应用酶解及氯化盐析方法对4个种属Ⅱ型胶原的提纯及比较

Ⅱ型胶原是人体关节软骨中的主要组成部分。针对Ⅱ型胶原所产生的自身抗体可能与自身免疫疾病中的关节软骨破坏有关。我们利用猪、牛、鸡及人的软骨作为原材料 ,通过酸性法及中性法提取Ⅱ型胶原并用溴化氰裂解Ⅱ型胶原 ,为深入研究与Ⅱ型胶原有关的疾病及Ⅱ型胶原自身抗体形成机理提供物质基础。一、材料与方法1 材料 :猪、牛的气管软骨及鸡的肋软骨均可从市场购得 ,人的肋软骨来自引产胚胎及一些新鲜死婴。标准Ⅱ型胶原及其抗体为美国Ｓｉｇｍａ产品。2 方法 :(1)Ⅱ型胶原的提纯 :①分别将鸡、牛、猪及人的软骨剥净软组织 ,铰碎后用组织匀…     

Ⅲ型胶原与骨关节炎

Ⅲ型胶原是一种细胞外的结构蛋白,属于胶原家族的一种,广泛存在于机体组织器官中,其在骨关节炎关节软骨中的表达较正常关节软骨高。骨关节炎时关节软骨以Ⅲ型胶原沉积为主的纤维化改变可影响关节局部的细胞代谢及生物力学特性,本文拟通过对近年来关于Ⅲ型胶原的研究进行综述,总结Ⅲ型胶原在骨关节炎关节软骨中的表达及代谢特点。     

胶原-纤维蛋白混合凝胶对关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原的影响

目的：以胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行关节软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,研究载体对软骨细胞在其中的表达及合成Ⅱ型胶原的影响。方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,制成软骨培养物并在体外培养。培养第3周时,取材进行Masson染色、Ⅱ型胶原寡核苷酸探针原位杂交和Ⅱ型胶原的免疫组化观察。 结果：体外培养3周,培养物内细胞大部分存活, Masson染色形成软骨陷窝,同源性细胞簇出现,细胞周围有蓝色物质环绕存在,原位杂交证实其软骨细胞表达Ⅱ型胶原mRNA,免疫组化证实软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。 结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可促进关节软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原是软骨组织最主要的细胞外基质成分。     

二期骨折愈合中Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达

目的 揭示二期骨折愈合中Ⅰ、Ⅱ型胶原表达的变化规律，加深对骨愈合机制的认识。方法 利用大鼠肌骨二期骨折愈合模型，分别于骨折后3天和1、2、3、4周取材，制片，HE、阿尔新蓝染色及Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果 1周时，免疫组化染色显示Ⅰ、Ⅱ型胶原均有表达。Ⅱ型胶原表达第3周时达峰值，Ⅰ型胶原表达3周后急剧上升，第4周达较高水平。结论 在骨折愈合的不同时期，软骨痂内软骨细胞的组织形态变化以及不同类型胶原的表达均与其修复功能密切相关。     

Ⅱ型胶原微量提取与纯化

Ⅱ型胶原是关节软骨中主要细胞外间质之一,多种风湿性疾病的发生与Ⅱ型胶原异常有关。现已知类风湿关节炎发病与Ⅱ型胶原自身免疫反应有关,用Ⅱ型胶原免疫某些动物可诱导出多关节炎。然而口服Ⅱ型胶原可通过诱导免疫耐受来治疗类风湿关节炎,因此Ⅱ型胶原的提取是研究Ⅱ型胶原的重要步骤。虽然Ⅱ型胶原在人体含量较多,但临床取材可获得的数量有限,为此我们探讨了Ⅱ型胶原的微量提取和纯化方法。1　Ⅱ型胶原的提取与纯化方法　　真空干燥,4℃,获得Ⅱ型胶原(平均每2.5克关节软骨可获Ⅱ型胶原10ｍｇ)2　Ⅱ型胶原鉴定2.1　紫外分光光度计鉴定提取…     

