外源hTERT基因对人肝细胞增殖及CYP450 19A1表达的影响

目的探讨外源hTERT基因对体外培养的人肝细胞增殖及细胞色素P450 19A1（CYP450 19A1）表达的影响。方法将携带有hTERT片段的重组逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT转染至体外培养的人肝细胞;四甲基偶氮唑蓝比色（MTT）法观察hTERT表达对细胞增殖的影响;通过采用Western blot法检测CYP450 19A1的表达情况。结果成功将带有hTERT逆转录病毒载体pLNCX2-hTERT转染至人肝细胞,转染后的肝细胞组较未转染组增殖明显,转染前后肝细胞在55kU处均可见有CYP450 19A1蛋白表达。结论外源hTERT基因可促进肝细胞增殖;转染组与未转染组肝细胞均可表达CYP450 19A1。     

siRNA表达载体对hTERT基因的效应评价

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰表达载体,探讨其对人乳腺癌MCF-7细胞生长及其hTERT基因表达的影响。方法:设计针对hTERT基因的干扰靶序列并构建重组siRNA表达载体pGenesil-hTERT。酶切测序鉴定后,脂质体转染MCF-7细胞,应用RT-PCR和Weston Blot法检测hTERT基因的表达情况,应用流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果:酶切电泳测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功,且转染MCF-7细胞后,hTERT mRNA和蛋白质表达水平显著抑制,细胞凋亡率较对照组明显升高(P<0.01)。结论:以DNA质粒为载体的siRNA能有效抑制hTERT基因的表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞生长、促进细胞凋亡。     

负载miR-138复制缺陷型腺病毒对hTERT表达的影响

目的探讨以复制缺陷型腺病毒为载体,上调人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138表达丰度后,能否有效抑制靶基因hTERT的表达。方法 将负载hTERT调控相关miR-138的复制缺陷型腺病毒以200∶1的感染复数(MOI),感染人胃癌BGC-823细胞;采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测BGC-823细胞内miR-138和hTERT mRNA的表达丰度;Western Blot检测hTERT蛋白表达。结果 与阴性对照腺病毒相比,负载miR-138的腺病毒感染BGC-823细胞后,可显著提高miR-138表达丰度(P<0.05);而未感染腺病毒的空白对照组与阴性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。与感染阴性对照腺病毒的BGC-823细胞相比,感染负载人miR-138腺病毒(Ad-miR138)的BGC-823细胞内hTERT蛋白表达有所下调。结论 以复制缺陷型腺病毒为载体,可有效上调hTERT调控相关miR-138的表达丰度,进而可有效抑制miR-138靶基因hTERT的表达水平。     

氧化苦参碱对大鼠肝星状细胞增殖的影响

研究氧化苦参碱地大鼠肝星状细胞增殖的影响,探讨其抗肝纤维化的机制。方法用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流,Ｎｙｃｏｄｅｎｚ密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞,并以氮蓝四唑试验比色法观察氧化苦参碱对肝星状细胞增殖效应。     

RNA干扰survivin基因对人肝癌HepG2细胞增殖影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响.方法 构建针对人肝癌HepG2细胞 survivin基因3个不同靶序列的 shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-323/387/52,用Lipofectamine 2000脂质体介导转染法转染质粒, 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测survivin 基因mRNA表达水平.选择对survivin基因表达抑制作用最强的shRNA载体转染HepG2细胞后, 免疫细胞化学法(ICC)检测HepG2细胞survivin蛋白的表达情况,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的增殖情况.结果 与对照组比较,构建的3个shRNA质粒中pshRNA-survivin-387转染组survivin mRNA水平下调,差异有显著性(F=18.64,q=4.293～4.925,P<0.05),而pshRNA-survivin-323/52质粒对survivin的表达及mRNA水平的影响差异无显著性(q=0.631～0.126,P>0.05).转染pshRNA-survivin-387质粒的HepG2细胞survivin蛋白表达较对照组明显下调(F=68.39,q=13.71、14.37,P<0.01),其增殖能力较对照组显著下降(F=20.06～47.65,q=11.186、 12.601,P<0.01).结论 构建的针对人survivin基因387位靶序列的shRNA表达载体pshRNA-survivin-387可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞增殖.     

