泛素连接酶Cbl-b在黑素瘤组织和细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义

目的：探讨泛素连接酶Cbl?b在皮肤黑素瘤组织及黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义。方法收集69份黑素瘤、30份色素痣组织,采用免疫组化法检测Cbl?b蛋白表达水平。实时荧光定量PCR、免疫印迹法分别检测黑素瘤细胞系A375、M14、MV3及黑素细胞中Cbl?b mRNA及蛋白表达水平。结果69份皮肤黑素瘤标本中,52份（75.36%）表达Cbl?b;30份色素痣标本中,4份（13.33%）表达Cbl?b,两组Cbl?b蛋白表达水平差异有统计学意义（χ2=32.745,P<0.01）。黑素瘤组织中Cbl?b表达水平与肿瘤进展程度、Clark分级和Breslow厚度均呈正相关（rs分别为0.569、0.654、0.727,均P<0.01）。实时荧光定量PCR显示,A375、M14、MV3细胞Cbl?b mRNA表达差异有统计学意义（F=176.537,P<0.01）。免疫印迹法显示,A375细胞Cbl?b蛋白表达水平最高,黑素细胞最低。结论 Cbl?b蛋白在皮肤黑素瘤组织及其细胞株中均高表达。     

人黑素瘤细胞株IGFBP7基因启动子区CpG岛异常甲基化的研究

目的 探讨人黑素瘤细胞株和原代黑素细胞IGFBP7启动子区CpG岛甲基化状态与IGFBP7表达的关系。 方法 亚硫酸氢钠修饰后测序法检测4株人黑素瘤细胞和原代黑素细胞中IGFBP7基因启动子区CpG岛DNA甲基化状态。 结果 IGFBP7表达阴性的3个细胞株（A375、M14、SK-MEL-1）和表达阳性的2个细胞株（MV3及原代黑素细胞）的甲基化模式存在差异,聚类分析各自聚为一类。结论 IGFBP7基因启动子区CpG岛甲基化状态和基因表达有一定相关性。     

HINT1对人黑素瘤细胞A375增殖和凋亡的影响

目的 探讨HINTl基因对人黑素瘤细胞A375增殖、凋亡的影响及其作用机制.方法 应用构建的peDNA.3.1/mye-His(-)A-HINTl真核表达载体,建立稳定转染且能高表达HINTI的A375细胞模型.用M1rr法检测细胞增殖活性变化,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率,TUNEL法检测细胞凋亡.分光光度法检测Caspase 3,Caspase 8及Caspase 9的相对活性.Western印迹法检测bcl-2、bax、细胞色素C及p53的表达.结果 与空载体-A375及未转染A375细胞相比,HINT1-A375细胞生长速度明显减慢(P<0.05);Gl期细胞增多(73.17%±3.99%,F=25.65,P<0.05),S期细胞减少(16.75%±1.62%.F=75.48,P<0.01),细胞出现明显的晚期凋亡(23.57%±9.58%,F=11.71,P<0.01). TUNEL法显示凋亡阳性细胞百分比(12%±1%)显著增高(F=358.02,P<0.01);Caspase 9(0.45±0.03,F=135.62,P<0.01)和Caspase 3表达(0.46±0.04,F=90.28,P<0.01)升高.凋亡相关蛋白bax、细胞色素C及p53表达增加,bel-2表达降低.结论 高表达H1NT1可抑制A375细胞的增殖,促进其凋亡,细胞周期出现G_1期阻滞,提示HINT1可能是人黑素瘤的抑癌基因.     

