体外诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化的研究

目的:体外分离和定向诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化.方法:无菌条件下从正常C57BL/6J胎鼠肝中分离出间充质干细胞,体外培养传3代后用高浓度葡萄糖培养基以及碱性纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和尼克酰胺诱导分化,观察胎肝间充质干细胞诱导前后形态变化;用RT-PCR检测细胞诱导前后胰十二指肠同源异型基因盒1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)、胰岛素原1(proinsulin-1,INS-1)、葡萄糖转运子2(glucose transporter-2,GLUT-2)表达情况;胰岛素免疫细胞化学染色鉴定诱导后细胞胰岛素的表达;在形成胰岛样细胞簇后,用双硫腙做胰岛B细胞特异性染色.结果:RT-PCR显示诱导5 d后PDX-1、INS-1、GLUT-2均有表达,而诱导前的细胞则没有检测到表达;胰岛素免疫细胞化学表明细胞簇内的细胞胰岛素染色强阳性;细胞簇双硫腙染色阳性(每个T-25培养瓶有80～120个).结论:从胎肝中分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛B样细胞.     

Notch signaling: a novel regulating differentiation mechanism of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into insulin-producing cells in vitro

Background Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells （UCB-MSCs） could be induced to differentiate into insulin producing cells （IPCs） in vitro, which have good application potential in the cell replacement treatment of type-1 diabetes. However, the mechanisms regulating this differentiation have remained largely unknown. Notch signaling is critical in cell differentiation. This study investigated whether Notch signaling could regulate the IPCs differentiation of human UCB-MSCs. Methods Using an interfering Notch signaling protocol in vitro, we studied the role of Notch signaling in differentiation of human UCB-MSCs into IPCs. In a control group the induction took place without interfering Notch signaling. Results Human UCB-MSCs expressed the genes of Notch receptors （Notch 1 and Notch 2） and ligands （Jagged 1 and Deltalike 1）. Human UCB-MSCs with over-expressing Notch signaling in differentiation resulted in the down-regulation of insulin gene level, proinsulin protein expression, and insulin-positive cells percentage compared with the control group. These results showed that over-expressing Notch signaling inhibited IPCs differentiation. Conversely, when Notch signaling was attenuated by receptor inhibitor, the induced cells increased on average by 3.06-fold （n=-4, P 〈0.001） in insulin gene level, 2.60-fold （n=-3, P 〈0.02） in proinsulin protein expression, and 1.62-fold （n=-6, P 〈0.001） in the rate of IPCs compared with the control group. Notch signaling inhibition significantly promoted IPCs differentiation with about 40% of human UCB-MSCs that converted to IPCs, but these IPCs were not responsive to glucose challenge very well both in vitro and in vivo. Hence, further research has to be carried out in the future. Conclusions Notch signaling may be an important mechanism regulating IPCs differentiation of human LICB-MSCs in vitro and Notch signaling inhibition may be an efficient way to increase the number of IPCs, which may resolve the shortage of islet of cell replacement treatment of type-1 diabetes.     

人类年轻恒牙牙髓干细胞体外多向分化的能力

目的:从人类的年轻恒牙中分离、培养牙髓间充质细胞,并探讨其基本的干细胞生物学特性及体外的多向分化能力.方法:对人类的正畸减数年轻恒前磨牙中分离培养的牙髓细胞进行相差显微镜和透射电镜观察,利用流式细胞仪分析牙髓间充质细胞表型特征和细胞周期时相,并在体外进行定向诱导.结果:从年轻恒牙牙髓中分离培养得到的牙髓间充质细胞为成纤维样;细胞器发育较好;有间充质干细胞的表面特征:CD90,CD44和CD147阳性细胞的比例很高,CD34,CD38,CD45和 HLA-DR的阳性比例很低;有很强的增殖生长能力;经体外诱导年轻牙髓细胞可在体外向成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞分化,但不能被诱导成为软骨细胞.结论:从人类年轻恒牙牙髓中可以分离培养得到的牙髓间充质干细胞,具有较高的增殖能力和间充质干细胞表面特征,在体外诱导下能分化为成骨细胞、脂肪细胞和神经元,具有多向分化的潜能.     