2-乙酰氨基芴对大鼠肝卵圆细胞增殖模型的影响

目的 在建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型的基础上，进一步研究2—乙酰氨基芴(AAF)对大鼠肝卵圆细胞增殖的影响。方法 按本室建立和改进的方案建立大鼠肝卵圆细胞增殖模型，AAF剂量分别按10、20及25mg/kg给予，同时设单纯切肝对照组、假手术对照组及生理盐水对照组，重点观察大鼠肝组织结构变化及不同剂量下肝卵圆细胞增殖情况。结果 3个对照组大鼠肝组织内均未见到肝卵圆细胞，而3个实验组均见肝卵圆细胞增生；与10mg/kg剂量组比较，20mg/kg及25mg/kg两个剂量组大鼠肝组织内的肝卵圆细胞增殖更加明显，但25mg/kg剂量组大鼠死亡率较高，存活大鼠健康状况差。结论 AAF可诱导大鼠肝卵圆细胞增殖，剂量以20mg/kg较为理想。     

大鼠肝抑素纯化及其对再生肝细胞和肝癌细胞增殖的影响

制备大鼠肝抑素纯品，研究它对再生肝细胞和肝癌细胞体外增殖的影响。用ＤＥＡＥ－Ｃｅｌｌｕｏｓｅ离子交换层析法提取ＨＣ纯品，用液法检测ＨＣ样品的生物活性，结果：提取的ＨＣ纯品的ＳＤＳ电泳纯度达８９．５％，Ｍｒ１３．５×１０＾３；该ＨＣ纯品对大鼠再生肝细胞和人肝癌细胞体外增殖有明显抑制作用。     

促肝细胞生长素对大鼠肝星状细胞增殖及α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性的影响

目的:探讨促肝细胞生长素(pHGF)对大鼠肝星状细胞HSC-T_6增殖及α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性的影响。方法:(1)采用MTT法分析pHGF对HSC-T_6细胞增殖的影响。(2)构建含人α1(Ⅰ)胶原基因5′侧翼序列(启动子)与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的重组体 pCOLH1.5,以脂质体法转染HSC-T_6细胞,ELISA法测定不同浓度pHGF作用24 h后,转染了重组体质粒的HSC-T_6细胞的CAT表达量。结果:(1)不同浓度pHGF对HSC-T_6细胞增殖均有明显的抑制作用,与对照组比较有明显差异(P<0.01)。(2)pHGF在200 μg/ml时对转染重组体质粒pCOLH1.5的HSC-T_6细胞的CAT活性具有明显的抑制作用,与对照组相比差异显著(P<0.05);增加pHGF浓度至400μg/ml时,对CAT活性抑制更为明显,与对照组相比差异非常显著(P<0.01)。结论:pHGF对HSC-T_6细胞增殖具有明显的抑制作用;对α1(Ⅰ)胶原基因启动子活性具有负性调控作用。     

胃选择性迷走神经切断对大鼠肝再生的影响

探讨胃选择性迷走神经切断对大鼠再生肝细胞体系，数量和ＤＮＡ含量的影响。分别测定大鼠胃选择性迷走神经切断加肝叶大部分切除及肝叶大部分切除术后７ｄ再生肝ＤＮＡ含量，肝细胞数和体积。用多功能显微图像测量仪测定切片中肝细胞和肝细胞核面积及肝细胞核直径。按体视学方法测算整个肝脏的肝细胞数。用细胞分光光度技术测定切片中单个肝细胞和肝细胞核面积均较单纯肝叶切除组增加（Ｐ〈０．０５）。提示胃选择性迷走神经切断对大     

