小鼠MHC-I/MHC-II类分子限制性表位MAGE-3 多肽疫苗的设计及其免疫效应

 【目的】 设计小鼠MHC-I/MHC-II类分子限制性表位黑色素瘤抗原-3(MAGE-3)多肽疫苗即包含CD4+-CD8+ T细胞表位的MAGE-3多肽抗原,并探讨其免疫效应｡ 【方法】 采用计算机模拟设计的方法,结合文献资料选择MHC-I/MHC-II类分子限制性表位的MAGE-3多肽｡采用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)､细胞毒性实验评价多肽诱导T淋巴细胞的增殖能力及刺激的T淋巴细胞释放细胞因子的能力｡ 【结果】 获得的联合表位多肽序列为FITC-YEEYYPLIFLDNDQETMETSEEEEYEEYYPLIF,高效液相色谱法分析多肽纯度≥90%｡MAGE-3表位多肽抗原能够诱导T淋巴细胞增殖,并诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ,高于对照组(49 vs. 6 spots/106,P ≤ 0.05)｡MAGE-3表位多肽可诱导细胞毒T淋巴细胞使42%的MFC 细胞溶解破裂,高于对照组(P ≤ 0.05)｡ 【结论】 包含CD4+-CD8+ T细胞表位的MAGE-3多肽抗原在体外实验中显示有一定的免疫效应,此抗原肽可作为多肽疫苗用于对表达MAGE-3抗原的H-2KK型小鼠胃癌进行免疫治疗｡     

小鼠MHCⅠ类分子限制性MAGE-3多肽表位筛选

目的筛选小鼠MAGE-3抗原来源的MHCⅠ类分子限制性多肽表位。方法用计算机模拟设计，从MAGE-3中选取得分最高的5个侯选表位。根据诱导T淋巴细胞增殖能力、对肿瘤细胞的特异性杀伤活性及释放细胞因子含量，评价多肽的免疫原性及免疫反应性。结果树突状细胞(DC)负载MAGE-341～49能够强效诱导T淋巴细胞增殖，DC负载MAGE-341～49诱导的T细胞以MHCⅠ类分子限制性方式，特异性识别表达MAGE-3抗原的肿瘤细胞。DC负载MAGE-341～49诱导的T细胞群主要为CD8^ T细胞，同时天然免疫系统中的NKT、γ／δT也得到活化。结论从小鼠MAGE-3抗原中筛选出CD8^ T细胞识别的、MHCⅠ类分子限制性多肽表位MAGE-341～49。     

小鼠MHCⅠ类分子限制性MAGE-3多肽表位筛选

目的筛选小鼠MAGE-3抗原来源的MHC Ⅰ类分子限制性多肽表位.方法用计算机模拟设计,从MAGE-3中选取得分最高的5个侯选表位.根据诱导T淋巴细胞增殖能力、对肿瘤细胞的特异性杀伤活性及释放细胞因子含量,评价多肽的免疫原性及免疫反应性.结果树突状细胞(DC)负载MAGE-341～49能够强效诱导T淋巴细胞增殖,DC负载MAGE-341～49诱导的T细胞以MHC Ⅰ类分子限制性方式,特异性识别表达MAGE-3抗原的肿瘤细胞.DC负载MAGE-341～49 诱导的T细胞群主要为CD8+T细胞,同时天然免疫系统中的NKT、γ/δT也得到活化.结论从小鼠MAGE-3抗原中筛选出CD8+T细胞识别的、MHC Ⅰ类分子限制性多肽表位MAGE-341～49 .     

多价精子抗原表位肽的设计与免疫效应研究

目的 开发可供两性使用的多价合成嵌合肽疫苗。方法 选择小鼠精子／睾丸特异性抗原SP17、Cyritestin中特异性氨基酸序列与牛核糖核酸酶非限制性T细胞表位作为骨架，按一定连接方式设计、合成新抗原35肽，并与弗氏佐剂混悬后免疫雌性BALB／C小鼠。结果 在430A固相自动肽合成仪上成功地合成35肽，并经HPLC纯化、质谱鉴定证实其纯度达95％以上；免疫后小鼠血清特异性IgG抗体滴度最高达1：6000，阴道粘膜冲洗液中特异性IgA抗体滴度最高达1：300；小鼠脾脏淋巴细胞增殖率达50％左右，淋巴细胞分泌的INF－γ和IL－4分别为60、108μg/ml；实验组BALB／c雌鼠妊娠率平均降至60％，每胎产仔数平均降低58％－71％。结论 含有两种特异性精子抗原中特异性氨基酸序列的新抗原可激发小鼠产生较理想的特异性体液免疫和粘膜免疫，并使小鼠受孕率下降，为研制适宜于两性的多价抗生育疫苗提供了实验基础。     

