肿瘤坏死因子α调控启动子活性促进netrin-1的表达

目的 探讨TNF-α对netrin-1基因表达的影响,并对其调控机制作初步研究。方法 使用RT-PCR和Western blot方法检测TNF-α对netrin-1表达影响。PCR反应克隆出netrin-1启动子序列,构建pGL3-netrin-1-promoter荧光素酶报告基因表达载体。转染HEK-293A细胞检测荧光素酶活性。观察细胞因子TNF-α对netrin-1转录水平的表达调控。结果 首先证实了TNF-α能够上调Netrin-1的表达。其次成功构建pGL3-netrin-1-promoter荧光素酶表达载体,测序正确,然后利用双荧光素酶报告基因系统证实构建的报告基因载体启动子具有活性。发现肿瘤坏死因子TNF-α可以使netrin-1启动子活性显著增加 (P<0.05),TNF-α以剂量和时间依赖方式调节netrin-1启动子的活性。结论 细胞因子TNF-α可能通过调控启动子的活性而调节netrin-1的表达。     

小鼠肿瘤坏死因子α启动子荧光素酶表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)启动子荧光素酶表达载体.方法 利用PCR技术扩增小鼠TNF-α启动子序列,将其插入荧光素酶表达载体pGL3-basic中.将经过鉴定的重组载体pGL3-TNFα-promoter转染巨噬细胞264.7,应用萤光素酶检测系统检测其活性.结果 测序结果 表明,扩增的启动子序列正确.荧光素酶活性检测表明,pGL3-TNFα-promoter具启动荧光素酶基因表达的活性.结论 成功构建小鼠TNF-α启动子荧光素酶表达载体pGL3-TNFα-promoter,为进一步研究TNF-α奠定了物质基础.     

GPC3启动子报告基因载体构建与转录活性分析

目的 构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)启动子荧光素酶报告基因载体,并验证其转录活性.方法 以人类基因组DNA为模板,PCR扩增GPC3启动子基因片段,克隆到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体上,通过转染HepG2细胞检测荧光素酶活性来验证GPC3启动子的转录活性.结果 GPC3基本启动子和全长启动子分别成功构建到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体中,GPC3基本启动子具有很强的转录活性,而全长启动子的转录活性比基本启动子高4倍以上.结论 成功构建了GPC3启动子荧光素酶报告基因载体,为研究GPC3转录调控提供了重要手段.     

人细胞表面黏附分子P选择素启动子报告基因的构建及鉴定

目的构建人细胞表面黏附分子P选择素（p-selectin）基因启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,检测其 转录活性,并应用于筛选药物对其转录活性的影响。方法根据UCSC软件查找的人基因组DNA的p-selectin启动子序列并设 计两端引物,扩增人基因组DNA中的p-selectin启动子。用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pGL3-Basic和p-selectin启 动子后,将p-selectin基因启动子插入到pGL3-basic报告基因载体上。重组质粒命名为pGL3-pselectin-promoter。将其与内参 质粒pRL-SV40瞬时共转染293F细胞,检测双荧光素酶活性。对不同启动子片段长度的p选择素报告基因进行双荧光素酶的 检测。以炎症因子和药物分组刺激转染了报告基因质粒的293F细胞并检测双荧光素酶活性。结果成功构建p-selectin基因启 动子荧光素酶报告基因载体pGL3-pselectin-promoter,质粒酶切及测序结果完全正确。瞬时共转染pGL3-pselectin-promoter/ pRL-SV40 组荧光素酶活性为0.8573±0.4703,高于转染pGL3-Basic/pRL-SV40 组的荧光素酶活性值0.03955±0.05894。 pGL3-1826 bp相比较于pGL3-1092 bp组和pGL3-3738 bp组具有最强的转录活性。炎症因子LPS和TNF-α和药物As2O3均具 有上调pGL3-pselectin-promoter转录活性的作用。结论pGL3-pselectin-promoter在293F细胞中能被转录激活,并验证了炎症 因子对其转录表达的作用,并为药物筛选与评价提供解决方案。     