椎间盘Ⅳ型胶原的表达

①目的了解椎间盘中Ⅳ型胶原的表达及其与椎间盘退变的关系。②方法利用亲和细胞免疫组织化学技术及苏木精一伊红组织化学染色技术，观察Ⅳ型胶原在不同年龄组及退变手术椎间盘组织冷冻切片中的表达和变化情况，结合形态学变化，判断其与椎间盘退变的关系。③结果Ⅳ型胶原仅在青少年椎间盘中表达，主要分布在髓核细胞周围，且随年龄的增加，阳性染色细胞数明显增加；退变手术组及其他年龄组无Ⅳ型胶原表达；青少年组及成年组纤维环及软骨终板结构良好，而髓核存在明显的显微裂痕。④结论Ⅳ型胶原出现并存在于青少年椎间盘，是椎间盘髓核细胞对有害刺激的早期反应，可以作为椎间盘退变的早期指标之一。     

超声波对骨痂中Ⅰ、Ⅱ型胶原代谢的影响

目的 探讨低强度超声波对骨折愈合中Ⅰ、Ⅱ型胶原代谢的影响。方法建立大鼠双侧胫骨近侧皮质骨缺损的动物模型，随机分为2组，实验组每日接受低强度超声波刺激，而对照组给予假刺激。于术后10、20、30d处死动物，取标本(骨痂)进行组织学及免疫组化染色观察。结果组织学检查显示：实验组的血肿机化、吸收，软骨性骨痂和软骨内化骨明显早于对照组，免疫组化检查显示：实验组在20d时Ⅱ型胶原的表达明显高于对照组；在30d时Ⅰ型胶原的表达也略高于对照组。结论低强度超声波通过增加骨痂内Ⅰ、Ⅱ型胶原的合成来促进骨折的愈合，其中以Ⅱ型胶原的作用尤其明显。     

突出腰椎间盘胶原的定量研究

目的　探讨椎间盘中胶原的变化与腰椎间盘突出症的关系。②方法　利用溴化氰 (CNBR)消化椎间盘胶原产生多肽的方法 ,借助于梯度层析和氨基酸分析对突出和正常椎间盘胶原对比分析。③结果　突出椎间盘纤维环Ⅰ型与Ⅱ型胶原比值较正常纤维环高 (t=7.93,P <0 .0 1) ,突出髓核中出现Ⅰ型胶原 ,而Ⅱ型胶原相对含量无明显变化 (t=0 .31,P >0 .0 5 )。④结论　椎间盘胶原的变化为腰椎间盘突出症的重要病理基础之一。     

人骨形态发生蛋白2促兔椎间盘细胞aggrecan和Ⅱ型胶原的合成作用

目的:研究人骨形态发生蛋白2(BMP-2)对体外培养兔腰椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原和软骨聚集蛋白多糖(aggrecan)的影响。方法:兔髓核细胞体外分离培养,分别利用Antonopulos和Miamine法检测对照组和不同剂量hBMP-2(10,100和1000ng/ml)组胶原和蛋白多糖表达水平。RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA的表达水平。结果:加入BMP-2后可见随剂量增加胶原和蛋白多糖表达量逐渐增加,并存在剂量依赖关系(P<0.01)。在6dRT-PCR结果显示BMP-2组aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA的表达高于对照组,并且随剂量增高aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA的表达量逐渐增加。结论:BMP-2可促进体外培养兔腰椎间盘细胞合成代谢,随剂量增加胶原和蛋白多糖表达量逐渐增加,并存在剂量依赖关系,提示hBMP-2可能对退变椎间盘具有修复功能。     

髋关节发育不良髋臼软骨中Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶7表达的改变

目的 检测Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶7(MMP-7)在发育性髋关节发育不良(DDH)早期髋臼软骨中表达的改变情况,探讨Ⅱ型胶原、MMP-7与软骨退变的相关性.方法 兔左下肢作为实验侧,膝关节伸直位、长腿管形石膏固定;右下肢作为对照侧,5周后经X线证实构建DDH动物模型8只.观察实验组和对照组髋臼软骨形态学改变;免疫组化两步法、免疫印迹方法检测Ⅱ型胶原、MMP-7在髋臼软骨中表达的改变.结果 实验组可见有局部软骨细胞簇集,细胞外基质甲苯胺蓝染色有失染现象.免疫组化染色结果显示实验组Ⅱ型胶原和MMP-7阳性染色细胞明显高于对照组.免疫印迹结果显示实验组Ⅱ型胶原和MMP-7蛋白表达量均升高,组间比较差异均有统计学意义(t=2.18,t=2.334,P<0.05).结论 DDH早期髋臼软骨发生退行性变,Ⅱ型胶原、MMP-7高表达,提示Ⅱ型胶原、MMP-7的数量和强度可能与软骨退行性变的程度差异有关.     