大鼠肝细胞的分离及BRL细胞培养上清对原代肝细胞增殖的影响

目的 :研究大鼠肝细胞分离的方法及正常大鼠肝细胞来源的BRL细胞培养上清对原代大鼠肝细胞贴壁和增殖的影响。方法 :采用体外胶原酶 2步灌注法分离大鼠肝细胞 ,台盼兰染色法计算细胞数及细胞活率。以四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法检测不同浓度的BRL细胞培养上清及含体积分数 15 %胎牛血清的普通培养液对肝细胞贴壁和增殖的影响。结果 :平均每只大鼠可获 2× 10 8个肝细胞 ,平均活力 94 .3%。用普通培养液培养肝细胞 ,肝细胞贴壁率低 ;BRL细胞培养上清能明显促进肝细胞的贴壁和生长 ,且有量效关系 (P <0 .0 5 )。结论 :用本法分离的大鼠肝细胞有较高的获取率和活力 ,BRL细胞培养上清能促进正常大鼠肝细胞的贴壁及增殖     

转导人端粒酶逆转录酶基因致人成骨细胞永生化的研究

目的建立永生化的人成骨细胞系供骨科临床和基础研究使用。方法将人骨髓基质干细胞定向诱导分化为成骨细胞,以逆转录病毒为载体,导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)全长cDNA,经筛选得到阳性克隆,体外连续传代,检测hTERT基因的整合情况及其表达,并对不同代次细胞的成骨特性进行了检测。结果成功地将hTERT基因转入人成骨细胞,得到的转化细胞端粒酶表达阳性,增殖旺盛,至今已传至62代,对第25、第55代转化细胞分别进行碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨桥素的检测,证明此永生化细胞保持了良好的成骨特性。结论转导外源性的hTERT基因可以导致人成骨细胞永生化且可保持其正常的成骨特性。     

大鼠肝细胞无血清原代培养体系的建立

目的:建立大鼠肝细胞无血清原代培养体系。方法:以Wistar大鼠做肝细胞供者,采用胶原酶肝脏原位灌流消化法分离肝细胞,分别通过有血清和无血清方法进行原代培养;以台盼蓝染色法测细胞活力,倒置显微镜观察肝细胞形态变化,流式细胞仪测定原代培养大鼠肝细胞增殖指数。结果:在大鼠肝脏有血清原代培养体系和无血清原代培养体系两种方法中,大鼠肝细胞存活率均>90%,生长良好,经24 h和48 h培养后,经检测大鼠肝细胞增殖指数无统计学差异(P>0.05)。结论:成功建立大鼠肝细胞无血清原代培养方法,为今后利用此方法进行细胞信号传导等相关研究提供有力的实验手段。     

百草枯对大鼠正常肝细胞系增殖和凋亡的影响

目的观察不同浓度百草枯对大鼠正常肝细胞系(BRL-3A)增殖和凋亡的影响。方法将传代培养的BRL-3A细胞分为药品空白组及低、中、高浓度组。向高、中、低浓度组和药品空白组中加入百草枯,使其终浓度依次为4.80、1.20、0.15、0.00μmol.L-1。24 h后噻唑蓝法检测细胞增殖活性;Western blot检测B细胞白血病家族蛋白Bcl-2、Bax和胱天蛋白酶caspase-9、caspase-3的表达变化。结果细胞增殖活性高浓度组低于药品空白组,差异有统计学意义(P<0.05);中、低浓度组与药品空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。细胞计数高浓度组低于药品空白组,差异有统计学意义(P<0.05);中、低浓度组与药品空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。随着染毒剂量的增加,促凋亡蛋白Bax、caspase-9、caspase-3表达增加,而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达量则减少。结论百草枯能抑制BRL-3A细胞增殖,这种作用可能是通过调节凋亡相关蛋白表达实现的,但浓度较低时对细胞增殖反而有促进效应。     

年龄对大鼠肝细胞胰岛素受体的影响

目的　研究年龄对大鼠肝细胞胰岛素受体的影响 ,探讨衰老肝细胞胰岛素受体改变的意义和胰岛素抵抗的机理。方法　 2 0只大鼠分为青年组和老年组 ,用放免法和放射性配体-配体测定法分别测定其血浆胰岛素和肝细胞胰岛素受体。结果　老年大鼠血浆胰岛素浓度较青年大鼠显著升高 (P <0 .0 5 ) ,肝细胞高亲和力受体数目较青年大鼠明显下降 (P <0 .0 5 ) ,两组间低亲和力受体数目和亲和力无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论　大鼠肝细胞高亲和力胰岛素受体数目在老年期下降 ,老年大鼠存在有胰岛素抵抗。     