NHERF1及β联蛋白在黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义

【摘要】 目的 探讨钠氢交换子调节因子-1（NHERF1）及β联蛋白在黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义。方法 使用免疫细胞化学法、实时荧光定量-PCR法、免疫印迹法对黑素瘤细胞系A375、M14、MV3及黑素细胞中NHERF1及β联蛋白的表达情况进行观察。使用MTT法对黑素瘤细胞系A375、M14、MV3及黑素细胞的增殖情况进行检测。结果 NHERF1及β联蛋白在黑素细胞中同时表现为细胞膜阳性表达,而在黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中均出现膜表达的缺失,同时呈现不同程度的胞质和（或）胞核阳性表达。在3株黑素瘤细胞系中,MV3细胞中的NHERF1免疫细胞化学染色仅呈少部分胞质弱阳性表达,实时荧光定量PCR检测NHERF1的mRNA表达水平最低,免疫印迹法中未见NHERF1蛋白表达条带,而其在MTT法中检测到的增殖速度最快,明显高于另外两株细胞。A375细胞中的NHERF1免疫细胞化学染色呈胞质及胞核的强阳性表达,实时荧光定量PCR检测NHERF1的mRNA表达水平最高,免疫印迹法中可见NHERF1蛋白最强阳性表达,而其增殖速度却慢于MV3细胞。β联蛋白在MV3细胞中免疫细胞化学染色呈细胞质及细胞核的强阳性表达,实时荧光定量PCR检测的mRNA表达水平最高,免疫印迹法检测到蛋白最强阳性表达;而A375细胞及M14细胞中,β联蛋白在免疫细胞化学染色呈相对弱的细胞质阳性表达,实时荧光定量PCR检测的mRNA表达水平明显较低;免疫印迹法中的蛋白表达较MV3中的表达低。结论 黑素瘤细胞胞质中NHERF1表达量可能与细胞的增殖速度相关,NHERF1在黑素瘤细胞中表达程度越低细胞增殖越快。黑素瘤细胞中的NHERF1与β联蛋白存在着差异性表达。 【关键词】 黑色素瘤; 钠氢交换子调节因子-1; β连环蛋白     

NHERF1及β联蛋白在黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义北大核心CSCD

目的探讨钠氢交换子调节因子-1（NHERF1）及B联蛋白在黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中的表达及意义。方法使用免疫细胞化学法、实时荧光定量-PCR法、免疫印迹法对黑素瘤细胞系A375、M14、MV3及黑素细胞中NHERF1及13联蛋白的表达情况进行观察。使用MTr法对黑素瘤细胞系A375、M14、MV3及黑素细胞的增殖情况进行检测。结果NHERF1及β联蛋白在黑素细胞中同时表现为细胞膜阳性表达,而在黑素瘤细胞系A375、M14、MV3中均出现膜表达的缺失,同时呈现不同程度的胞质和（或）胞核阳性表达。在3株黑素瘤细胞系中,MV3细胞中的NHERF1免疫细胞化学染色仅呈少部分胞质弱阳性表达,实时荧光定量PCR检测NHERF1的mRNA表达水平最低,免疫印迹法中未见NHERF1蛋白表达条带,而其在MTT法中检钡4到的增殖速度最快,明显高于另外两株细胞。A375细胞中的NHERF1免疫细胞化学染色呈胞质及胞核的强阳性表达,实时荧光定量PCR检测NHERF1的mRNA表达水平最高,免疫印迹法中可见NHERF1蛋白最强阳性表达,而其增殖速度却慢于MV3细胞。β联蛋白在MV3细胞中免疫细胞化学染色呈细胞质及细胞核的强阳性表达,实时荧光定量PCR检测的mRNA表达水平最高,免疫印迹法检测到蛋白最强阳性表达;而A375细胞及M14细胞中,β联蛋白在免疫细胞化学染色呈相对弱的细胞质阳性表达,实时荧光定量PCR检测的mRNA表达水平明显较低;免疫印迹法中的蛋白表达较MV3中的表达低。结论黑素瘤细胞胞质中NHERF1表达量可能与细胞的增殖速度相关,NHERF1在黑素瘤细胞中表达程度越低细胞增殖越快。黑素瘤细胞中的NHERF1与β联蛋白存在着差异性表达。     

