外源性PTEN基因体外转染C6胶质母细胞瘤株及稳定表达蛋白产物的鉴定

目的 探讨外源性PTEN抑癌基因转染胶质母细胞瘤株并表达活性蛋白产物的可行性.方法 对获赠的包含有人PTENcDNA全长序列的PRK-PTEN质粒进行扩增和酶切鉴定后,用脂质体介导PRK-PTEN质粒转染大鼠C6胶质母细胞瘤株,荧光染色检测转染细胞中PRK-PTEN质粒携带的绿色蛋白荧光报告基因,免疫组化染色鉴定稳定转染后C6细胞中PTEN功能蛋白.结果 转染后的C6胶质母细胞瘤株稳定表达绿色荧光蛋白和PTEN功能蛋白.结论 PRK-PTEN质粒载体在脂质体的介导下可以将PTEN基因整合到C6胶质母细胞瘤的基因序列中去,并且通过宿主基因序列的表达稳定地产生PTEN功能蛋白,为以PTEN基因为靶点的胶质瘤基因治疗提供了实验理论依据.     

PKB转染SHG44细胞辐射抗性机制的初步研究

目的 探讨通过抑制蛋白激酶B（PKB、AKT）活性增加辐射敏感性，从而证实PKB活性是诱导SHG44细胞辐射抗性的机制之一。方法采用电穿孔法将PKB基因[pCMV5．HA-m／p-PKBa（PKB）、pCMV5-HA-PKBα-DD（T308D／S473D）（PKBD）]转染SHG44细胞；MTT法检测对照、PKB转染组及照射后各组细胞增殖率，激光共聚焦显微镜扫描技术观察对照、对照＋照射、PKB转染＋照射、PKBD转染＋照射组细胞凋亡及微细结构的变化；分析PKB转染的SHG44细胞增殖以及诱导凋亡的相关因素。结果含有外源性PKB的质粒成功转染了SHG44细胞并表达PKBmRNA，而对照组未见表达；转染后的SHG44细胞增殖率与对照组比较差异具有统计学意义（P〈0．05）；60Coγ），线照射能诱导SHG44细胞凋亡，以细胞核形态变化为特征；PKB＋照射组SHG44细胞形态完整，偶见凋亡细胞；而PKBD＋照射与对照＋照射组相比凋亡更显著。结论PKB转染SHG44细胞能抵抗辐射诱导的细胞凋亡，证实PKB活性与SHG44细胞辐射抗性存在一定的相关性。     

外源性p27KIP1基因抑制SGC7901细胞的增殖

研究p27^KIP1基因对胃癌细胞的细胞周期及细胞增殖的影响。采用脂质体转染法将p27^KIP1全长cDNA转入胃癌细胞系SGC7901中，通过免疫屯迹分析以及RNA斑点杂交方法检测p27^KIP1基因在蛋白质和mRNA水平的表达，细胞活力实验及软琼脂集落形成实验显示转染p27^KIP1基因对细胞增殖的作用；流式细胞仪观察目的的基因对该细胞的细胞周期的影响。结果显示，转染p27^KIP1的SGC7901细胞在mRNA和蛋白质水平均有高水平p27^KIP1的表达；细胞活力检测显示在外加Zn离子48h后细胞生长被抑制42％；转染p27^KIP1的SGC7901细胞的集落形成率较对照组明显减少（P＜0．01）；p27^KIP1的过表达能够显著地增加G1期的细胞数，由33．68％增加到69．29％（P＜0．01）。研究表明，p27^KIP1基因可抑制SGC7901细胞由G1期向S期过渡，从而抑制细胞增殖。     

