胰岛素样生长因子结合蛋白7在活化肝星状细胞促肝纤维化中的作用

目的 探讨胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)对肝星状细胞-T6合成分泌纤维连接蛋白的调节作用及抗IGFBP7抗体诱导肝星状细胞-T6凋亡的作用.方法 体外培养活化的肝星状细胞-T6分为5组:(1)空白对照组;(2)IGFBP7 20μg/L组;(3)抗IGFBF7抗体0.25 mg/L组;(4)抗IGFBP7抗体0.50 mg/L组;(5)抗IGFBP7抗体1.00 mg/L组.采用Western blot及ELISA法检测肝星状细胞-T6经IGFBP7作用24 h后纤维连接蛋白的表达及合成分泌量的变化;MTT比色法检测抗IGFBP7抗体对肝星状细胞-T6作用14 h后增殖抑制的影响,同时用流式细胞仪测定抗IGFBP7抗体对肝星状细胞-T6凋亡发生率的影响.采用单因素方差分析,两样本均数比较采用t检验,多重比较采用SNK-q检验.结果 肝星状细胞-T6经IGFBP7作用后纤维连接蛋白的表达及合成分泌量较空白对照组显著增加(t=22.06,7.43,P<0.05).抗IGFBP7抗体对肝星状细胞-T6的增殖具有明显抑制作用(F=14.70,P<0.05).抗IGFBP7抗体能够上调肝星状细胞-T6的凋亡率(F=63.79,P<0.05).结论 IGFBP7能够使细胞外基质的重要组成成分纤维连接蛋白的合成与分泌增加,抗IGFBP7抗体可以抑制肝星状细胞-T6的增殖并诱导其发生凋亡.     

小鼠肝组织中胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1在肝纤维化发生及发展中的作用

目的 探讨小鼠肝组织中胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(IGFBPrP1)在肝纤维化发生及发展过程中的作用.方法 采用腹腔注射硫代乙酰胺制备小鼠肝纤维化模型,按时间将小鼠分为模型4、5、6周组(各10只),并分别设立正常对照组(各6只),采用Masson染色检测肝组织胶原沉积,免疫组织化学检测肝组织中IGFBPrP1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)、纤维连接蛋白(FN)、TGF-β1和Smad3蛋白表达和分布,同时以Western blot检测IGFBPrP1、α-SMA和Smad3蛋白表达.采用单因素方差分析、Pearson等级相关检验进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义.结果 免疫组织化学检测结果发现,模型组小鼠肝组织中IGFBPrP1由0.21±0.03上升到5.03±0.09,α-SMA由0.11±0.04上升到10.09±0.18,Collagen Ⅰ由0.22±0.01上升到11.01±±0.16,FN由0.31±0.09上升到19.81±1.62,TGF-β1由0.49±0.02上升到5.97±0.19,Smad3由0.22±0.03上升到2.03±0.07,这些检测因子在模型组的表达与正常对照组比较,随时间的增加而明显增强(F=783.141,998.200,886.715,935.242,931.241,697.118,P<0.05).在肝纤维化形成过程中,IGFBPrP1的表达与α-SMA、Collagen Ⅰ、FN、TGF-β1和Smad3的表达均呈正相关(r=0.906,0.927,0.988,0.947,0.977,P<0.05).Western blot检测结果发现,模型组小鼠肝组织的IGFBPrP1蛋白表达量由0.23±0.01上升到0.92±0.07,α-SMA蛋白表达量由0.36±0.02上升到1.39±0.03,FN蛋白表达量由0.03±0.00上升到0.12±0.02,Smad3蛋白表达量由0.09±0.01上升到0.56±0.04,模型组小鼠的蛋白表达量均较正常对照组明显升高(F=57.316,201.214,103.871,72.966,P<0.05).在肝纤维化形成过程中,IGFBPrP1的表达与α-SMA、FN和Smad3的表达均呈正相关(r=0.982,0.924,0.965,P<0.05).结论 IGFBPrP1随着肝纤维化程度的加重,其表达水平逐渐上调,IGFBPrP1的促肝纤维化作用可能与促进肝星状细胞激活、使细胞外基质的重要组成成分Collagen Ⅰ和FN的合成与分泌增加及影响TGF-β1/Smad3信号通路有关.     