白藜芦醇对黑素瘤细胞株A375增殖及骨桥蛋白表达的影响

目的:确定白藜芦醇(Resveratrol,Res)对黑素瘤细胞株A375细胞增殖及骨桥蛋白表达的影响.方法:用不同浓度的白藜芦醇处理A375细胞,MTT比色法分别检测白藜芦醇对细胞增殖的抑制作用,RT- PCR和蛋白印迹方法检测骨桥蛋白的mRNA和蛋白的表达.结果: 白藜芦醇对A375细胞增殖的抑制呈时间和浓度依赖性;白藜芦醇能显著减少内皮素作用后黑素瘤细胞株A375骨桥蛋白中mRNA和蛋白的表达(P＜0.05).结论: 白藜芦醇作为内皮素受体拮抗剂有可能通过抑制内皮素受体(ETR-B)下调骨桥蛋白的表达,进而抑制A375细胞的增殖.     

CXCR7在常见皮肤恶性肿瘤及其细胞株中的表达及意义

目的 探讨趋化因子受体CXCR7在皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌、侵袭性皮肤黑素瘤及其细胞株中的表达及其意义。方法 收集30例皮肤鳞状细胞癌、25例基底细胞癌、30例皮肤黑素瘤的癌组织,采用免疫组织化学方法,检测CXCR7蛋白表达水平。采用RT-PCR、细胞免疫组化方法检测CXCR7在A375、M14、A431、HaCaT细胞株中mRNA及蛋白水平。结果 CXCR7在侵袭性皮肤黑素瘤中表达明显,高表达率为80%（24/30）,皮肤鳞状细胞癌及基底细胞癌分别为26.67%（8/30）、8%（2/25）;皮肤黑素瘤CXCR7高表达率与鳞状细胞癌、基底细胞癌比较,差异均有统计学意义（χ2值分别为17.16和28.36,P值均 < 0.05）。CXCR7 mRNA在A375、M14、A431细胞株中均可检出,其中A375表达最强,而HaCaT细胞不表达;细胞免疫组化显示,仅在A375细胞见棕黄色颗粒着色。结论 皮肤黑素瘤及其细胞株A375高表达CXCR7,其可能参与了其恶性侵袭与转移。     

皮肤恶性黑素瘤细胞株A375细胞RUNX3基因甲基化的研究

目的 研究皮肤恶性黑素瘤细胞株A375细胞中RUNX3基因启动子区CpG岛甲基化与其基因表达的关系,探讨RUNX3基因甲基化在皮肤恶性黑素瘤发病机制中的作用。方法 采用甲基化特异性PCR（MSP）检测A375细胞RUNX3基因启动子区CpG岛的甲基化状态,Western印迹检测A375细胞RUNX3蛋白表达水平。比较经不同浓度去甲基化药物５-杂氮胞苷（0、1、5、10、20 μmol/L）处理A375细胞后, RUNX3基因启动子区CpG岛的甲基化状态及蛋白表达水平的差异。结果 在A375中,处理前其RUNX3基因启动子区呈高甲基化状态,RUNX3蛋白表达缺失。经不同浓度５－杂氮胞苷处理细胞后,高甲基化的RUNX3启动子区发生不同程度去甲基化,表达缺失的 RUNX3蛋白不同程度恢复表达。结论 A375细胞株中RUNX3蛋白表达缺失可能与其启动子区的高甲基化有关; ５-杂氮胞苷能使A375细胞中的RUNX3基因发生去甲基化,从而重新激活因高甲基化而失活的基因,使RUNX3蛋白得以重新表达。     

甲磺酸伊马替尼对人黑素瘤细胞c-KIT表达的影响

目的:探讨甲磺酸伊马替尼对体外培养的人黑素瘤细胞系c-KIT表达及增殖的影响.方法:采用免疫组化和Western 印迹法检测人黑素瘤M14细胞和鼠黑索瘤B16F10细胞中c-KIT的表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法分析3种浓度(5、10、20μmol/L)甲磺酸伊马替尼对M14细胞和B16F10细胞的生长抑制作用,Western印迹法观察M14细胞c-KIT和p-c-KIT蛋白的表达情况.结果:M14细胞存在c-KIT表达,B16F10细胞未见表达.3种浓度甲磺酸伊马替尼均能抑制M14细胞的增殖,导致其形态改变:10、20μmol/L甲磺酸伊马替尼均能抑制B16F10细胞的增生,5μmol/L甲磺酸伊马替尼对其无影响.不同浓度甲磺酸伊马替尼均能抑制M14细胞p-c-KIT蛋白的表达,但对c-KIT蛋白无影响.结论:甲磺酸伊马替尼能抑制M14细胞的增殖,机制可能与抑制c-KIT的磷酸化有关.     