人 PDCD4启动子真核报告质粒的构建和鉴定

目的  克隆人程序性死亡因子4(PDCD4)基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并在细胞内检测其活性,为进一步研究PDCD4表达调控奠定基础。方法  采用PCR技术,从人基因组DNA中扩增出PDCD4启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL4-Basic中,测序所扩增的DNA序列,并将构建的pGL4-PDCD4-P1荧光素酶报告质粒,与内参照pRL-TK用脂质体法瞬时共转染OVCAR3,SKOV3细胞系,通过双荧光素酶活性检测确定其启动子活性。结果  测序结果表明,扩增的PDCD4启动子序列正确,pGL4-PDCD4-P1转染OVCAR3细胞(高表达内源性PDCD4) 24h后,双荧光素酶活性检测显示其启动子相对活性约为pGL4-Basic空载体的67倍;而pGL4-PDCD4-P1转染低表达内源性PDCD4的SKOV3细胞后相对活性约为15倍。结论  成功构建了PDCD4启动子的克隆及人PDCD4启动子报告基因,为后续研究奠定了基础。     

HMGB1启动子荧光素酶报告基因的构建及鉴定

目的：构建高迁移率族蛋白B1（HMGB1）启动子驱动的荧光素酶报告基因的真核表达载体pGL3-HMGB1P,转染肺泡上皮细胞（A549）后检测报告基因在机械牵张刺激中的转录活性.方法：以A549细胞基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增HMGB1启动子片段,测序正确后克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3,将重组质粒pGL3-HMGB1P导入A549细胞,检测不同强度机械牵张（分别为5%和20%）刺激下荧光素酶的活性变化.结果：PCR和测序结果表明扩增的HMGB1启动子序列正确,酶切检测证实重组真核表达载体pGL3-HMGB1P构建成功.在5%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的2.9倍（P〈0.05）;而在20%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的6.2倍（P〈0.01）.结论：利用荧光素酶报告基因系统证实机械牵张可诱导HMGB1转录表达增加,为深入研究HMGB1转录表达的调控机制提供了基础.     

基于报告基因系统的肝细胞核因子4α活性检测体系的建立

目的 建立一个基于荧光素酶报告基因系统的肝细胞核因子4α(HNF4α)活性检测系统,筛选可调控HNF4α活性的小分子化合物.方法 采用亲和层析法纯化HNF4α蛋白,行蛋白热迁移实验检测相关DNA片段及小分子化合物与HNF4α蛋白的直接相互作用.分别构建含有3个拷贝和9个拷贝的Ninjurin 1(NINJ1)基因启动子区HNF4α反应元件的荧光素酶报告基因质粒pGL3-NINJ1-3p和pGL3-NINJ1-9p,转染肝癌细胞,采用荧光素酶报告基因法检测肝癌细胞内HNF4α转录活性的改变,qPCR检测小分子化合物木犀草素或阿尔维林处理后肝癌细胞中HNF4α及下游基因的表达情况,荧光素酶报告基因法检测小分子化合物处理后细胞内HNF4α转录活性的改变.结果 蛋白热迁移实验证实,NINJ1基因启动子区HNF4α的DNA结合片段可与HNF4α蛋白结合.在过表达HNF4α的肝癌细胞中,pGL3-NINJ1-3p和pGL3-NINJ1-9p均可检测到肝癌细胞中HNF4α活性的改变,且pGL3-NINJ1-9p较pGL3-NINJ1-3p的检测灵敏度更高(P＜0.01).木犀草素和阿尔维林与HNF4α蛋白存在直接相互作用,分别下调和上调HNF4α靶基因;pGL3-NINJ1-9p可检测到木犀草素和阿尔维林对HNF4α转录活性的影响.结论 利用报告基因载体pGL3-NINJ1-9p成功建立了HNF4α活性的检测系统,为筛选调控HNF4α活性的小分子化合物等提供了基础工具.     