改构型酸性成纤维细胞生长因子对体外培养肝细胞增殖活性的影响

目的 探讨改构型酸性成纤维细胞生长因子(MaFGF)对体外培养大鼠肝细胞增殖的影响.方法 采用“0.25％胰酶+0.1％胶原酶”消化法分离培养大鼠肝细胞并传代纯化扩增,取第3代细胞鉴定后实验:①形态学法观察在不同浓度MaFGF组中细胞的形态变化;②将实验随机分为对照组和MaFGF组,MaFGF组加入一系列浓度的MaF-GF,MTT法测定不同浓度MaFGF组作用于肝细胞24、48、72h的促增殖活性;③MTT法筛选出最适的MaFGF浓度,用此浓度和不加生长因子2种方式培养细胞,并绘制细胞生长曲线.结果 ①MaFGF对体外培养的肝细胞有一定的促增殖作用,但是与浓度不成正比;且实验表明24 h的增殖率较其它时间点显著增高(P＜0.05);比较对照组和各组(4.68×10-3 ～7.80×10-3 mg/L MaFGF组)均差异有统计学意义(P＜0.05),但各组间对肝细胞的促增殖作用的差异无统计学意义;②最适浓度(6.24×10-3 mg/L) MaFGF的第4天细胞数量较对照组明显增加(P＜0.05);MaFGF组的第10天细胞数(12.4×104)是对照组(6×104)的2.1倍(P＜0.05).结论 在适宜浓度和时间内,MaFGF对肝细胞具有一定的促增殖作用且不具有浓度依赖性.     

丙戊酸钠对培养大鼠肝细胞的毒性作用

目的:研究丙戊酸钠(VPA)对肝细胞的不良反应 是否与剂量(血药浓度)、年龄及合并用药有关.方法:采用 肝细胞原代培养技术,自动生化分析仪测定培养液中ALT AST,LDH的活性.结果:当VPA浓度>50mg/L,成鼠及幼 鼠肝细胞培养液中肝酶活性显著升高,并随着VPA浓度升 高,肝酶活性进一步升高.与苯巴比妥钠(PB)、卡马西平 (CBZ)合用与单独用药相比,肝酶活性没有明显差异.结论 VPA对肝细胞的不良反应与剂量呈正相关;成鼠与幼鼠肝细 胞对VPA的反应性没有明显差异;合并用药没有加重肝细胞 的损伤.     

人端粒酶逆转录酶诱导的猪肝细胞初步鉴定

目的观察应用四步灌流法分离后原代猪肝细胞的数量和活力,初步鉴定人端粒酶逆转录酶(hTERT)诱导的猪肝细胞的生物学特性。方法四步灌流法分离12只猪肝脏组织中的猪肝细胞,采用锥虫蓝拒染法测定其肝实质细胞数量和活力;将含hTERT真核表达的载体转染到原代猪肝细胞,经G418硫酸盐筛选,获得耐药性的猪肝细胞克隆并传代3代。观察原代猪肝细胞和hTERT诱导后的猪肝细胞的形态,检测两种猪肝细胞不同时期培养上清液中白蛋白、尿素氮的浓度。结果每只肝脏的肝细胞产量约为2.0×1010个,具有活力的肝细胞所占百分比为(95.5±3.2)%。原代猪肝细胞和hTERT诱导的猪肝细胞培养上清中分泌白蛋白和尿素氮在前3天无统计学差异(P>0.05),第4、5天差异有统计学意义(P<0.05)。结论四步灌流法分离获取的猪肝细胞产量高、功能活性好。hTERT诱导的猪肝细胞具有正常肝细胞的基本功能,可作为生物人工肝及细胞移植等的理想的细胞源。