芳姜黄酮衍生物对A375人黑素瘤细胞增殖及凋亡作用的机制研究

目的：研究一种芳姜黄酮衍生物（ATD）对人皮肤黑色素瘤A375细胞增殖及凋亡的影响。方法不同浓度（5、10、20、40、80μmol/L）ATD、长春新碱及芳姜黄酮体外作用A375及人皮肤成纤维细胞（HSF）48 h。CCK?8法检测细胞增殖抑制率;吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）染色,倒置显微镜观察细胞凋亡形态;DNA片段化检测细胞凋亡;比色法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase?3）活性;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期。结果ATD、长春新碱及芳姜黄酮对A375细胞有抑制增殖作用,且呈剂量依赖性（ATD：R2=0.99,F=340.96;长春新碱：R2=0.99,F=349.19;芳姜黄酮：R2=0.89,F=25.41,均P<0.05）,三者IC50分别为（15.96±0.02）、（77.00±0.04）及（356.95±0.01）μmol/L。当药物浓度为5μmol/L及10μmol/L时,ATD对HSF增殖抑制率分别为（8±0.06）%和（25±0.02）%,长春新碱为（33±0.04）%和（29±0.08）%,芳姜黄酮为（49±0.09）%和（34±0.07）%;ATD对A375细胞抑制率分别为（26±0.06）%和（39±0.02）%,长春新碱为（8±0.04）%和（17±0.08）%,芳姜黄酮为（6±0.09）%和（10±0.07）%,与二甲基亚砜相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）,且ATD对A375细胞增殖抑制活性强于长春新碱及芳姜黄酮（P＜0.05）,但对HSF细胞毒性却明显低于长春新碱及芳姜黄酮（P＜0.05）。ATD、长春新碱及芳姜黄酮均可诱导A375细胞凋亡,caspase?3活性随3种药物浓度增加而增强,且药效为ATD>长春新碱>芳姜黄酮。流式细胞仪检测证实,3种药物都能诱导细胞发生不同程度凋亡,同芳姜黄酮及长春新碱相比,ATD能显著诱导细胞凋亡,且以晚期凋亡为主。随药物浓度增加,ATD组G1期A375细胞逐渐增多,G2期及S期细胞数明显减少。结论 ATD对A375细胞有抑制增殖及促凋亡作用,该作用明显强于芳姜黄酮及长春新碱,其机制可能是激活caspase?3,使细胞周期阻滞在G1期,进而抑制肿瘤细胞分化与增殖。     

