人心房肌KChlP2和SK2基因表达检测及方法研究

目的检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础。方法提取人心房肌组织总RNA,采用RT-PCR方法获取KChIP2、SK2、GAPDH、β-actin目的片段,与pMD-18Tvector连接成重组质粒,转化到大肠杆菌DH5α中,通过PCR和测序鉴定。提取含目的基因的质粒作为标准品。采用Taqman探针法与SYBR Green I法分别检测人心房肌SK2与KChIP2基因表达和构建标准曲线。结果人心房肌存在KChIP2和SK2基因表达,质粒标准品经过PCR鉴定并测序,与Pubmed数据库完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2〉0.99。结论成功检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,构建的质粒标准品能用于后续实验。     

人心房肌KChIP2基因表达质粒pEGFP-KChIP2

目的：KChIPs作为瞬时外向钾通道（Ito）最重要的辅助亚基,在调控通道基因表达和电流特性中起重要作用。本实验拟构建人心房肌KChIP2基因表达质粒,为研究KChIP2对Ito的调控功能奠定基础。方法：①提取人心房肌总RNA,逆转录得到cDNA;②通过特异性引物进行PCR扩增得到KChIP2编码区全长序列,亚克隆到pMD18-T载体中．得到重组克隆质粒pMD18-T—KChIP2;③再设计带有酶切位点HindⅢ和BamH Ⅰ的特异性引物,对重组克隆质粒pMD18-T—KChIP2进行PCR扩增,得到含有酶切位点的KChIP2编码区全长序列;④对含有酶切位点的KChIP2全长片段和pEGFP—c1进行HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切反应,然后进行电泳后胶回收,再进行连接和转化反应;⑤提取质粒,测序鉴定。结果：质粒测序结果与PubMed数据库KchIP2（AY026328）序列比对,同源性为99％。结论：成功构建人心房肌KChIP2基因表达质粒,为下一步转染实验研究KChIP2对瞬时外向钾通道的功能调控奠定了基础。     

人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平检测方法的建立

目的：建立实时荧光定量PCR检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平的检测方法,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础。方法：提取人肠系膜动脉组织总RNA,采用RT-PCR方法获取sGCα、sGCβ、GAPDH基因片段,与pMD-18T vector连接,并转化到大肠杆菌DH5α细胞,通过PCR和测序鉴定重组质粒。提取含目的基因的质粒作为标准品,采用SYBR GreenⅠ法检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达和构建标准曲线。结果：人肠系膜动脉平滑肌存在sGCα和sGCβ基因表达,质粒标准品经过PCR鉴定并测序,与数据库公布的序列完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2〉0.99。结论：建立了稳定的定量检测方法,并成功用于检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达,构建质粒标准品能用于后续实验。     

Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。结果:重组质粒经PCR扩增及序列测定表明,pGMT/Satb2基因已成功克隆。结论:所构建的pGMT/Satb2基因实时荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此法可作为实时荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测人c-myc基因方法的建立

目的构建含有c-myc基因的重组质粒并以其为模板,建立以SYBR GreenⅠ染料为荧光指示剂的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测c-myc的标准曲线,为FQ-PCR准确检测c-myc奠定基础。方法用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人食管鳞癌组织的总mRNA中反转录扩增c-myc cDNA,将纯化的PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后挑选阳性克隆重组质粒,分别用PCR扩增、限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切进行鉴定并测序分析。用紫外分光光度计测质粒浓度,计算拷贝数制备FQ-PCR浓度梯度标准品。最后对质粒标准品进行FQ-PCR检测。结果PCR扩增、酶切鉴定及测序分析均证实c-myc重组到pGEM-T Easy载体上。建立了人c-myc标准曲线,其对数与相应的Ct值(循环阈值)具有良好的相关性,相关系数r2=-0.99～-1,斜率为-3.1～-3.6。结论所构建的人c-myc质粒标准品应用SYBR GreenⅠ荧光染料技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏性和特异性高,准确可靠,此方法可作为FQ-PCR检测c-myc基因的标准方法。     

