转甲状腺素蛋白真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建转甲状腺素蛋白(TTR)的真核表达载体,观察其在NIH 3T3细胞中的表达及定位.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到TTR编码序列,将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,构建质粒pcDNA3-TTR-HA.重组质粒通过PCR、酶切测序等证明构建正确后经脂质体转染NIH 3T3细胞,固定并染色后通过荧光显微镜观察该融合蛋白的表达及定位.结果 重组质粒经鉴定证明构建正确.转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要分布在细胞质中.结论 成功构建带HA标签的TTR真核表达载体,该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位,为深入研究TTR在细胞内的相关生物学功能奠定了基础.     

不含POU结构域的八聚核苷酸结合蛋白(NONO)真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建小鼠的不包含POU结构域的八聚核苷酸结合蛋白(NONO)真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达和定位.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织总RNA,通过RT- PCR扩增得到NONO编码序列,将该序列克隆至带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,构建质粒pcDNA3-NONO-HA.通过PC...     

小鼠ATP酶β亚单位真核表达载体的构建和细胞内定位研究

目的构建小鼠ATP酶β亚单位(ATPaseβ)真核表达载体,并观察其在哺乳动物细胞中的表达定位情况。方法取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到ATPaseβ编码序列,将其连接到pMD18-T载体上,然后以pMD18-ATPaseβ为模板扩增得到ATPaseβ编码序列,再将其克隆到真核表达载体pcDNA3/HA上。采用脂质体转染法转染NIH 3T3细胞及293细胞,在荧光显微镜下观察结果。结果 PCR、双酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3/HA-ATPaseβ构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要定位于细胞质,细胞膜上也有表达,而在293细胞中只表达于细胞质。结论成功构建了带有HA标签的小鼠ATPaseβ真核表达载体,该载体能够在哺乳动物NIH 3T3及293细胞中有效表达并正确定位,为进一步研究ATPaseβ的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

小鼠膜联蛋白A1真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建小鼠膜联蛋白A1(annexin-A1,ANXA1)真核表达载体,并检测其在NIH3T3细胞中的表达和定位.方法 采用PCR法从小鼠肝cDNA文库扩增ANXA1基因编码序列,并将其克隆至带有血凝素(HA)标记的真核表达载体pcDNA3-HA上,经PCR、酶切和测序鉴定后,将重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1瞬时转染NIH3T3细胞,采用细胞免疫荧光法检测目的 基因表达情况.结果 菌液PCR、双酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1构建正确,并可在NIH3T3细胞的胞质、胞核和胞膜中广泛表达.结论 成功构建了pcDNA3-HA-ANXA1真核表达载体,该载体中的HA-ANXA1融合基因能在哺乳动物中有效表达并正确定位,为下一步深入研究ANXAl相关的信号通路奠定了基础.     

C反应蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人C反应蛋白(CRP)真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法利用带HA反向互补序列碱基的特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;并使用Westernblot和细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-CRP在NIH3T3细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-CRP真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞膜和核周边内质网的区域。结论成功构建了带HA标签的人CRP真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究CRP的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

GRP78在HepG2细胞的亚细胞定位及真核表达

目的 构建GRP78的真核表达载体以检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位.方法采用激光共聚焦显微镜观察GILP78在HepG2细胞中的定位,用RT-PCR方法从HepG2细胞中扩增GRP78 cDNA序列,构建真核表达载体peDNA3.1-GRP78,转染HEK293细胞,分别用Western blotting和激光共聚焦显微镜检测GRP78在HEK293细胞中的表达和定位.结果 GRP78在HepG2细胞的胞膜和胞质均有表达,GRP78在细胞膜上均匀分布.双酶切鉴定和核酸序列分析证实pcDNA3.1-GRP78真核表达质粒构建成功,该表达质粒转染HEK293细胞后可以瞬时表达GRP78蛋白.结论 正常状态下,GRP78在HepG2细胞胞膜和胞质均有表达.pcDNA3.1-GRP78转染HEK293细胞后能瞬时表达GRP78蛋白,为进一步研究GRP78的功能提供了重要工具.     