人支气管上皮细胞中苯并芘诱导TNF-α表达的分子机制

目的：构建肿瘤坏死因子-α（TNF-α）启动子双荧光素酶报告基因载体,研究苯并芘（B[a]P）暴露对TNF-αm RNA表达的调控机制。方法：采用Real time-PCR技术检测B[a]P暴露下,人支气管上皮细胞（Beas-2B）中TNF-αm RNA随时间的变化趋势。通过分子克隆技术构建TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体并检测其活性。进一步检测Beas-2B细胞和人肾上皮细胞293T细胞暴露于B[a]P环境下,TNF-α启动子活性的变化趋势。结果：Real time-PCR检测B[a]P暴露下,24 h内,Beas-2B细胞中TNF-αm RNA表达量随时间延长升高。且B[a]P刺激Beas-2B细胞24 h内,TNF-α启动子活性也呈升高趋势。B[a]P刺激293T细胞,TNF-α启动子活性也会升高。结论：成功构建了TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体。而且,B[a]P能够促进TNF-αm RNA的转录从而促进TNF-αm RNA的表达,且promoter1要比promoter2活性强,没有细胞特异性。     

大鼠GLUT3基因启动子区荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的:克隆大鼠葡萄糖转运体3(glucose transporter 3,GLUT3)基因启动子区,并构建其萤火虫荧光素酶报告基因载体。方法:在对大鼠GLUT3基因5′侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从大鼠基因组中扩增出GLUT3基因5′侧翼区-1037～155bp段长为1 292bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1),再用定向克隆的方法将这一启动子区片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-basic)中,构建出包含大鼠GLUT3基因启动子区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-GLUT3),电泳与测序鉴定,最后再将pGL 3-GLUT3与内参pRL-TK用脂质体转染的方法瞬时共转染PC12和原代培养的神经元中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定pGL 3-GLUT3的启动子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染pGL3-basic与内参pRL-TK。结果:构建出荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3。与转染空质粒pGL3-basic组相比,原代神经细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性升高(5.182 9±0.264 8 vs 2.893 1±0.775 4,P=0.008),在PC12细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性也升高(2.797 7±0.512 0 vs 1.179 8±0.312 5,P=0.010)。结论:成功克隆GLUT3基因启动子区,并构建出包含GLUT3基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体,并且在PC12和原代培养的神经元中pGL 3-GLUT3可以表现出启动子活性。这为后续大鼠GLUT3基因转录调控研究提供研究素材。     

抑癌基因BRCA1启动子荧光素酶报告基因的构建及活性测定

目的:克隆人BRCA1基因的启动子,构建荧光素酶报告基因载体,并在细胞内检其活性,为其后续基因凋控研究提供依据。方法:采用PCR技术,从人正常宫颈组织细胞中扩增出BRCA1启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,测序所扩增的DNA序列,将其转染入HCT 116细胞中并检测其活性。结果:酶切及基因测序方法证实所构建质粒含有pGL3-basic全序列及BRCA1启动子上游调控序列,扩增的BRCA1启动子序列正确;双报告基因实验检测荧光素酶活力表明,p53缺失的HCT116细胞中BRCA1启动子明显增加（P<0.05）,构建的报告基因具有启动子活性。结论:克隆BRCA1启动子及成功构建人BRCA1启动子报告基因,可实现快速、经济和准确地克隆已知基因启动子分子和构建启动子载体的目的。     

β1整合素启动子荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的克隆β1整合素(CD29)启动子区基因全长序列,构建并鉴定β1整合素启动子全长序列荧光素酶报告基因载体pGL3-β1。方法以含β1整合素启动子基因全长序列的基因片段(2 735 bp)的重组pGEM-T easy载体为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1启动子基因全长序列1 756 bp,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-basic,构建含正确目的基因的表达载体pGL3-β1,并NheⅠ、XhoⅠ酶切、PCR及测序鉴定;并以该质粒转染人表皮细胞株HaCaT进行活性检测。结果酶切、PCR及序列测定表明,克隆获得的1 756 bp与GenBank DNA序列数据库对比分析序列一致,插入方向正确;且pGL3-β1启动子在人表皮细胞株HaCaT中有明显转录活性。结论成功构建了β1整合素启动子基因全长序列荧光素酶报告基因载体,为下一步研究人β1整合素启动子的活性分析、基因表达调控机制及其信号转导通路等研究奠定基础。     