Smad3沉默对IGFBPrP1诱导肝星状细胞分泌细胞外基质作用的影响

目的 明确胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(insulin-like growth factor binding protein related protein1,IGFBPrP1)是否通过Smad3信号通路影响肝星状细胞分泌细胞外基质.方法 (1)化学合成2对针对Smad3基因的siRNAs(siRNA1,siRNA2),转染肝星状细胞株(HSC-T6).采用实时定量PCR和Western blot法筛选抑制效率较高的siRNA用于干扰实验;(2)将肝星状细胞株(HSC-T6)分为4组:阴性对照组、siRNA-Smad3转染组、siRNA-Smad3+IGFBPrP1组和IGFBPrP1组.将筛选的抑制效率较高的siRNA转染HSC-T6细胞株,田Western b1ot检测各组Smad3、纤维连接蛋白及Ⅰ型胶原的表达.结果 (1)siRNA2-Smad3对Smad3的抑制效率较高;(2)与阴性对照组相比,siRNA-Smad3转染组Smad3蛋白的表达显著下降(P＜0.01).与IGFBPrP1组相比,siRNA-Smad3+IGFBPrP1组纤维连接蛋白和Ⅰ型胶原蛋白的表达均显著降低(P＜0.01).结论 IGFBPrP1影响肝星状细胞分泌细胞外基质的机制之一是通过Smad3信号通路来实现的.

Abstract：

Objective To identify the effect of IGFBPrP1 on the secretion of extracellular matrix in hepatic stellate cells through the Smad3 signaling pathway. Methods (1)Two pairs of chemically synthesized siRNAs (siRNA1, siRNA2) targeting Smad3 were transfected into HSC-T6 cells,real-time PCR and Western blot were used to evaluate the silence efficiency, and the better siRNA was used. (2)HSC-T6 cells were divided into four groups: Negative control group, siRNA-Smad3 transfection group, siRNA-Smad3+IGFBPrP1 group and IGFBPrP1 group. The better siRNA was chosen to transfect into HSC-T6 cells. The protein expressions of Smad3, fibronectin and Collagen Ⅰ were evaluated by Western blot. Results (1)siRNA2-Smad3 inhibited Smad3 gene expression stronger than another siRNA. (2)After transfection of siRNA2-Smad3, the protein expression of Smad3 was significantly decreased compared to the negative control group(P＜0.01). The protein expression of fibronectin and Collagen Ⅰ in IGFBPrP1 stimulating HSCs treated with siRNA2-Smad3 were significantly decreased compared to that in IGFBPrP1 stimulating HSC without siRNA2-Smad3 (P ＜0. 01 ).Conclusion IGFBPrP1 induces the secretion of extracellular matrix in hepatic stellate cells through the Smad3 signaling pathway.     

反义核酸对大鼠肝纤维化转化性生长因子β受体表达的调节作用

目的探讨反义转化生长因子β（TGF－β）RNA对其受体表达的调节及其防治肝纤维化的机制。方法将反义TGF－β1基因导入CCl_4诱导的大鼠纤维化肝脏,用原位杂交方法观察TGF－β受体的表达。结果纤维化肝脏TGF－β1型受体主要分布于汇管区周围及纤维间隔内和散在分布于肝实质内,Ⅱ型受体则主要分布于肝脏小叶、纤维间隔及汇管区,且均较正常组增加。经转基因处理后大鼠纤维化肝脏Ⅰ、Ⅱ型受体的分布未发生改变,但阳性反应明显减弱,阳性细胞数量明显减少,纤维间隔明显减少。结论反义TGF-1基因能下调其Ⅰ、Ⅱ型受体的表达,以抑制贮脂细胞的活化和肝细胞的凋亡,从而减缓肝纤维化的发展。     