兔骨髓间充质干细胞体外培养生长特性的初步观察

①目的从形态学角度观察兔骨髓间充质干细胞体外培养的生长特性,建立一套体外分离、培养骨髓问充质干细胞的可靠方法。②方法取兔骨髓后,通过离心,贴壁培养,分离出问充质干细胞。在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化并记录其特点。③结果随时间的推移可见细胞由贴壁前的圆形变成椭圆彤、梭形,少部分呈多角形,细胞呈漩涡样生长。同时可见脂肪细胞出现,部分细胞由梭形变为圆形,周围可见光强反射基质形成,类似软骨细胞。然后细胞增殖由快变慢,更换特制培养液细胞增殖速度加快。④结论兔骨髓间充质干细胞在体外可向成纤维细胞、脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞转化。细胞生长因子可增强及加速骨髓间充质干细胞的多向分化潜能。     

大鼠胰腺导管上皮细胞体外诱导的研究

目的:观察大鼠胰腺导管上皮经四步法诱导分化为胰岛样细胞团后移植治疗糖尿病的效果?方法:采用Ⅴ型胶原酶胆管内灌注消化法,经Ficoll不连续密度梯度离心后分别获得导管上皮细胞和新鲜胰岛?导管上皮细胞经原代培养及传代后取2~6代细胞开始进行四步18天的诱导,分化为胰岛样细胞团,行免疫荧光鉴定?将链脲佐菌素造模成功的18只SD大鼠采用完全随机法均分成3组,空白对照组?新鲜胰岛组?胰岛样细胞团组进行左肾包膜下移植?分别给予RMPI1640?新鲜胰岛和胰岛样细胞团,移植后隔日固定时间监测血糖?结果:经免疫荧光鉴定,分离纯化的胰腺导管细胞具有干细胞特性,诱导后的胰岛样细胞团胰岛素?胰高血糖素染色均为阳性?移植后空白对照组血糖维持在高血糖范围?新鲜胰岛组移植后血糖逐步下降至正常水平,并在2周之内基本稳定在正常范围内但略有上升?胰岛样细胞团组移植后前2天血糖不降反升,之后有所下降但始终未能降至正常范围,然后又逐渐上升?结论:胰腺导管上皮细胞经该方案诱导后分化为胰岛样细胞团,使糖尿病大鼠血糖有一定程度的下降,但下降幅度及维持时间不能令人满意,可能与移植量不够及诱导的胰岛样细胞团功能不良有关?     

体外诱导人骨髓间质干细胞分化为肝细胞样细胞

目的:探讨人骨髓间质干细胞(MSCs)在体外特定条件下是否可以转化为肝细胞样细胞.方法:分离培养人骨髓间质干细胞,采用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及CCl4损伤的小鼠肝脏共培养等诱导方式,在不同时间点分别用RT-PCR和荧光定量PCR检测肝细胞特异性基因的表达,免疫组织化学染色检测肝细胞标志. 结果: 在HGF和bFGF诱导第7天时甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin-18, CK18)和色氨酸2,3-双加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)基因表达阳性,CK18和TDO的表达随诱导时间延长增高;第7天诱导细胞组织化学染色AFP、白蛋白(ALB)、肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor,HNF)、肝细胞特异性抗原(HSA)和CK18表达阳性.与损伤小鼠肝组织共培养21 d后细胞表达AFP和TDO.结论:HGF和bFGF联合诱导以及与CCl4损伤肝组织共培养的方法可体外促进人MSCs分化为肝细胞样细胞,可为肝脏疾病或肝损伤的干细胞治疗提供细胞来源.     