无POU域八聚体结合蛋白基因的克隆及其在Hepa1-6细胞内的表达

目的构建小鼠无POU域八聚体结合蛋白(non-POU-domain-containing,octamer binding protein,NonO)真核表达载体并在小鼠Hepa 1-6肝癌细胞内表达,观察NonO胞内表达、定位及脂多糖(LPS)对其定位的影响。方法提取小鼠肝组织总RNA,RT-PCR扩增小鼠NonO基因的蛋白编码序列。采用基因重组技术将其亚克隆至pcDNA3-HA真核表达载体中,将该载体瞬时转染Hepa1-6细胞,通过细胞免疫荧光方法观察NonO的胞内表达及LPS对其定位的影响。结果酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;细胞免疫荧光可见NonO在Hepa 1-6细胞内表达、分布于细胞核,LPS刺激后NonO分布无明显变化。结论成功构建NonO真核表达载体,为研究NonO在基因表达调控中作用及其生物功能提供了重要载体。进一步证实NonO为定位于细胞核的核蛋白。     

基于MS2衣壳蛋白系统的活细胞内JunmRNA定位初探

目的检测细胞中JunmRNA在活细胞内的定位。方法设计引物，构建融合MS2茎环结构串联重复的Jun表达载体（pcDNA3．1-Jun-MS2-48X）。转染细胞后，绿色荧光蛋白（GFP）-MS2融合蛋白可与MS2茎环串联重复结构结合，通过荧光显微镜观察GFP的细胞定位，能够间接确定JunmRNA在细胞内的定位。结果成功构建了pcDNA3．1-Jun-MS2-48X表达载体，经荧光显微镜观察，能够看到明显的绿色荧光，并且在细胞内聚集。结论实现了在细胞内实时观察JunmRNA，为在单细胞水平上JunmRNA的定位提供了新的技术方法。     

人转化铁受体基因的克隆和表达

目的探讨人转化铁受体基因（hTfR）克隆和高效表达的方法及临床意义。方法用RT-PCR法从人胚肝、肺组织中克隆hTfR基因，构建重组表达质粒pcDNA3-hTfR和pEGFP-C1-hTfR，转染人胚肾上皮HEK293细胞。用Western印迹法检测pcDNA3-hTfR转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达情况；用荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察重组pEGFP-C1-hTfR质粒转染HEK293细胞后hTfR蛋白的表达水平及亚细胞定位。结果经过DNA测序证实，克隆的hTfR基因为全长cDNA序列（2332bp）。Western印迹法检测到转染细胞能有效表达190×10^3的hTfR蛋白，荧光显微镜和共聚焦荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白（GFP）-hTfR融合蛋白主要定位于细胞膜。结论从人胚肝、肺组织中可以成功克隆hTfR基因，该基因转染HEK293细胞后可获得hTfR蛋白的高效表达。hTfR主要定位于细胞膜。     

一种用于上调内源性人SOD1表达多肽筛选的随机文库及细胞系的构建

目的以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为示踪物,建立一种简便、经济、有效的随机多肽文库,为进一步筛选出可上调内源性人SOD1表达多肽的药物奠定基础。方法采用点突变技术,在pET-14b-His-Tat-EGFP载体多克隆位点XhoI之后插入12个随机多肽的36个随机碱基序列。用阳离子脂质体LipofectamineTM2000包裹已构建的重组质粒pDsRed1-1-SOD1p后,转染NIH/3T3细胞,荧光显微镜观察SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白的表达。用G418筛选稳定表达SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白的细胞系,荧光显微镜检测红色荧光蛋白的表达及定位。结果在示踪载体的基础上构建的随机多肽文库理论上至少包含了107个独立克隆,且几乎所有克隆插入的随机片段都是36个碱基。稳定转染3个月后,重组质粒转染的细胞质及细胞膜上均有携带SOD1启动子的红色荧光蛋白的表达。结论成功建立随机多肽表达文库,获得了稳定表达SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白的NIH3T3细胞系。