二期骨折愈合中Ⅰ、Ⅱ型胶原的表达

目的　揭示二期骨折愈合中 、 型胶原表达的变化规律 ,加深对骨愈合机制的认识。方法　利用大鼠股骨二期骨折愈合模型 ,分别于骨折后 3天和 1、2、3、4周取材 ,制片 ,HE、阿尔新蓝染色及 、 型胶原免疫组化染色。结果　 1周时 ,免疫组化染色显示 、 型胶原均有表达。 型胶原表达第 3周时达峰值 , 型胶原表达3周后急剧上升 ,第 4周达较高水平。结论　在骨折愈合的不同时期 ,软骨痂内软骨细胞的组织形态变化以及不同类型胶原的表达均与其修复功能密切相关     

健康中国人股骨头软骨下骨及股骨头缺血性坏死软骨下骨胶原,蛋白…

作者对２０例健康中国人股骨头软骨下骨及２０例股骨头缺血性坏死股骨头软骨下骨的胶原及蛋白聚糖的含量进行了测定及比较，确立了健康中国人股骨头软骨下骨胶原及蛋白聚糖的正常参考范围，为研究疾病状态下股骨头软骨下骨胶原及蛋白糖含量的变化提供了正常参数。同时，通过对股骨头缺血性坏死的股骨头软骨下骨的胶原和蛋白聚糖的定量分析，进一步弄清了股骨头缺血性坏死过程中的病理改变基础，发现了股骨头缺血性坏死后软骨下骨胶原     

颅内囊性动脉瘤壁Ⅰ、Ⅲ型胶原分布的病理组织学研究

目的 通过对颅内囊性动脉瘤壁Ⅰ、Ⅲ型胶原形态学的定性研究，总结其分布特点并分析其在动脉瘤发生及发展过程中的作用。方法 23例单发颅内囊性动脉瘤患者为实验组，7例无心血管疾病的脑内血肿合并脑挫裂伤患者为对照组。通过常规眦染色、现代免疫组织化学染色，结合天狼星红染色-偏振光法，对两组样本进行实验处理及观察。结果 实验组样本中Ⅰ型胶原在动脉瘤壁分布广泛，在中膜中外层及外膜区域更为明显；对照组样本Ⅰ型胶原位于中膜中外层及外膜区域。实验组Ⅲ型胶原分布少于Ⅰ型胶原，主要分布在动脉瘤壁中膜中层；对照组Ⅲ型胶原主要位于动脉壁中膜中外层。结论 在动脉瘤壁中Ⅰ、Ⅲ型胶原分布与正常颅内动脉壁存在差异，提示颅内囊性动脉瘤在形成发展过程中存在一种组织损伤与修复的过程。     

骨性关节炎关节软骨内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表型的实验研究

目的对骨性关节炎（OA）关节软骨内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原进行动态观察. 方法采用兔膝关节伸直位制动的OA动物模型,对不同制动时间动物的右侧股骨内髁关节软骨进行Mankin评分,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的免疫组化测定. 结果 OA早期Ⅱ型胶原量增加,但随着OA病变的发展从切线层向深层逐渐丧失.OA关节软骨内无Ⅰ型胶原的分泌,但出现Ⅲ型胶原,其量随着病变发展有呈增加趋势,同时在病变中也受到破坏. 结论 OA关节软骨的胶原类型以Ⅱ型胶原为主,但出现Ⅲ型胶原.     

同种异体组织工程化软骨组织的生化分析

目的以胚胎来源的关节软骨细胞,体内构建同种异体组织工程化软骨组织,分析其与正常关节软骨组织糖胺多糖(GAG)和Ⅱ型胶原含量的差异.方法以酶消化法分离胚胎(100 d)山羊关节软骨细胞,与生物材料聚环氧乙烯复合,并植入异体成年山羊腹部皮下.按不同时间段取材, Western-blot、MTT比色法分析测定其GAG和Ⅱ型胶原含量,并与正常关节软骨组织比较.结果新生软骨中GAG的含量比正常关节软骨显著下降(P<0.01),而II型胶原含量与正常关节软骨无显著性差异.结论胚胎来源的同种异体组织工程化软骨与正常关节软骨有着相同的生化成分,且新生软骨中II型胶原的含量与正常关节软骨接近.     