肝卵圆细胞及其定向诱导分化为胰岛细胞的相关研究

胰岛细胞移植是治愈糖尿病的可能方法,但胰岛细胞数量有限,不能满足临床需要。肝卵圆细胞可以在体外诱导分化为胰岛细胞,因此可以作为胰岛细胞潜在的替代资源。文章就肝卵圆细胞及其定向诱导分化为胰岛细胞的相关研究作一综述。     

肝卵圆细胞及其定向诱导分化为胰岛细胞的相关研究

胰岛细胞移植是治愈糖尿病的可能方法 ,但胰岛细胞数量有限,不能满足临床需要. 肝卵圆细胞可以在体外诱导分化为胰岛细胞,因此可以作为胰岛细胞潜在的替代资源.文章就肝卵圆细胞及其定向诱导分化为胰岛细胞的相关研究作一综述.     

人胚胎关节软骨来源的间充质干细胞

目的: 研究从人胚胎关节软骨中分离的细胞的特性、对其表面标志进行鉴定,探讨其多向分化潜能.方法: 从12～20周人胚胎关节软骨中分离细胞,观察细胞的形态、生长状态,采用流式分析的方法对其表面标志进行鉴定并探讨其成骨、成脂、成软骨以及成神经元样细胞的多向分化的潜能.结果:(1)从人胚胎关节软骨中分离的细胞,细胞形态均一,以梭形为主,生长旺盛,可传20代.(2)对不同代的细胞进行流式鉴定,发现其表面标志CD 44、CD 147、CD 90为阳性,CD 34、CD 45、HLA-DR为阴性,与骨髓来源的间充质干细胞的表面标志相似.(3)对其进行成骨、成脂、成软骨、成神经元样细胞的诱导,发现软骨来源的细胞具有多向分化的能力.结论: 从人胚胎关节软骨中可获得间充质干细胞.     

成人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的体外研究

目的 探索成人骨髓间充质干细胞在体外定向分化为神经元样细胞的条件。方法 采用Ficoll-paque(1．077g／m1)分离液密度梯度离心从人的骨髓分离出骨髓间充质干细胞，体外扩增到第10代，选择4组不同组合的神经分化诱导条件，分别诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化，通过免疫细胞化学鉴定诱导后细胞神经元烯醇化酶、神经丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白的表达情况。结果各组诱导剂诱导后，骨髓间充质干细胞分化为具有典型的神经元形态的细胞，免疫细胞化学显示、NF-M呈强阳性反应，NSE表达强度提高，在最佳的分化条件下，即加入bFGF、ATRA、BME、BHA、DMSO诱导条件下，大约80％细胞表达NF—M，86％的细胞为NSE强阳性。结论 成人MSCs在体外可定向诱导分化为神经元样细胞，且具有较高的阳性分化率。     

兔骨髓间质干细胞的体外分离、培养及活性鉴定

目的：建立一种体外分离培养自体兔骨髓间质干细胞（ Ｍ ａｒｒｏｗ Ｓｔｒｏｍ ａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ｍ Ｓ Ｃｓ）的方法。方法：抽取兔骨髓液３～５ ｍ ｌ，经密度梯度离心得骨髓单个核细胞，以１６×１０４／ｃｍ ２ 细胞浓度培养，１２～１４ ｄ 后得到贴壁生长的单层细胞，随后进入传代培养，每传一代约 ５～７ ｄ。结果：原代培养的、以及传代后培养的细胞均为贴壁生长的、均匀一致的纺锤形细胞。两种细胞经体外特殊环境诱导后均可转化为骨髓网状间质细胞和成骨细胞。结论：该细胞经体外长期培养后仍具有多潜能转化活性，确系骨髓间质干细胞。为该细胞的广泛应用奠定基础。     