线粒体转录复合物各因子质粒标准品的构建

目的:构建大鼠线粒体转录因子TFAM(A)、线粒体转录因子TFB1M(B1)、线粒体转录TFB2M(B2)及线粒体RNA聚合酶(POLRMT)的质粒标准品,为检测内耳细胞线粒体TFAM、TFB1M、TFB2M、POLRMT的mRNA表达水平做基础。方法:设计特异性引物和探针,提取大鼠内耳组织总mRNA逆转录成c DNA,PCR扩增、纯化目的片段,将纯化产物与p Zero Back/blunt载体重组,提取重组质粒,经测序鉴定后,用实时荧光绝对定量PCR建立标准曲线。结果:测序结果与各目的序列一致,获得良好的标准曲线(R2>0.99)。结论:成功构建了各目的基因的质粒标准品。     

HER-2／neu·siRNA表达载体的构建及对人乳腺癌细胞株的影响

目的：探讨siRNA对人乳腺癌细胞株SK—BR-3的HER-2／neu基因表达的影响。方法：以HER-2／neu mRNA序列为模板设计合成2对siRNA序列,构建pGenesil-1-HER-2／neusiRNA重组质粒,转化感受态的大肠杆菌,质粒酶切、测序鉴定。转染SK—BR-3细胞48h后,提取RNA进行RT—PCR,采用方差分析（ANOVA）,分析RNA干扰效应。结果：成功构建了pGenesil-1-HER-2／neu siRNA重组质粒,成功转染SK—BR-3细胞。重组质粒抑制HER-2／neu基因的表达接近54．45％（P=0．000）。结论：HER-2／neu siRNA重组质粒明显下调HER-2／neu基因在乳腺癌细胞中的表达。     

版纳微型猪近交系TNF-α基因mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的 快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要基因TNF-α的表达情况,构建TNF-α基因及内参GAPDH基因荧光定量PCR质粒标准品.方法 利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪建立动物模型,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物.进行RT-PCR扩增.纯化目的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR,生成标准曲线.结果 建立的TNF-α基因和GAPDH内参基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法灵敏度分别可达10<''3>和10<''5>拷贝,线性范围分别为10<''3>～10<''9>和10<''5>～10<''9>拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在的线性关系R<''2>分别为0.993和0.999,扩增效率E分别为111.073%和95.948%.结论 成功的构建了版纳微型猪近交系TNF-α基因质粒标准品和标准曲线,并用内参基因GAPDH进行校正,此方法可为探讨TNF-α基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础.     

ERAP1基因标准品质粒的构建

目的构建人ERAP1基因的重组质粒。方法以成人皮肤组织中总RNA为模板、Random6mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人ERAP1基因,并克隆到PUC18载体,转化人大肠杆菌DH5α,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。计算重组质粒原液复制数浓度并制备梯度浓度标准品,real-timePCR构建标准曲线。结果ERAPl目的片段制备成功,获得稳定的重组质粒,保证了目的片段的特异性和序列完整性,标准曲线参数良好,标准品阈值循环数（α）与其相应梯度稀释浓度呈良好线性关系,扩增效率高。结论成功地构建了人ERAPl基因的荧光定量PCR标准品质粒。     

抗人胸腺细胞单克隆抗体2G_2B_2和2G_2C_2的制备及特性鉴定

用杂交瘤技术制备２株单克隆抗体（单抗）２Ｇ２Ｂ２、２Ｇ２Ｃ２。经研究发现,它们主要与胸腺细胞、脐血及ＰＨＡ激活的外周血单个核细胞等反应;免疫组化显示其主要作用于皮质胸腺细胞;与造血系统中分化早期的瘤细胞、骨髓瘤细胞等反应阳性率较高。生物学特性鉴定结果提示,单抗均属免疫球蛋白ＩｇＧ１亚类,腹水效价达１：１２８０００,所识别抗原分子量为４５／４６ＫＤａ,无抗原调变作用。故２Ｇ２Ｂ２、２Ｇ２Ｃ２是类似ＯＫＴ１０的抗ＣＤ３８单抗,但竞争抑制结果表明三者分别作用于不同的抗原决定簇,即２Ｇ２Ｂ２、２Ｇ２Ｃ２是两个抗ＣＤ３８新单抗。     