修饰胶原的止血活性研究

目的探讨通过胶原侧链修饰,提高胶原材料的快速止血能力。方法通过胶原侧链修饰,制备带不同电荷的胶原,运用血小板聚集及动物创面止血模型评价材料止血活性。结果通过zeta电位分析表明,侧链修饰制得带不同电荷的胶原。血小板聚集实验表明甲基化胶原(MC)可以显著增强胶原同血小板之间的作用,其血小板聚集率均显著高于未改性胶原(NC)(P<0.001),而带负电荷的琥珀酰化胶原(SC)不能诱导血小板聚集(P<0.001)。动物创面止血模型中,MC的止血时间和出血量明显优于SC、明胶和NC。结论带正电荷的甲基化胶原可以有效促进血小板聚集活化,缩短材料的凝血时间,极大提高胶原材料的止血性能。     

同种异体组织工程化软骨组织的生化分析

目的 以胚胎来源的关节软骨细胞,体内构建同种异体组织工程化软骨组织,分析其与正常关节软骨组织糖胺多糖(GAG)和Ⅱ型胶原含量的差异。方法 以酶消化法分离胚胎(100 d)山羊关节软骨细胞,与生物材料聚环氧乙烯复合,并植入异体成年山羊腹部皮下。按不同时间段取材,Western-blot、MTT比色法分析测定其GAG和Ⅱ型胶原含量,并与正常关节软骨组织比较。结果 新生软骨中GAG的含量比正常关节软骨显著下降(P<0.01),而Ⅱ型胶原含量与正常关节软骨无显著性差异。结论 胚胎来源的同种异体组织工程化软骨与正常关节软骨有着相同的生化成分,且新生软骨中Ⅱ型胶原的含量与正常关节软骨接近。     

类风湿关节炎患抗人、猪两种属Ⅱ型胶原抗体检测的意义

目的：检测类风湿关节炎（RA）患者血清中人有猪Ⅱ型胶原抗体水平，探讨其在RA发病中的意义。方法：用自提取的人、猪Ⅱ型胶原包板，采用改良的酶联免疫吸附法（ELISA）测定105例RA患者血清抗人，猪Ⅱ型胶原抗体IgG及IgA，并与正常人（140例）及疾病对照组（80例）比较分析。同时检测患者的类风湿因子（RF）、血沉（ESR）及C反应蛋白（CRP）。结果：RA患者血清中抗人Ⅱ型胶原抗体IgG、IgA阳性率分别为25．3％、27．5％，抗猪Ⅱ型胶原抗体IgG、IgA阳性率分别为26．9％、25．6％，显著高于正常人及疾病对照组（P＜0．05）。两种属Ⅱ型胶原抗体IgG及IgA常同时存在于同一患者中，两种属Ⅱ型胶原抗体与RF、ESR及CRP异常无相关性。结论：RA患者血清中人及猪Ⅱ型胶原抗体水平升高，可能在RA的发病中起着一定的作用，但RA患者Ⅱ型胶原抗体阳性与疾病活动指标无明显相关，不能作为监测RA活动的指标。     

软骨细胞培养过程中细胞反分化的研究

软骨细胞化生与反分化是关节软骨损伤病理及修复过程中的重要现象,本文主要是研究培养软骨细胞的反分化现象。结果显示:(1)培养的软骨细胞有反分化,传至4代时多数细胞由园形变为棱形,硫酸软骨素丧失。(2)反分化为一渐进过程,传代时,以Ⅱ型胶cDNA探针与培养细胞mRNA原位杂交证明细胞内Ⅱ型前胶原渐减少;Ⅲ型胶原单抗荧光染色显示Ⅲ型胶相反渐增多。(3)Ⅱ、Ⅲ型胶原抗体对培养的软骨细胞有抑制合成DNA、粘多糖及胶原的作用。     

健康中国人股骨头软骨下骨及股骨头缺血性坏死软骨下骨胶原、蛋白聚糖含量的测定及意义

作者对２０例健康中国人股骨头软骨下骨及２０例股骨头缺血性坏死股骨头软骨下骨的胶原及蛋白聚糖的含量进行了测定及比较，确立了健康中国人股骨头软骨下骨胶原及蛋白聚糖的正常参考范围，为研究疾病状态下股骨头软骨下骨胶原及蛋白聚糖含量的变化提供了正常参数。同时，通过对股骨头缺血性坏死的股骨头软骨下骨的胶原和蛋白聚糖的定量分析，进一步弄清了股骨头缺血性坏死过程中的病理改变基础，发现了股骨头缺血性坏死后软骨下骨胶原及蛋白聚糖均降低，骨修复机能减弱这一代谢的基本病理变化。