HIF-1α对人脑胶质瘤SHG44细胞恶性度的影响及其机制

 目的 探究过表达低氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)对人脑胶质瘤SHG44细胞恶性度的影响及其可能机制。方法 体外培养SHG44细胞,转染过表达HIF-1α入SHG44细胞,评估HIF-1α转染效率;对比分析HIF-1α过表达对SHG44细胞的增殖、干性、迁移和侵袭的影响;ELISA法检测肿瘤相关炎性反应因子(TNF-α,IL-10,IL-17和IL-1β),Western blot检测SHG44细胞焦亡相关蛋白[炎性小体3(inflammasome3,NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)、GSDMD、GSDME和转化生长因子-β₁(transforming growth factor-β₁,TGF-β₁)]的表达,明确HIF-1α对焦亡的关系。结果 HIF-1α过表达后SHG44细胞明显肿胀增多,细胞的增殖、干性、迁移和侵袭能力较对照组明显增强,与对照组相比肿瘤炎性因子(TNFα,IL-10和IL-1β)表达水平均明显升高,而肿瘤炎性反应抑制因子IL-17表达水平明显下降;HIF-1α过表达后焦亡相关蛋白(NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、GSDME和TGF-β₁)表达明显上调(P<0.05)。结论 HIF-1α过表达可能通过促进焦亡提高SHG44细胞的增殖、干性、迁移和侵袭能力。     

金蒸汽激光低功率照射对基因转染血管平滑肌细胞的影响

本文将体外培养的血管平滑肌细胞经波长为６２７．８ｎｍ的金蒸汽激光，以功率密度为１、１０、１００ｍＷ／ｃｍ＾２，能量密度为０．６、６、６０Ｊ／ｃｍ＾２照射后，转染Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ包课的含Ｌｓｃ Ｚ基因的质粒ＤＮＡ，经７２小时培养，测基因产物β－半乳糖苷酶的活性。结果显示，１和１０ｍＷ／ｃｍ＾２照射组酶活性分别高于对照组３和７倍，而１００ｍＷ／ｃｍ＾２照射组未见明显提高。提示适量的低功率激光照射可     

辐射损伤对HRAD17基因转染不同类型细胞的影响

目的 探讨HRAD17在DNA辐射损伤修复及辐射诱导的凋亡中的作用。方法 利用基因转染技术，对小鼠成纤维细胞NIH3T3和人宫颈癌HeLa细胞均分别转染pDOR-neo载体，pDOR-HRAD17s（正义）和pDOR-HRAD17a（反义）质粒，G418筛选获得阳性克隆。转染后各组细胞去血清培养48h同步化后给予。Co7射线10Gy照射，吸收剂量率为2．54Gy／min，加入完全培养基继续培养，并于0、6、12、14、36和48h收集固定细胞，碘化丙啶（PI）避光染色后，流式细胞仪检测细胞DNA量。结果 在辐射损伤后，转染正义HRAD17的成纤维细胞主要发生G1／S期阻滞，转染正义HRAD17的肿瘤细胞主要发生G2/M期阻滞；转染正义HRADl7的细胞凋亡比例降低，转染反义HRAD17的细胞凋亡比例升高。结论 HRAD17同时参与细胞周期G1／S和G2/M期阻滞，并抑制辐射损伤诱导的细胞凋亡。     

Lovastatin对人粒系白血病细胞增殖和细胞周期的影响

目的:观察洛伐他汀(lovastatin,LOV)对体外培养的人粒系白血病细胞株HL-60增殖和细胞周期的影响.方法:采用生长曲线测定、MTT检测、流式细胞仪分析等实验技术.结果:LOV对HL-60细胞有增殖抑制作用,能使细胞周期阻滞于G0/G1期,该作用呈剂量-效应和时间依赖关系.结论:LOV能抑制HL-60细胞的增殖,同时影响该细胞的细胞周期进程.     