2－EHA促癌性及慢性二步致癌实验

建立了Ｓｋｈ／ＨＲ－１裸鼠皮肤慢性二步致癌实验模型。实验鼠在一次涂抹发癌剂ＤＭＢＡ之后，连续１９周涂抹阳性促癌对照物（ＴＰＡ）及试验促癌物（２－ＥＨＡ），经过４０周实验观察，ＴＰＡ促癌作用得以复制；２－ＥＨＡ在１％，５％，１０％，２０％浓度范围内，表现明显的剂量－反应关系，各组动物平均患瘤数和患瘤率显著高于阴性对照组，在高剂量组，发生皮肤小瘤恶变为鳞状上皮癌。     

pD_2和pA_2的测定

本文采用大鼠肛尾肌分别介绍测定苯肾上腺素ｐＤ＿２和其拮抗剂哌唑嗪ｐＡ＿２的方法。同时讨论了ｐＤ＿２和ｐＡ＿２的意义和推导过程。     

2型糖尿病患者血浆TXA2和PGI2失衡及PLA2活性变化

目的：探讨2型糖尿病（DM）患者血栓素A2（TXA2）和前列环素（PGI2）失衡及PLA2活性变化。方法：以放免法测定血栓素B2和6－酮－前列腺素含量,以改良Zieve法测定血浆PLA2活性,同时观察空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS）、甘油三酯（TG）等的变化。结果：①2型DM患者存在TXA2和PGI2合成异常,且Ⅱ组（有微血管病变组）较I组（无微血管病变组）更为严重;②2型DM患者组血浆PLA2显著低于正常对照组,但I组与Ⅱ组之间无显著差异;③2型DM患者组TXB2与FBG、TG显著正相关,6－K－PGF1a与FINS显著负相关,TXB2与6－K－PGF1a均与血浆PLA2无显著相关性。结论：①TXA2和PGI2失衡在2型糖尿病及微血管病变的发生发展中起重要作用;②血浆分泌型PLA2活性变化与2型糖尿病密切相关,但在糖尿病患者TXA2和PGI2失衡及微血管病变中可能不起直接作用;③糖脂代谢紊乱以及高胰岛素血症在TXA2和PGI2失衡及DM微血管病变中起重要作用。     

评价房颤CHADS2评分及其衍生评分对冠心病及其严重程度的预测价值

目的：探讨房颤评分系统CHADS2(欧洲)评分及其衍生评分对冠心病及其严重程度的预测价值。方法纳入2013年1月1日-2013年12月1日就诊于本院心血管内科怀疑冠心病并行冠状动脉造影检查的连续病例429例,根据其造影结果分为对照组(n=51)及冠心病组(n=378)。根据患者的临床资料计算其CHADS2、CHA2DS2-VASc和CHA2DS2-VASc-HSF评分,根据其冠状动脉造影结果计算Gensini积分评价其病变严重程度,并对3种评分的冠心病预测能力进行评价。结果 CHADS2、CHA2DS2-VASc和CHA2DS2-VASc-HSF评分与病变支数(r=0.317,P＜0.01;r=0.332,P＜0.01;r=0.330,P＜0.01)及Gensini积分均有一定相关性(r=0.240,P＜0.01;r=0.274,P＜0.01;r=0.295,P＜0.01)。截断点分析显示, CHA2DS2-VASc-HSF评分≥3对冠心病的预测价值最高,其灵敏度、特异度、曲线下面积分别为0.860、0.804、0.832(95%CI：0.766~0.898)。结论 CHADS2及其衍生评分对冠心病有一定的预测价值,尤其是CHA2DS2-VASc-HSF评分≥3对冠心病有较高的预测价值。     

Ndrg2基因及NDRG2蛋白的生物信息学分析

目的：对ndrg2(n—myc downsream regulator gene 2)基因调控区和NDRG2蛋白序列进行生物信息学分析，从结构上预测其功能．方法：运用internet网络上的数据库及程序，对ndrg2基因的调控区和NDRG2蛋白的二级结构进行生物信息学分析．结果：ndrg 2基因调控区存在多种转录因子结合位点，功能主要涉及组织特异性表达调控，细胞生长发育相关基因和应激反应基因的表达调控等；NDRG2蛋白的结构属于α/β水解酶类折叠，其分类预测表明与细菌环氧化物水解酶的二级结构极为相似．结论：生物信息学分析提示NDRG2蛋白具有一定的酶活性，可能参与细胞抗氧化应激反应，内外源有毒物质的代谢，维持细胞内氧还电势平衡等．     