转化生长因子β1诱导肾间质成纤维细胞表型转化及其对结缔组织生长因子基因表达的影响

目的 研究转化生长因子β1（transforming growth factor beta-1,TGF-β1）诱导大鼠正常肾间质成纤维细胞（NRK-49F）表型转化过程中结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）基因表达的变化.方法 以不同浓度的TGF-β1（0、0.5、1、2、5、10 ng/ml）刺激NRK-49F细胞,分别应用MTT比色法、Western Blot、Northern Blot方法,检测TGF-β1刺激后肾间质成纤维细胞的增殖、Ⅰ型、Ⅲ型前胶原mRAN的表达、细胞表型标志物α-SMA mRNA及蛋白质表达、CTGFmRNA的表达变化.结果 1 ng/ml浓度以上TGF-β1能显著促进NRK-49F细胞增殖,上调Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达水平,诱导肌成纤维细胞表型标志α-SMA mRNA及蛋白质的表达,显著上调CTGF mRNA的表达水平（P＜0.01或P＜0.05）;以上效应均呈浓度依赖性.同时CTGF mRNA表达水平的增高与细胞表型转化的程度相一致.结论 TGF β1能诱导肾间质成纤维细胞发生表型转化,并促进了细胞增殖及细胞外基质的合成;该效应与TGF β1显著上调CTGF的基因表达一致.     

紫衫醇对大鼠肝纤维化的抑制作用及机制研究

目的:探讨紫衫醇对大鼠肝纤维化的抑制作用及其分子机制。方法:将30只Wistar大鼠随机均分为正常对照组、肝纤维化模型组,肝纤维化模型+紫衫醇组,肝纤维化模型用腹腔注射二甲基亚硝胺每日1次连续7 d诱导,之后,肝纤维化模型+紫衫醇组大鼠给予尾静脉注射紫杉醇液,隔日1次,共3次;实验结束时,处死大鼠观察肝脏病理学和血清学指标变化,及肝组织中肝星状细胞标志物α-SMA的表达。将大鼠肝星状细胞HSC-T6分别用TGF-β1、紫杉醇+TGF-β1处理,以无处理的HSC-T6细胞为对照,分别检测各组细胞纤连蛋白及I、III型胶原m RNA与蛋白的表达。结果:正常对照组肝组织无病理学改变,肝纤维化模型组出现肝纤维化病变,肝纤维化模型+紫杉醇组可见肝组织中度坏死,无明显坏死结节;与正常对照组比较,肝纤维化模型组与肝纤维化模型+紫杉醇组转氨酶、总胆红素(TIBL)、透明质酸(HA)水平均明显升高,白蛋白(ALB)水平明显降低(均P0.05),后者较前者在TBIL、ALB、HA方面有明显改善(均P0.05);正常对照组肝组织无明显α-SMA表达,肝纤维化模型组和与肝纤维化模型+紫杉醇组肝组织均有α-SMA表达,后者的α-SMA阳性细胞数明显少于前者(P0.05);与无处理的HSC-T6细胞比较,TGF-β1与紫杉醇+TGF-β1处理后的HSC-T6细胞纤连蛋白及I、III型胶原m RNA与蛋白均明显上调(均P0.05),后者的上调程度明显低于前者(均P0.05)。结论:紫杉醇可抑制大鼠肝纤维化的产生和发展,机制可能与其抑制肝星状细胞中TGF-β信号通路从而减少肝星状细胞活化有关。     

体外微团培养兔骨髓间充质干细胞形成软骨细胞

[目的]探讨兔骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)体外诱导形成软骨细胞的方法,以及转化生长因子-β_1(transforming growth factor β_1,TGF-β_1)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ,bFGF)之间的相互作用.[方法]对兔骨髓间充质干细胞体外进行原代和传代培养,按加入诱导条件不同分为四组:A组:TGF-β_1+ bFGF;B组:TGF-β_1+ IGF-Ⅰ;C组:TGF-β_1;D组:空白对照组.3周后分别做四唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色试验、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)检测和免疫组织化学染色.[结果]A、B、C三组Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性;MTT吸光度值和GAG含量检测结果均为:A组>C组>D组, B组>C组>D组,统计学有显著差异.[结论]兔BMSCs在一定条件下可以诱导成软骨细胞,TGF-β_1和IGF-Ⅰ、bFGF在BMSCs向软骨细胞分化和增殖时起协同作用.     

诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的体外研究

目的 探讨转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF—β1）、胰岛素样生长因子1（insulinlike growth factor1，IGF-1）在诱导骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem ceils，MSCs）向软骨细胞分化过程中的相互作用，并研究细胞密度对MSCs向软骨细胞分化的影响。方法 取健康昆明种小白鼠骨髓，用全骨髓贴壁法筛选获得MSCs，体外培养传代。采用特定的诱导培养使MSCs向软骨细胞分化，按培养基内添加生长因子的不同分成3个实验组和对照组。实验组分别为：TGF—β1＋IGF-1联合应用组（TGF—β1 10ng／ml、IGF-1 50ng／m1）；TGF—β1单独应用组（TGF—β1 10ng／m1）；IGF-1单独应用组（IGF-1 50ng／m1）；对照组不添加任何生长因子。TGF—β1＋IGF-1联合应用组于诱导14d和21d，分别进行甲苯胺蓝染色及免疫荧光双染法鉴定；于诱导7、14和21d各组分别提取诱导细胞总RNA，进行RT—PCR扩增，检测TGF—β1、IGF-1对诱导细胞Ⅱ型胶原表达量的影响；比较MSCs在平板培养及细胞团培养时，Ⅱ型胶原表达量的差异。结果TGF—β1＋IGF-1联合应用组诱导培养14d，诱导软骨细胞甲苯胺蓝染色呈阳性，免疫荧光染色可见诱导软骨细胞的细胞外基质含有Ⅱ型胶原。各组基因扩增产物的凝胶电泳可见，TGF—β1＋IGF-1联合应用组和TGF—β1单独应用组Ⅱ型胶原扩增片段呈阳性；IGF-1单独应用组和对照组，未见Ⅱ型胶原扩增条带；凝胶成像系统灰度扫描示Ⅱ型胶原表达量TGF—β1＋IGF-1联合应用组各时间点均比TGF—β1单独应用组明显增加（P〈0．05）。细胞团培养模式下，诱导细胞表达Ⅱ型胶原比平板培养模式更加显著。结论 MSCs向软骨细胞诱导分化时，IGF-1对TGF—β1有明显的促进作用；细胞培养密度提高有利于MSCs成软骨细胞表型。     

重组PGL3-转化生长因子β1基因转染兔骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨将编码细胞转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)的重组PGL3-TGF-β1质粒转染兔骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells,MSCs),体外通过自分泌、诱导作用向软骨细胞方向分化的可行性,为基因加强组织工程学修复软骨损伤提供体外实验依据.方法兔MSCs体外密度梯度离心及贴壁筛选法分离培养,脂质体法转染重组PGL3-TGF-β1,转染后绘制不同时期细胞生长曲线,MTT法分析转染后细胞(实验组)生长活性,以未转染空载体细胞为实验对照组,未转染细胞为空白对照组;转染后第2、7天,分别进行抗TGF-β1和抗Ⅱ型胶原蛋白的免疫组织化学染色(SABC法),以未转染细胞为实验对照组,PBS作为一抗为空白对照组,进行图像定量分析.结果 MSCs体外分离培养,脂质体法转染后,生长曲线显示转染后细胞生长活性较对照组降低,MTT法显示实验组及实验对照组吸光度(A)值较空白对照组低,差异有统计学意义(P＜0.01);实验组转染细胞第2天,抗TGF-β1免疫组织化学染色可见细胞内阳性颗粒,实验对照组及空白对照组均为阴性;转染细胞第7天,抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色实验组可见细胞内阳性颗粒,实验对照组及空白对照组均为阴性.图像分析示,实验组抗TGF β1及抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性值与实验对照组及空白对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论脂质体法重组PGI3-TGF-β1基因可成功转染兔MSCs,但对细胞生长有一定影响,转染细胞表达TGF β1,通过其自分泌、诱导作用,细胞分泌Ⅱ型胶原蛋白,表现出软骨细胞样生理特征,并向软骨细胞方向分化.     

肿瘤坏死因子-α对肝星状细胞形态及表达结缔组织生长因子的影响

目的 通过观察肿瘤坏死因子（TNF）-α对肝星状细胞（HSC）形态和结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响，探讨TNF—α在肝纤维化中的作用机制。方法 采用体外培养大鼠肝星状细胞，加入TNF-α和TGF-β1，透射电镜观察肝星状细胞的形态学改变并应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测不同处理组HSC中CTGF的表达。结果 TNF-α、TGF—β1均诱导HSC中CT-GF表达；10μg／L浓度的TNF-α作用6、24和48h后，检测到CTGFmRNA表达，而TGF-β1在1μg/L浓度作用4h后，即可诱导HSC中CTGFmRNA表达。结论 TNF-α诱导HSC中CTGF的表达可能参与早期肝纤维化的形成。