大鼠骨髓间质干细胞体外分化为成骨细胞的实验研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外诱导分化为成骨细胞的模型。方法：分离大鼠骨髓间质干细胞进行体外培养，观察其生物学特性。并选用一定的诱导剂诱导成骨细胞，通过形态学变化、碱性磷酸酶染色及钙沉积对成骨细胞进行鉴定。结果：大鼠MSCs细胞形态呈长梭形，成骨细胞诱导后MSC细胞形态由长梭形向多边形转变，ALP染色阳性，Von Kossa染色阳性，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。结论：大鼠骨髓MSCs体外能被诱导分化为成骨细胞，为骨组织工程研究的优良种子细胞。     

诱导的人骨髓间充质干细胞在裸鼠体内生成软骨的实验研究

目的探讨利用组织工程方法,将人骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外诱导、培养后,再造软骨组织的可能性。方法从胸外科手术所获得的肋骨骨髓腔中分离得到人MSCs,经无血清培养基诱导培养为软骨细胞,接种于支架材料上,埋植于裸鼠体内,6周后取材进行大体及组织学观察。结果大体观察见裸鼠皮下形成包块,触之有韧性;组织学观察可见有大量软骨细胞成堆形成,但尚有部分未降解的支架材料残留。结论人MSCs在体外经定向诱导后成为软骨细胞,与支架材料复合物可在裸鼠体内形成软骨组织;人MSCs可能成为组织工程软骨的“种子细胞”。     

小鼠骨髓内皮细胞对脐血造血细胞体外扩增的作用

目的：观察骨髓内皮细胞对脐血造血细胞体外扩增的影响。方法：体外培养骨髓内皮细胞株细胞,收集无血清条件培养液（命名为ECM）。用MiniMACS磁珠法分离脐血CD34+细胞。检测CD34+细胞经ECM体外液体培养24 h后或与骨髓内皮细胞层(ECL)共培养24 h后脐血造血细胞的扩增倍数,并观察在加入bFGF的培养条件下收集的骨髓内皮细胞条件培养液（bFGF-ECM）是否能加强对脐血造血细胞的扩增作用。 结果：ECM,ECL 皆能显著扩增脐血早期或晚期造血细胞,且二者对早期造血细胞的扩增效果是类似的;bFGF-ECM对脐血造血细胞的扩增倍数明显高于用ECM扩增的倍数。结论：小鼠骨髓内皮细胞对脐血造血细胞有明显的体外扩增作用。     

Differentiation of mesenchymal stem cells into dopaminergic neuron-like cells in vitro

INTRODUCTION The therapy of Parkinson’s disease is difficult, sopeople have been exploring more effective methods.Drugs can only treat symptoms of the diseases, andbrain tissue transplantation has been the most prosp-ective way, but the sources of transplantation cells needto be explored. The people have a new viewpoint ofthe central nervous system (CNS) regeneration andthe therapy of CNS diseases[1,2] because of the recentdiscovery of stem cell populations in CNS. But adultneura…     

人骨髓间充质干细胞体外定向分化为心肌细胞的实验研究

目的：建立人骨髓间充质干细胞（MSCs）体外定向分化为心肌细胞的实验模型。方法：取6个月水囊引产胎儿股骨骨髓,Percoll分离液分离,取单个核细胞层在人MSCs专用MSCGM培养基中体外培养。将第3代生长状态良好的MSCs用10μmol／L 5-氮胞苷孵育诱导24h,继续向心肌细胞诱导分化。结果：用Percoll分离液（1．073g／ml）分离得到的单个核细胞48～72h呈纺锤形、梭形、多角形的多型性改变;经5-氮胞苷孵育24h,细胞逐渐向梭形心肌细胞样形态转变,胞浆中可见棕黄色颗粒。结论：MSCs在体外经5-氮胞苷孵育24h,可被定向诱导分化为心肌形态的细胞。     