BKca对血管平滑肌细胞周期及增殖调控的影响

目的观察大电导钙激活钾通道（1arge—conductance，Ca＋ -activated K＋channels，BKea）与血管平滑肌细胞（vascular smooth mmde cell，VSMC）周期和增殖之间的内在联系。方法培养大鼠血管平滑肌细胞分别加入BKca的阻断剂Iberiotoxin（mTX）和开放剂NS1619；噻唑蓝比色法（MTT）观察VSMC的增值情况；流式细胞仪分析IBTX和NS1619对VSMC细胞周期的影响。所有数据采用t检验进行统计学处理。结果NS1619组的0D值显著升高（P〈0．05），IBTx组的OD值下降（P〈0．05）。NS1619组的OD值明显高于IBTX组（P〈0．001）；NS1619能降低G1期细胞百分比（63．044-3．66）％，升高G2期细胞百分比（21．7±2．26）％，IBTX能升高G1期细胞百分比（77．62±2．20）％，降低G2期细胞百分比（13．02±2．09）％。结论阻断或开放BKca能调节血管平滑肌细胞增殖，其机制可能与改变细胞内Ca＋浓度有关。     

Bcl-xL基因转染对脊髓损伤细胞凋亡的影响

目的观察脂质体介导的Bcl—xL基因体内转染对大鼠脊髓损伤后伤区脊髓细胞凋亡和神经功能恢复的影响。方法制备大鼠胸段脊髓T8.9压迫损伤模型。38只大鼠分成三组：(1)损伤 pSFFV．Bcl—xL转染组(实验组，15只)；(2)损伤 pSFFV．GFP转染组(对照组，15只)；(3)假损伤组(8只)。将阳离子脂质体质粒混合后直接注入大鼠损伤脊髓，伤后3d和7d利用半定量逆转录一聚合酶链式反应(RT—PCR)和免疫组化检测Bcl—xL基因体内表达；原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡；采用开放场地试验BBB评分和斜板试验，评价神经功能。结果脊髓损伤后3d和7d损伤局部Bcl—xL mRNA和蛋白较对照组和假损伤组表达明显增多；TUNEL结果显示，实验组损伤节段细胞凋亡数比对照组明显减少，神经功能改善。结论脂质体介导Bcl—xL体内转基因治疗可有效转染脊髓的神经细胞；外源性Bcl—xL在损伤脊髓的过度表达可减少脊髓不完全性损伤后凋亡引起的神经元死亡和增强神经细胞成活，促进神经功能恢复。     

腺病毒介导血管紧张素Ⅱ2型受体基因转染对血管平滑肌细胞生物学行为的影响

为探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）2型受体（AT2R）基因表达对血管平滑肌（VSMC）增殖,迁移和凋亡等生物学行为的影响,用同源重组方法构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体（AdCMV-AT2R),体外转染VSMC,用流式细胞仪检测AT2R转染表达率,RT－PCR方法检测AT2RmRNA表达,VSMC增殖用MTT比色法和5－溴脲苷（BrdU)掺入法检测,迁移用改良Boyden趋化小室法检测,细胞凋亡用流式细胞仪、原位末端标记法检测,结果表明,AdCMV-AT2R转染后,VSMC表达率为89．51％,AT2R峰值表达时,MTT吸光度和BrdU掺入量分别降低61．4％和51．6％（P＜0．01）VSMC的跨膜迁移数减少62．2％（P＜0．05）。细胞凋亡增加约3．2倍,bax表达增加76．3％（P＜0．05）。提示AT2R表达可介导报制VSMC的增殖和迁移,并诱导其发生凋亡。     

腺病毒介导PTEN和TIMP-2抑制胶质瘤U87体外侵袭力的研究

目的　探讨腺病毒介导PTEN和TIMP 2对人脑胶质瘤细胞体外侵袭力的抑制作用。方法　用含PTEN和TIMP 2基因的重组腺病毒载体体外转染人胶质瘤细胞系U87,用RT PCR、Westernblot检测目的基因与蛋白表达。通过Boyden小室法检测U87转染前后细胞体外侵袭力的变化 ,同时采用胶原酶谱法分析MMP 2、MMP 9酶的相对活性。结果　转染AdPTEN、AdTIMP 2后U87细胞中目的基因与蛋白的表达上调 ,U87、AdX gal、AdPTEN、AdTIMP 2和PTEN TIMP 2的侵袭细胞数分别为 5 5 6 4± 13 2 7、4 8 2 6± 14 75、35 2 7± 10 94、2 7 38± 12 81和 19 16± 5 4 5 ,转染靶基因后U87细胞的体外侵袭力受到明显抑制 ,联合转染后侵袭力的抑制更明显 ,这与MMP的改变并不完全一致。结论　重组腺病毒载体介导的PTEN与TIMP 2联合基因治疗可能是抗胶质瘤侵袭的一个有用方法     

