的　筛选和鉴定日本血吸虫 (中国大陆株 ) 2 2 .6kDa抗原 (Sj2 2 .6)的表位。　 方法　用纯化的抗Sj2 2 .6的多克隆抗体IgG对噬菌体十二肽库进行 5轮免疫学筛选 ,挑取克隆 ;采用Westernblotting免疫识别 ,将获得的阳性克隆免疫小鼠 ,并采用dot ELISA筛选能刺激小鼠产生较高滴度抗Sj2 2 .6抗体的阳性克隆 ;测定核苷酸序列 ,分析其表位与Sj2 2 .6抗原的同源性。　结果　经 5轮免疫学筛选后挑取的 1 4个克隆 ,用Westernblotting方法均能被抗Sj2 2 .6抗体识别。经动物免疫初步实验筛选 ,共获得 6个免疫原性较强的阳性克隆 ,测序结果获得 4种不同表位 ,其中 1种表位与Sj2 2 .6抗原具有较高的同源性 ,其余 3种表位与其无一级结构的同源性。　结论　获得的 4种日本血吸虫中国大陆株抗原表位 ,1种可能为结构表位 ,3种为模拟表位     

日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14—3—3编码基因重组质粒pET28a一Sj14—3—3的构建和鉴定

目的构建日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14-3-3编码基因原核表达质粒pET28a-Sj14-3-3,测定Sj14-3-3基因序列,并为中国大陆株Sj14-3-3的体外表达奠定基础。方法采用RT-PCR技术从日本血吸虫中国大陆株成虫总RNA中扩增出Sj14-3-3基因,扩增产物经纯化后。用BamH I Xho I双酶切,定向克隆入pET28a质粒,转化大肠杆菌DH5a,再用BamH I Xho I双酶切及PCR扩增对重组子进行鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定,并应用在线软件进行同源性比较及预测抗原表位。结果 PCR扩增产物约为765bp,符合预计大小,并成功地定向克隆到原核表达质粒pET28a,对插入片段的测序结果表明,该序列和推测的氨基酸序列与GenBank收录的日本血吸虫14-3-3基因分别有99.5％和99.2％的同源性。序列分析显示,Sj14-3-3基因序列中可能有抗原表位存在。结论 pET28a-Sj14-3-3重组质粒构建成功,为日本血吸虫5j14-3-3分子疫苗及信号转导研究奠定基础。     

日本血吸虫辐照尾蚴模拟表位的筛选和初步鉴定

目的从噬菌体表面显示随机肽库中筛选日本血吸虫辐照尾蚴抗原模拟表位。方法用Sepharose4B亲和层析法,从日本血吸虫辐照尾蚴免疫鼠血清中纯化抗体,经正常血吸虫尾蚴抗原吸收后,用于12肽噬菌体随机肽库的免疫筛选。经三轮筛选,随机挑取20个噬菌体克隆,经DNA序列分析后,对各独立表位进行免疫学鉴定。结果DNA序列分析,获得4个有序列重复的噬菌体克隆;Dot-ELISA分析显示,4个克隆均能被辐照尾蚴免疫血清中IgM型抗体识别,反应强度有一定差别;P1和P2克隆还能被IgG型抗体识别。结论从噬菌体随机肽库中成功筛选到日本血吸虫辐照尾蚴抗原模拟表位。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3的纯化及抗体制备

目的制备日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白Sj14-3-3的多克隆抗体与单克隆抗体。方法将合Sj14-3-3重组蛋白的凝胶条带冻干磨粉,免疫家兔,制备抗Sj14-3-3多克隆抗血请;用电洗脱纯化的Sj14-3-3免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗Sj14-3-3单克隆抗体。测定所得抗体效价及特异性鉴定。结果获得大量纯化的表达产物;制备的多克隆抗血清双扩效价达1:8～1:64。获得1株能稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞株4D9,单抗亚类为IgG1。此株单抗能与重组Sj14-3-3蛋白发生特异性反应。结论获得了高度敏感、特异的抗Sj14-3-3多克隆抗血清及稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞。     

日本血吸虫模拟虫卵抗原表位的筛选和鉴定

目的　通过噬菌体肽文库技术探索可用于诊断日本血吸虫病的模拟虫卵抗原。　方法　用日本血吸虫虫卵单克隆抗体 6 B12作“诱饵”,采用生物淘金法从噬菌体 15 -肽文库中经过 3轮筛选 ,有效地富集与 6 B12有亲和力的噬菌体肽克隆。随后采用 EL ISA、竞争 EL ISA、Western blotting等检测方法 ,从 4 0 0个单克隆化的噬菌体株中得到 13株与 6 B12有特异性、高亲和力反应的噬菌体克隆。　结果　对噬菌体所携带的外源 DNA片段序列测序结果表明 ,13株噬菌体所携带的外源多肽序列完全相同。该噬菌体多肽抗原包被酶标板经 EL ISA方法对血吸虫病患者及健康人血清Ig G抗体检测结果表明 ,两者有显著性差异。　结论　噬菌体多肽模拟抗原有可能替代天然抗原用于血吸虫病诊断     