慢性粒细胞性白血病骨髓间充质干细胞的分离纯化及其功能特性的研究

目的 分离、纯化慢性粒细胞性白血病（CML）患者骨髓间充质干细胞（MSC）,并对MSC进行功能、特性鉴定。方法 获取CML患者的骨髓MSC,应用极限稀释法获取单克隆来源的MSC,并在低血清培养液中培养和扩增;流式细胞术检测MSC免疫表型和细胞周期;通过油红O染色、Von Kossa染色和Western印迹检测MSC向脂肪、骨和神经细胞的分化。电镜检测CML患者骨髓MSC的超微结构;通过软琼脂培养法和裸鼠接种,确定CML来源的MSC是否存在致瘤性。结果 MSC在相应的诱导条件下可以向骨、脂肪和神经细胞分化。CML来源的MSC在倒置显微镜下为梭形,表达CD29、CD44、CDl05,而CDllb,CD31、CD34、CD45、HLA—DR均为阴性。CML来源的MSCBCR／ABL融合基因阴性,不具备体内和体外致瘤性。结论CML患者骨髓中存在具有多向分化能力的MSC,该细胞群体不具备体外和体内致瘤性,表现为正常MSC的生物学特征。     

人脐血和脐带源MSCs分离培养难易及生物学特征的对比研究

目的 比较从人脐血和脐带中分离培养间充质干细胞（MSCs）的难易及两种不同来源MSCs的生物学特性,寻找最佳MSCs来源.方法 采用密度梯度离心法和组织块法分离培养人脐血MSCs和脐带MSCs.流式细胞术检测脐血和脐带源MSCs表面分子表型;采用丹参联合生长因子的方法诱导两种不同来源的MSCs向神经细胞分化.结果 脐带 MSCs原代分离培养成功率可达88%,而脐血MSCs分离培养成功率只有24%;脐带MSCs和脐血MSCs倍增时间分别为22h和38h;流式细胞术检测结果显示：两者具有相似的免疫表型,均表达黏附分子和基质细胞标记,不表达造血细胞标记、内皮细胞标记和HLA-DR;两种来源的MSCs在体外均可分化为樟经元样细胞.结论 脐带源 MSCs在生长速度、培养成功率上远高于脐血源 MSCs,在细胞表型及分化能力方面无差别.脐带 MSCs 是一种理想的 MSCs 来源.     

Effectene介导钆喷酸葡胺标记人脐带间充质干细胞及体外磁共振成像研究

目的应用Effectene介导钆喷酸葡胺（Gd-DTPA）标记人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）,研究磁标记干细胞的生物学特性,探讨Gd-DTPA标记干细胞体外磁共振成像（MRI）规律。方法组织块贴壁法分离纯化hUCMSCs,通过传代培养、扩增,鉴定细胞在体外的生物学特性。应用Effectene转染Gd-DTPA标记hUCMSCs,计数法检测Gd-DTPA标记干细胞的增殖能力,体外诱导其向成脂细胞和成骨细胞分化,观察Gd-DTPA影响hUCMSCs的生物学特性。应用1．5T临床应用型MRI系统,观察Gd-DTPA标记hUCMSCs的信号强度随细胞传代的变化规律,并探索MRI的最低细胞量。结果应用组织块贴壁法接种2周后获得原代细胞,细胞呈长梭形,漩涡样生长,传2代后细胞形态更为均匀一致。流式细胞仪检测第3代细胞高表达CD29、CD44、CD90和CD105,不表达CD31、CD45、CD40和HLA-DR。体外定向诱导能分化为成脂细胞和成骨细胞。Effectene能成功转染Gd-DTPA进入干细胞,检测标记后的干细胞增殖能力未受到影响,并能在体外诱导向成骨细胞和成脂细胞分化。体外MRI扫描Gd-DTPA标记的干细胞在T1WI呈现高信号,体外持续示踪时间约12d。结论应用组织块贴壁法能有效分离纯化hUCMSCs。应用Effectene转染Gd-DTPA标记hUCMSCs进行体外MRI示踪是可行的。