GPC3特异性HLA-A11限制的T淋巴细胞表位肽免疫活性检测

目的设计合成人类白细胞抗原（HLA）-A11限制性T细胞识别的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）多肽,并检测其免疫原性和反应性。方法利用BIMAS和SYFPEITHI评分系统评价GPC3多肽与HLA-A11分子的结合能力,预测出相应的抗原谱,合成HLA-A1101限制性GPC3多肽库;流式细胞仪检测HCC患者HLA-A11分子的表达;多肽刺激外周血淋巴细胞,酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测T细胞对GPC3多肽的反应性。结果流式细胞仪检测32例HCC患者,7例HLA-A11分子表达阳性（21.9%）;ELISPOT检测发现17例（53.1%）HCC患者的T细胞应答阳性,7例（21.9%）HLA-A11表型检测阳性的HCC患者,T细胞应答结果成强阳性。HLA-A11限制性GPC3多肽应答率符合人群中相应基因位点的自然表达率。结论 GPC3多肽设计合理,具有良好的免疫原性和反应性。     

MAGE-12的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位肽的预测及其三维结构构建

[目的]从理论上分析预测肿瘤抗原MAGE- 12(melanoma antigen- 12)的HLA-A2(histocompatility leukocyte antigen-A2)限制性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位肽并构建其三维结构.[方法]以肿瘤特异性抗原MAGE-12为研究目标,采用超基序法、量化基序法、多项式法、延展基序法与三维结构构建相结合的CTL表位预测方法.[结果]预测出的MAGE-12的表位中有4个符合HLA-A2限制性CTL表位要求.[结论]预测出的4个HLA-A2限制性CTL表位为MAGE-12的表位的可能性较大,经后续实验筛选、鉴定后,可用于基于MAGE-12的肿瘤治疗性多肽疫苗的设计研究.     

肝癌相关肿瘤抗原HLA-A2限制性CTL表位的预测

目的：预测肝癌肿瘤抗原的HLA-A2限制性CTL表位。方法：选择与肝癌相关的肿瘤抗原MAGE-1，MAGE-3，MAGE-8，p53及AFP为研究目标，采用SYFPEITHI基序法远程预测系统和量化基序多项式法结合的预测方法进行HLA-A*0201限制性CTL表位预测。结果：共预测出与肝癌相关的肿瘤相关抗原的35个HLA-A2限制性CTL表位。结论：两种预测方法结果的一致性较好。所预测的35个肿瘤抗原HLA-A2限制性CTL表位经实验筛选，鉴定后，可望用于新型肝癌治疗性多肽疫苗的设计研究。为临床肝癌特异性治疗奠定基础。     

免疫检查点B7-H3表位疫苗的设计及其抗肿瘤活性

B7-H3是在多种肿瘤表面过表达的免疫检查点分子,是肿瘤免疫治疗的理想靶点。利用本实验室前期设计的硝基化T细胞表位为基础,构建了可靶向免疫检查点B7-H3的表位疫苗。该疫苗能在CT26结肠癌模型中显著抑制肿瘤生长,且与PD-L1蛋白疫苗有明显的协同作用。B7-H3疫苗可以增加脾脏T淋巴细胞中CD4⁺ T细胞的比例和肿瘤浸润T淋巴细胞中CD8⁺ T细胞的比例,同时减少肿瘤浸润CD4⁺ T淋巴细胞中抑制性Treg细胞的比例,有效改善肿瘤免疫抑制微环境。研究结果提示,B7-H3表位疫苗可以作为有效的肿瘤疫苗候选分子。     

MAGE-12的新B细胞表位抗原性研究

目的:在已设计合成肿瘤抗原MAGE-12的B细胞表位基础上对其进行鉴定。方法:在预测MAGE-12的B细胞表位序列为LEQRSQHCKPEE(3～14)的基础上,采用4分枝多重抗原肽结构设计合成抗原肽,免疫C-57BL/6小鼠,产生多克隆抗体,应用ELISA实验检测多克隆抗体是否为人的抗原肽的特异性抗体。结果:免疫C-57BL/6小鼠后可产生MAGE-12的抗原特异性的多克隆抗体,抗体效价最高达1:256,证明为MAGE-12抗原肽的特异性抗体。结论:证明所预测的表位LEQRSQHCKPEE(3～14)为MAGE-12的B细胞新表位,具有抗原特异性。     