X线对脑胶质瘤细胞系增殖的影响

为探讨不同Ｘ线处理对脑胶质瘤细胞增殖的影响，选用人脑星形细胞瘤ＳＷＯ－３８系，采用ＭＴＴ法观察Ｘ线对胶质瘤细胞生长的影响，ＡＢＣ法检测增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因表达的变化。结果显示：①不同剂量（５，１０，１５，２０，２５Ｇｙ）Ｘ线对胶质瘤细胞生长具有明显的抑制作用，生长曲线低平，照射后４８ｈ的抑制率分别为３３％、４７％、５１％、５８％和６６％；②不同剂量率（８０，１６０，２４０，３２０，４００ｃＧｙ／ｍｉｎ）Ｘ线照射后４８ｈ的抑制率分别为５８％、５４％、４７％、２５％和３０％；③超分割照射后４８ｈ的抑制率为６２％，而单次照射组为５０％；④不同剂量（５，１０，１５，２０，２５Ｇｙ）Ｘ线照射后ＰＣＮＡ－标记率（ＬＩ）分别为９１％，８７％，８１％，７８％，６９％，ＰＣＮＡ－ＬＩ与存活细胞ＯＤ值呈显著性正相关关系（Ｐ＜０．０５）。说明①ＳＷＯ细胞生长曲线、抑制率与Ｘ线剂量、剂量率和照射方式之间密切相关；②ＰＣＮＡ－ＬＩ与存活细胞ＯＤ值呈正相关关系，ＰＣＮＡ是胶质瘤细胞增殖的标志之一。     

乙醛对大鼠HSC增殖以及胶原基因表达影响的实验研究

目的：研究乙醛对新分离的肝星状细胞（hepatic stelalate,cell,HSC）增殖、表达α1（Ⅰ）型胶原mRNA、IkB和NF-kB的影响，以探讨酒清性肝纤维化发病机理。方法：用链霉蛋白酶、胶原酶以及密度梯度分离培养大鼠肝星状细胞。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、原位杂交法、免疫细胞化学法、凝胶电泳迁移率法（EMSA）分别检测肝星状细胞的增殖、胶原合成、IkBα以及NF－kB的表达。结果：（1）成功分离出大鼠肝星状细胞。（2）乙模型刺激新分离培养的肝星状细胞后细胞明显增殖；乙醛刺激传一代肝星关细胞后，α1（Ⅰ）型胶原mRNA表达显著增加；IkBα表达明显下降；乙醛作用肝星状细胞后30min，NF－kB的表达即有增加，到120min时达最高值。结论：乙醛可以使静止的肝星状细胞活化，表现为增殖、α1（Ⅰ）型胶原mRNA合成、IkBα表达下降、NF-kB活性增加。     

fas基因修饰食管癌细胞的体外抑瘤效应

为研究fas基因转导对食管癌细胞的体外抑制作用，构建fas基因真核表达3载体fas-pBK并将其转导入食管癌细胞EC109.Western blot结果证实fas基因转导株Fas-EC109表达高水平的Fas蛋白；细胞生长曲线和软琼脂集落形成实验结果显示，与对照细胞相比，Fas-EC109的群体倍增时间延长，克隆形成能力降低，MTT比色法表明Fas-EC109对CDDP、VCR、5－FU的敏感性明显增加。本研究结果提示，转导fas基因能有效抑制体外培养的食管癌细胞的生长，增强癌细胞对化疗药物的敏感性。     

加强脑肿瘤分子病理机制与基因治疗研究

简述了脑肿瘤研究的３个主要方向及其所取得的重要研究成果：（１）脑肿瘤的发生和发展的分子生物学基础；（２）脑肿瘤恶性增殖和侵袭的病理机制；（３）脑肿瘤基因治疗研究概况。提出我军神经外科学研究应进一步从分子病理学角度加强对脑肿瘤的基础和治疗研究。     