利用噬菌体展示技术筛选日本血吸虫模拟抗原表位

目的　从噬菌体肽库筛选日本血吸虫抗原模拟抗原表位。方法　制备亲和纯化的日本血吸虫病人血清抗体 Ig G,用此 Ig G包被酶标板对 12肽库进行反复淘选 ,对获得的目的噬菌体进行鉴定及免疫原性分析。结果　获得一批阳性噬菌体克隆 ,其中一部分与血吸虫病人血清反应产生较高的吸光值 ,Western blotting分析表明这些噬菌体能被血吸虫病人血清所识别 ,具有类似于血吸虫抗原的免疫原性。结论　获得一批具有模拟日本血吸虫抗原表位的噬菌体克隆 ,为今后进一步研究它们在血吸虫病诊断及疫苗研究中的作用奠定了基础。     

Selection of a peptide mimicking neutralization epitope of hepatitis E virus with phage peptide display technology

AIM: To select the peptide mimicking the neutralization epitope of hepatitis E virus which bound to non-type-specific and conformational monoclonal antibodies (mAbs) 8Cll and 8H3 fromed 7-peptide phage display library, and expressed the peptide recombinant with HBcAg in E.coli and to observe whether the recombinant HBcAg could still form virus like particle (VLP) and to test the activation of the recombinant polyprotein and chemo-synthesized peptide that was selected by mAb 8H3. METHODS: 8Cll and 8H3 were used to screen for binding peptides through a 7-peptide phage display library. After 4 rounds of panning, monoclonal phages were selected and sequenced. The obtained dominant peptide coding sequences was then synthesized and inserted into amino acid 78 to 83 of hepatitis B core antigen (HBcAg), and then expressed in E.coli Activity of the recombinant proteins was detected by Western blotting, VLPs of the recombinant polyproteins were tested by transmission electron microscopy and binding activity of the chemo-synthesized peptide was confirmed by BIAcore biosensor. RESULTS: Twenty-one positive monoclonal phages (10 for 8C11, and 11 for 8H3) were selected and the inserted fragments were sequenced. The DNA sequence coding for the obtained dominant peptides 8Cll (N‘-His-Pro-Thr-Leu-Leu-Arg-Ile-C, named 8C11A) and 8H3 (N‘-Ser-Ile-Leu-Pro- Tyr-Pro-Tyr-C, named 8H3A) were then synthesized and cloned to the HBcAg vector, then expressed in E.coli The recombinant proteins aggregated into homodimer or polymer on SDS-PAGE, and could bind to mAb 8Cll and 8H3 in Western blotting. At the same time, the recombinant polyprotein could form virus like particles (VLPs), which could be visualized on electron micrograph. The dominant peptide 8H3A selected by mAb 8H3 was further chemosynthesized, and its binding to mAb 8H3 could be detected by BIAcore biosensor. CONCLUSION: These results implicate that conformational neutralizing epitope can be partially modeled by a short peptide, which provides a feasible route for subunit vaccine development.     

6株抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体的鉴定及初步应用

目的对6株抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体生物学特性进行鉴定,并探讨其在血吸虫病诊断中的应用价值。方法采用酶联免疫吸附试验及免疫印迹法对6株单克隆抗体的类和亚类、腹水效价、亲和常数、检测灵敏度和特异性进行测定与鉴定。建立检测日本血吸虫感染兔血清14-3-3蛋白的Dot-ELISA方法,对感染兔吡喹酮治疗前、后不同时间的配对血清中14-3-3蛋白含量的动态变化进行观察,并通过对一批血吸虫感染兔血清样本进行检测,以评价该方法的诊断价值。结果 6株抗日本血吸虫信号蛋白14-3-3单克隆抗体3F1、3F7、5C6、5D1、5G9、1G6的抗体亚类分别为IgG1、IgG2 a、IgG2b、IgG1、IgG1和IgG1;腹水单克隆抗体效价分别为1∶6.4×105、1∶8.0×105、1∶6.4×105、1∶3.2×105、1∶4.8×105和1∶2.0×104;亲和常数分别为8.82×108、4.93×108、1.56×108、5.12×108、1.41×108mol/L和2.30×107mol/L;Dot-ELISA方法检测14-3-3蛋白的灵敏度分别为1、10、100、10、10 ng和100 ng。免疫印迹试验结果表明,6株单克隆抗体均可与体外重组表达纯化的日本血吸虫14-3-3蛋白特异性结合,同时也能与日本血吸虫可溶性虫卵抗原、成虫排泄分泌抗原和成虫抗原中的天然14-3-3蛋白特异性反应,而与大肠埃希菌和华支睾吸虫抗原均无明显交叉反应。以单抗3F1和5D1为检测抗体建立的Dot-ELISA方法检测日本血吸虫感染兔治疗前、后不同时间点血清,发现随着感染时间的延长,兔血清中14-3-3蛋白含量逐渐增加,吡喹酮治疗后兔血清中14-3-3蛋白含量逐渐降低。采用此Dot-ELISA方法检测42份血吸虫感染兔血清,41份阳性,敏感性为97.6%;10份健康兔血清均为阴性,特异性为100%。结论 6株单克隆抗体均能有效识别天然的日本血吸虫信号蛋白14-3-3,初步证明以单抗3F1和5D1为检测抗体建立的Dot-ELISA方法具有一定的日本血吸虫活动性感染诊断及潜在的疗效考核价值。     