表位肽疫苗的研究进展

目前应用的疫苗主要是以减毒、灭活的病原体及其抗原成分（亚单位疫苗）为基础,存在生物危害性和遗传变异致使原疫苗效力丧失等问题。而且传统的疫苗无法对大多数肿瘤及HIV、HCV、结核杆菌等几种难以克服的传染性疾病实施有效的治疗和预防。随着生物化学、分子免疫学技术及基因工程技术的发展,表位疫苗的出现弥补了传统疫苗的一些不足,尤其在诱导细胞免疫方面,减少了疫苗毒副作用,提高了安全性,增强了免疫针对性。目前,表位疫苗在避孕、传染性疾病、恶性肿瘤疫苗等方面已成为研究的热点。     

肿瘤抗原MAGE-3 CTL预测表位的计算机分子模拟研究

目的 从理论上分析预测表位与ＨＬＡ－Ａ２分子的结合情况及其为ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位的可能性。方法 应用计算机分子模拟的方法,建立ＭＡＧＥ－３４个ＣＴＬ预测表位的ＨＬＡ－Ａ２结合三维结构和各多肽与ＨＬＡ－Ａ２分子所形成复合的三维结构。结果 ４个预测表位的三维结构完全符合ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位的结构要求,且都能与ＨＬＡ－Ａ２分子结合。结论 ４个ＣＴＬ预测表位为ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位的     

重组轮状病毒抗原表位亚单位疫苗的小鼠保护性

目的评价重组表达的轮状病毒(RV)抗原表位疫苗的小鼠体内保护效果及安全性.方法在以FlockHouse virus病毒外壳蛋白为载体的外源抗原表位呈递系统(FHV-RNA2系统)中构建和重组表达RV Vp4蛋白上第223～262位抗原表位(REABC);在原核系统[质粒pET,大肠杆菌BL21(DE3)]中表达的REABC免疫小鼠用细胞培养适应的参照RV Wa(G1PA型)和SA11(G3P2型)经口腔灌胃攻击,对RV攻击后的免疫小鼠和对照小鼠的感染症状、排毒情况、血清抗体中和病毒感染性效价进行测定和分析.结果REABC可诱导免疫小鼠产生较强的抗-Wa和抗-SA11株血清中和抗体和特异的免疫记忆反应,有效保护免疫小鼠对Wa和SA11的攻击(不腹泻),减少病毒在体内复制水平和排毒时间,与对照组相比差异具有显著性(P＜0.001).结论重组表达RV抗原表位REABC对小鼠具有较好的免疫保护效果和安全性.     

重组蛋白CTB表位对HCV多表位DNA疫苗的小鼠中免疫应答的影响

将一12aa的CTB表位连接于丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV)复合多表位抗原基因PCX的5'端,再克隆于真核表达载体pcDNA3中,获得重组质粒pcDNA3/CTB-PCX,利用表达IL-12的pWRG/mIL-12作为佐剂,肌注免疫小鼠后6W,用重组蛋白GZ-PCX加强免疫1次,第6W时可检测到较高水平的抗GZ-PCXIgG,最高滴度达1：10^3,与对照pcDNA3/PCX相比无显升高,提示CTB表位并无明显的增强PCX基因特异性体液免疫应答的作用。重组蛋白GZ-PCX可有效提高抗体水平,促进CD^8 T细胞增殖。免疫小鼠可诱发针对GZ-PCX融合蛋白的迟发性超敏反应（DTH）,免疫后小鼠体重正常,肝脾未见明显肿大。具有良好安全性。     

结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的：预测及鉴定结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）抗原Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位，为基于表位的结核疫苗研究提供依据。方法：应用SYFPEITHI数据库预测结核杆菌抗原Ag85C序列中可能存在的HLA-A＊0201限制性T细胞表位，利用T2细胞株分析各预测的抗原肽与HL-A＊0201分子的亲合力，选取高亲合力肽诱导特异性CTL细胞，检测各高亲合力肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFN-γ水平、在体外的CTL增殖反应以及细胞杀伤毒性，逐步鉴定出Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。结果：SYFPEITHI数据库从Ag85C序列中预测到14条能够结合HLA—A＊0201分子的抗原肽，其中3个抗原肽（170～178aa、317～325aa和144～153aa）显示与T2细胞上HLA-A＊0201分子有高结合力，而抗原肽FLTREMPAWL（144～153aa）能够诱导大多数HLA—A＊0201阳性结核患者及PPD（＋）健康志愿者产生特异性CTL细胞，并分泌大量的IFN-γ，能够诱导CTL体外发生增殖，能够产生特异性杀伤活性。结论：成功鉴定出抗原肽FLTREMPAWL（144～153aa）结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位，可作为结核疫苗设计的候选表位，为进一步研发新型有效的抗结核疫苗奠定了基础。     