肾上腺素及地塞米松对白内障患者晶状体上皮细胞增殖的影响

为了观察肾上腺素及地塞米松对白内障患者晶状体上皮细胞 (lensepithelialcell,LEC)增殖的影响并探讨其机制 ,在行白内障超声乳化术中 ,取出中央 5～ 7mm的晶状体前囊 ,将其均分成 3等份 ,用于对照组及两实验组 ,分别培养于 10 -6mol/L的肾上腺素及地塞米松 4 8h,免疫组织化学染色后 ,采用医用多功能图像分析系统测定增殖细胞核抗原 (proliferatingcellnuclearantigen ,PCNA)阳性面积率。结果显示 ,10 -6mol/L的肾上腺素及地塞米松对LEC的增殖有明显的抑制作用 ,PCNA的阳性面积率分别为 (2 6 14± 0 92 2 ) %和(3 338± 0 838) % ,与对照组比较 ,差异有显著性意义 (P <0 0 1)。研究表明 ,肾上腺素及地塞米松对白内障患者LEC有明显的抑制作用 ,从而可用于白内障术后防治后囊膜混浊的发生 ,为临床筛选防治后发性白内障的药物提供了科学依据。     

反流物对食管组织内细胞增殖相关基因表达的影响

用不同手术方式制作单纯胃食管反流（Ｇ组）、单纯十二指肠食管反流（Ｄ组）、十二指肠胃混合食管反流（ＤＧ组）及无反流对照组（Ｃ组）动物模型,于术后不同时期取出食管,用免疫组化法检测ｐ１６、ＰＣＮＡ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ＣＤＫ４等基因的表达。结果显示：Ｄ组、ＤＧ组大鼠食管组织中ＰＣＮＡ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ＣＤＫ４基因表达显著高于Ｇ组,并随反流时间延长而明显增强,反流组与Ｃ组相比均有显著差异;各组不同时     

Calponin对培养的自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用

Ｃａｌｐｏｎｉｎ是一种抗细胞增殖基因，在多种病理情况下表达失调。用脂质体＋载体质粒ｐＣＡＧＧＳ作介导向培养的自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）血管平滑肌细胞内导入人重组Ｃａｌｐｏｎｉｎ（ｈＣＮ），目的基因可在该细胞组织内表达，并持续较长时间（４周以上）。ＭＴＴ法的检测结果表明，导入ｈＣＮ基因能明显抑制ＳＨＲ平滑肌细胞的增殖。这种作用对血管成形术后再狭窄的防治和高血压时血管壁肥厚的逆转具有潜在的实用价值。     

腺病毒介导人p53抑癌基因对肝癌细胞系HepG2生物学行为的影响

研究腺病毒介导入野生型Ｐ５３抑制肝癌细胞系ＨｅｐＧ２生物学行为的影响。构建含人野生型Ｐ５３抑癌基因的生组腺病组载体，导入肝癌细胞系ＨｅｐＧ２后，分别用光镜，电镜ＴＵＮＥＬ法检测细胞凋亡发生和在裸鼠体内的成瘤性改变。     

不同浓度葡萄糖对大鼠间皮细胞增殖及细胞外基质产生的影响

观察了不同浓度葡萄糖对膜腹间皮细胞增殖和产生细胞外基质的作用，发现：①不同浓度的高渗葡萄糖可以抑制大鼠腹膜间皮细胞的增殖，引起间皮细胞的死亡，增强层粘连蛋白和Ⅳ型胶原的产生；②葡萄糖浓度与在此环境下培养的活细胞百分比呈负相关，但与层粘连蛋白的产生呈正相关，且活细胞百分比与层粘连蛋白的产生呈负相关。提示：培养液中葡萄糖的浓度在大鼠腹膜间皮细胞的增殖和细胞外基质的产生中起重要作用。