Epitope mapping of monoclonal antibodies specific to serovar of Leptospira, using phage display technique

Random heptapeptide library displayed by bacteriophage T7 was used to characterize epitopes of five monoclonal antibodies that were specific to L. australis, L. bangkok, and L. bratislava. Phages selected by biopanning were cloned by plaque isolation, and the binding specificity of individual clones was confirmed by enzyme-linked immunosorbent assay, before being further amplified and checked for phage peptide sequence using PCR and DNA sequencing. Almost all of the peptide epitopes were continuous or linear. Interestingly, in phages reacting with the monoclonal antibody (MAb) clones F11, F20, 2C3D4, and 8C6C4A12, the deduced amino acid sequence of the displayed peptides corresponded to a segment of hypothetical protein of the Leptospira genome (L. interrogans serovar Lai and Copenhageni). Considering the deduced amino acid sequences of phages reacting with the MAb clones F11, F20, 2C3D4, and 8C6C4A12, the consensus motif -SKSSRC-, -TLINIF-, -SSKSYR- and -CTPKKSGRC- appeared respectively. No similarity was observed among phage reacting with the MAb clone F21. The results demonstrate that T7 phage display technique has potential for epitope mapping of leptospiral MAbs, and for rapid analysis of the interactions between phage display peptides with the MAb. The finding of a phage peptide that binds to MAb with protective activity can be further tested as a candidate for leptospirosis vaccine in the future.     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3DNA免疫保护作用的观察

目的　研究日本血吸虫 (中国大陆株 )重组信号蛋白 14 - 3- 3(rSj14 - 3- 3)DNA作为血吸虫病疫苗候选分子的潜能。方法　碱裂解法大量制备rSj14 - 3- 3和rSjGSTDNA ,将两种DNA分别免疫BALB/c小鼠进行攻击感染实验。 结果　在尾蚴攻击感染 6w后 ,剖杀小鼠计算各组的减虫率 ,rSj14 - 3- 3DNA组为 34 2 0 % ,rSj14 - 3- 3+rSjGSTDNA组为32 4 0 % ;减卵率为 (按以上组序 ) 5 0 74 %和 5 5 2 3%。结论　重组Sj14 - 3- 3DNA具有一定的抗血吸虫病潜能 ,有可能作为日本血吸虫病的候选疫苗 ,但未见Sj14 - 3- 3、SjGST两种重组DNA的协同作用。     

Screening for PreS specific binding ligands with a phage displayed peptides library

ABM: To construct a random peptide phage display library and search for peptides that specifically bind to the PreS region of hepatitis B virus (HBV). METHODS: A phage display vector, pFuse8, based on the gene 8 product (pⅧ) of M13 phage was made and used to construct a random peptide library. Ecoli derived thioredoxin-PreS was purified with Thio-bond beads, and exploited as the bait protein for library screening. Five rounds of bio-panning were performed. The PreS-binding specificities of enriched phages were characterized with phage ELISA assay. RESULTS: A phage display vector was successfully constructed as demonstrated to present a pⅧ fused HBV PreSl epitope on the phage surface with a high efficiency. A cysteine confined random peptide library was constructed containing independent clones exceeding 5±108 clone forming unit (CFU). A pool of phages showing a PreS-binding specificity was obtained after the screening against thio-PreS with an enrichment of approximately 400 times. Five phages with high PreS-binding specificities were selected and characterized. Sequences of the peptides displayed on these phages were determined. CONCLUSION: A phage library has been constructed, with random peptides displaying as pVIII-fusion proteins. Specific PreS-binding peptides have been obtained, which may be useful for developing antivirals against HBV infection.