穿膜序列对MHC-Ⅰ类限制性CTL表位呈递影响的研究

目的:从时间依赖性抗原呈递动力学的角度研究穿膜序列(CPP)对MHC-Ⅰ类限制性CTL表位呈递的影响.方法:应用多肽固相合成技术,分别合成含CPP与H-2Kb限制性CTL表位OVA257-264的融合多肽,同时合成该表位N、C端自然延伸的抗原肽和无关对照肽.采用流式细胞仪(FACS)分析技术,检测抗原呈递细胞(APC)在不同时相点对上述各抗原肽进行MHC-Ⅰ类呈递的情况.结果:与不含CPP的抗原肽相比,含CPP的抗原肽中的CTL表位更易进入APC内MHC-Ⅰ类呈递途径,表现为呈递所需时间明显缩短(P<0.05),且同一时相点的呈递强度显著增加(P<0.05).结论:在外源性抗原肽中引入穿膜序列可明显促进其MHC-Ⅰ类限制性CTL表位的呈递效率,从而有效增强外源性抗原肽的免疫原性.     

HIV的抗原表位研究的国内外进展

人类获得性免疫缺陷病毒（HIV）感染后，会刺激人体产生特异性免疫应答反应。其中，以中和抗体为代表的体液免疫应答和以CD8^＋的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）及CD4^＋的辅助性T淋巴细胞（HTL）为介导的细胞免疫应答，对控制HIV在体内的复制有重要作用。在上述免疫应答的过程中，病原体自身所携带的抗原表位是刺激机体产生免疫应答的必备条件。同时，抗原表位的变化也是HIV病毒逃逸机体免疫监视的重要机制之一。本文试就HIV抗原表位的国内外的研究状况做一综述。     

HIV多抗原表位疫苗的构建

以CD8^＋的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和CD4’的辅助性T淋巴细胞（HTL）为介导的细胞免疫应答是有效地控制和清除包括HIV在内的多种病毒病原体的必备条件。因而，人们对于能够诱导CTL和HTL免疫应答的HIV-1疫苗的研究兴趣浓厚，使HIV疫苗很快由学术研究向商品开发和工业生产等领域过渡和延伸。     

肿瘤抗原MAGE-2 HLA-A2限制性CTL表位的预测

目的 预测黑色素抗原ＭＡＧＥ－２的ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位。方法 采用超基序法与量化基序法的联合应用。结果 发现８个ＨＬＡ－Ａ２限制性ＣＴＬ表位。结论 超基序法与量化基序法联合应用可以提高预测效率。     

弓形虫有效抗原表位的筛选及其对小鼠免疫保护性的研究

目的:利用噬菌体随机肽库技术筛选弓形虫抗原的有效表位，并探讨其免疫保护效果。方法：用纯化的弓形虫免疫兔血清IgC对噬菌体12肽库进行三轮筛选，对获得的日的噬菌体用间接ELISA和Dot—ELISA检测其特异性，并对其中的某些克隆进行Western—blot分析和序列测定；用混和噬菌体克隆及强阳性表位克隆免疫BABL／c小鼠．间接ELISA法测定其特异性抗体滴度，攻击感染后观察小鼠存活情况。结果：经三轮筛选，特异性噬菌体得到富集，随机挑取18个克隆经间接ELISA和Dot—ELISA鉴定，有16个克隆能与弓形虫免疫兔血清IgG呈特异性反应。Western—blot分析显示P2克隆能被免抗弓形虫血清所识别，具有类似于弓形虫抗原的免疫原性，其序列为5’-CTTCAGTTGGATCGGGCTCGGTTTTGGAAT CAGGGT-3’，与GenBank的弓形虫已知序列无一级结构的同源性；与原肽库对照组相比，P2实验组和P总实验组免疫小鼠均能诱导出较高滴度的IgG抗体，抗攻击感染后小鼠的存活率及存活时间也均高于对照组。结论：利用噬菌体随机肽库技术获得了弓形虫抗原的有效模拟睥位，这些表位能诱导对弓形虫的部分保护作用。     

HLA-A* 0201限制性GPC3表位肽的初步预测与筛选

目的:筛选HLA-A*0201限制性GPC3优势表位肽,为肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)特异性的免疫细胞治疗提供新的靶标。方法:通过表位预测网站初步筛选HLA-A*0201限制性GPC3表位肽,T2细胞结合实验筛选优势表位肽。结果:通过三大常用的表位预测网站,共筛选了13个评分较高的表位肽,化学合成表位肽,采用T2细胞结合实验显示,有4个表位肽与HLA-A2呈现较高亲和力。结论:抗原表位预测网站结合T2细胞结合实验能初步筛选亲和力较高的HLA-A*0201限制性GPC3表位肽,可能用于HCC特异性CTL治疗的候选标靶。