人神经胶质瘤组织中的铜锌镁的含量及铜锌比值

本文测定了16例人胶质瘤组织中的铜锌镁含量及铜锌比值,其中恶性肿瘤的铜含量为20.49±4.87μg/g干重,锌为176.97±44.18μg/g干重,镁为650.91±207.88μg/g干重,铜锌比值为0.123±0.04。与健康成人脑组织比较,铜含量及铜锌比值明显降低(P<0.01),镁值升高56.59％,但无统计学意义,锌在二者之间无明显差异。与健康成年组比较,良性胶质瘤三种元素含量都无统计学意义(P>0.05),而早产儿的铜含量有显著性差异(P<0.01)。     

食管鳞癌中MMP-2TIMP-2的表达及意义

目的：研究基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）在食管鳞癌中的表达及其相关性,并探讨其在食管鳞癌进展过程中的意义。方法：应用免疫组化法研究50例食管鳞癌组织和20例食管正常粘膜中MMP-2、TIMP-2的表达情况,分析其表达结果与患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤组织分化程度、浸润程度、淋巴结转移及TNM分期间的关系。结果：MMP-2、TIMP-2在食管鳞癌中的表达明显高于食管正常粘膜中的表达,两者比较有显著性差异（P〈0．01）。MMP-2、TIMP-2在食管鳞癌的表达与浸润深度、有无淋巴结转移、TNM分期有关（P〈0．05）,与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤分化程度无关（P〉0．05）。MMP-2和TIMP-2相关系数r=0．5l;P〈0．01,表明他们之间有明显相关性。结论：食管鳞癌组织中MMP-2、TIMP-2的高表达在食管鳞癌的发生发展过程中起到重要作用,同时MMP-2、TIMP-2与食管鳞癌浸润生长及远处播散有关。     

MMP-2和TIMP-2在人脑胶质瘤中的表达及其意义

目的 探讨基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和组织金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）在人脑胶质瘤组织中的表达及其与胶质瘤的侵袭发展、分级之间的关系。方法 采用免疫组化SP法对61例脑胶质瘤标本进行了MMP-2、TIMP-2表达情况的检测。结果 MMP-2在Ⅰ～Ⅱ级组和Ⅲ～Ⅳ级组表达率分别为43．7％和75．9％．TIMP-2在这两组中的表达率分别为28．1％和6．9％，胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级组和Ⅲ～Ⅳ级组之间两指标的差异均有统计学意义（P〈0．01），MMP-2与TIMP-2的表达呈显著负相关（P〈0．01）。结论 MMP-2及TIMP-2对胶质瘤恶性程度的评估有重要的意义。     

CDX2和MUC2在胃癌组织中的表达及意义

目的:通过观察CDX2和MUC2在胃癌组织中的表达,与胃癌的生物学特征进行比较,来探讨其表达的意义。方法:选取肠型胃癌30例,弥漫型胃癌20例作为研究对象,以正常胃黏膜15例作为对照,用免疫组织化学的方法检测CDX2和MUC2的表达情况。结果:CDX2和MUC2在正常胃黏膜组织中均无表达。CDX2在肠型胃癌中阳性表达率为63.3%(19/30),在弥漫型胃癌中阳性表达率为30.0%(6/20),两型胃癌中CDX2阳性表达率有显著性差异(P<0.05)。MUC2在肠型胃癌中阳性表达率为66.7%(20/30),在弥漫型胃癌中阳性表达率为35.0%(7/20),两型胃癌中MUC2阳性表达率有显著性差异(P<0.05)。CDX2和MUC2的表达与细胞分化程度有关(P<0.01),与有无淋巴结转移无关(P>0.05)。CDX2的表达和肿瘤浸润的深度有关(P<0.05),而MUC2的表达与肿瘤浸润的深度无关(P>0.05)。在两型胃癌中,CDX2的表达和MUC2的表达呈正相关(肠型rs=0.489,P<0.01;弥漫型rs=0.663,P<0.01)。结论:CDX2和MUC2的异常表达在胃癌,特别是肠型胃癌的发生中起着重要的作用。