miR-203调控锌指蛋白281表达对黑素瘤细胞增殖、迁移的影响

【摘要】 目的 初步探究微小RNA-203（miR-203）调控锌指蛋白281（ZNF281）对黑素瘤细胞增殖、迁移的影响。方法 常规培养人血管内皮细胞系ECV304、人黑素瘤细胞系A375、M14、SK-MEL-28、SK-MEL-2,实时荧光定量PCR检测各细胞系中miR-203表达情况,Western免疫印迹法检测各细胞系中ZNF281蛋白水平。A375、M14细胞分别分为5组：对照组（细胞正常培养）、miR-203模拟物对照组（加入miR-203模拟物阴性对照）、miR-203抑制剂对照组（加入miR-203抑制剂阴性对照）、miR-203模拟物组（加入miR-203模拟物）、miR-203抑制剂组（加入miR-203抑制剂）。实时荧光定量PCR检测各组A375、M14细胞中miR-203的表达,CCK8法检测各组A375、M14细胞增殖活性,Transwell实验检测各组A375、M14细胞迁移数量,Western免疫印迹法检测各组A375、M14细胞中ZNF281蛋白的表达。双荧光素酶验证miR-203与ZNF281的靶向关系。多组比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q法。结果 与血管内皮细胞系ECV304相比,黑素瘤细胞系A375、M14、SK-MEL-28、SK-MEL-2中miR-203表达水平较低（均P < 0.05）,ZNF281蛋白水平较高（均P < 0.05）。与对照组、miR-203模拟物对照组、miR-203抑制剂对照组相比,miR-203模拟物组A375、M14细胞中miR-203水平均显著升高（F = 487.632、68.454,均P < 0.05）,细胞迁移数量均显著降低（均P < 0.05）,ZNF281蛋白表达均显著降低（均P < 0.05）;miR-203抑制剂组A375、M14细胞中miR-203表达均显著降低（均P < 0.05）,细胞迁移数量均显著增加（均P < 0.05）,A375细胞中ZNF281蛋白表达显著升高（均P < 0.05）,36、48、60、72 h A375细胞增殖活性显著升高（均P < 0.05）,24、36、48、60、72 h M14细胞增殖活性均显著升高（均P < 0.05）。miR-203与ZNF281之间存在靶位点。结论 上调miR-203表达可抑制黑素瘤细胞增殖、迁移,下调miR-203表达可促进黑素瘤细胞增殖、迁移,可能通过调控ZNF281的表达实现。     

抗原处理相关转运体和MHC-Ⅰ类分子在黑素瘤细胞株的表达

目的 检测抗原处理相关转运体（TAP）及主要组织相容性复合体（MHC）-Ⅰ类分子在恶性黑素瘤细胞系中的表达。方法 采用Western印迹法、RT-PCR和流式细胞仪分别检测TAP蛋白、mRNA和MHC-Ⅰ类分子在3株恶性黑素瘤细胞系（A375、A875、KZ28）中的表达,并与正常黑素细胞做对照。结果 与正常黑素细胞相比,TAP mRNA表达在A375、A875、KZ28细胞系中均显著降低,t值分别为5.89,4.45和4.57,P值均 < 0.01;TAP 蛋白的表达均明显降低,t值分别为5.46,4.32和4.67,P值均 < 0.01。在A375细胞中TAP mRNA和蛋白下降最显著。MHC-Ⅰ类分子也具有相同的趋势,t值分别为6.16,5.22和5.61,P值均 < 0.01。结论 TAP蛋白及其mRNA在A375、A875、KZ28细胞系中表达显著降低,可能为恶性黑素瘤细胞逃逸机体免疫监视的一条途径。     

雷公藤内酯醇抑制A375细胞增殖和迁移及CCR7表达的体外实验

目的观察雷公藤内酯醇在体外抑制人黑素瘤细胞A375增殖和迁移的能力及对细胞表面趋化因子受体CCR7表达的影响情况,初步分析其作用机制。方法用CCK-8比色试剂盒检测雷公藤内酯醇对A375细胞增殖的作用,Transwell微孔隔离小室迁移实验检测雷公藤内酯醇对A375细胞体外迁移能力的影响,Western blot法检测雷公藤内酯醇对A375细胞CCR7蛋白表达的影响。结果雷公藤内酯醇以剂量依赖方式抑制A375细胞的增殖,24h的IC50值为0.20μg/mL;雷公藤内酯醇能显著地抑制A375细胞的体外迁移能力(P0.01),侵袭抑制率约为82.84%;经不同浓度雷公藤内酯醇(0μg/mL,0.2μg/mL和0.4μg/mL)处理后,A375细胞中CCR7蛋白表达呈明显下降趋势(P0.05)。结论雷公藤内酯醇具有抗A375细胞增殖和体外迁移能力的作用,其机制可能与下调其表面趋化因子受体CCR7的表达相关,并且该作用呈一定的浓度依赖性。