人源DNMT1基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及其活性检测

目的:利用PCR扩增人源DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体并对其活性进行检测。方法:运用PCR技术以人非小细胞肺癌细胞A549基因组DNA为模版扩增出目的片段,将PCR产物用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic上,然后进行转化、菌落PCR及测序验证等。将构建成功的pGL3-proDNMT1-luc重组质粒和内参质粒pRL-CMV-luc共转入H1299细胞中检测DNMT1启动子活性。结果:成功扩增出长度为1634 bp的目的片段,并成功构建出DNMT1启动子荧光素酶报告基因载体,启动子具有活性。结论:DNMT1启动子的成功克隆为进一步研究其分子调控机制和生物学意义奠定了基础。     

小鼠巨噬细胞活化标志物IL-12/IL-10启动子荧光素酶报告基因模型的构建及鉴定

目的:构建pGL3-IL-12p40promoter和pGL3-IL-10promoter两个荧光素酶报告基因载体,并对其进行生物活性鉴定。方法:通过提取小鼠T细胞基因组DNA,分别PCR扩增IL-12p40和IL-10基因的启动子序列,与pGL3-Basic连接成重组体pGL3-IL-12p40promoter和pGL3-IL-10promoter,通过转化扩增,筛选出阳性克隆,并通过酶切、测序及生物学活性检测鉴定构建好的荧光素酶报告基因载体。结果:成功构建了pGL3-IL-12p40promoter和pGL3-IL-10promoter两个荧光素酶报告基因载体,分别在IFN-γ或IL-4的诱导下,能启动细胞内荧光素酶的表达。结论:pGL3-IL-12p40promoter和pGL3-IL-10promoter的荧光素酶报告基因载体的成功构建为研究IL-12和IL-10蛋白的表达调控机制和以IL-12/IL-10为检测指标的巨噬细胞活化状态的判断,以其为靶标的抗肿瘤药物的快速高通量筛选提供了重要的研究工具。     

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性.方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果 成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性.结论 成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础.     

人β1整合素近端和远端启动子报告基因载体的构建和鉴定及启动活性分析

目的：克隆整合素β1近端启动子和远端启动子基因序列，构建并鉴定整合素β1启动子调控的荧光素酶报告基因载体pGL3—261和pGL3—1442。方法：以本室构建的含整合素β1全长启动子基因序列（1756bp）的重组载体pGL3—β1为模板，用含有酶切位点的特异性引物扩增出整合素β1近端和远端启动子基因序列，克隆至荧光素酶表达载体pGL3-basic，构建含正确目的基因的表达载体pGL3—261和pGL3—1442，经Nhe I、Xho I酶切、聚合酶链式反应（PCR）扩增及测序鉴定；并用pGL3—261和pGL3—1442质粒与pGL3—β1质粒同时转染人表皮细胞株HaCaT进行活性分析。结果：酶切及序列测定表明，克隆获得的近端启动子261bp和远端启动子1442bp与GenBankDNA序列数据库对比分析序列一致，且插入方向正确；此三种质粒都有明显的启动子活性，远端启动子活性与全长启动子活性无显著差异，但明显高于近端启动子活性。结论：成功构建了整合素B1近端和远端启动子基因序列荧光素酶报告基因载体，整合素β1远端启动子在HaCaT细胞中起主要作用。为下一步研究人整合素β1启动子核心区、基因表达调控机制及其信号转导通路等奠定基础。     

小鼠PGC-1α基因启动子的转录调控功能分析

目的 克隆小鼠PGC-1α基因的启动子并分析其转录调控模式.方法 设计引物,以小鼠肝脏组织DNA 为模板,PCR扩增PGC-1α基因启动子区并克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic 中,构建具有PGC-1α启动子转录活性的报告质粒pGL3-PGC-1α-Luc.通过特异性引物,引入替换碱基突变相关转录因子调控模序,构建点突变融合载体,并将其转染1c1c7 及c2c12 细胞系,检测荧光素酶的表达情况.结果 构建的pGL3-PGC-1α-Luc 系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA 测序分析都显示正确;PGC-1α基因启动子区域（-2533~＋78）具有较强的转录活性;突变失活PGC-1α基因启动子区域中的CRE及IRE反应原件导致转录活性明显降低.结论 成功构建小鼠PGC-1α基因启动子报告质粒,PGC-1α基因上游区域（-2533~＋78）具有较强的启动子活性;启动子区域中的CRE和IRE反应原件为主要转录调控位点.     

IDO启动序列GAS和ISRE荧光素酶报告基因载体构建及其活性检测

目的构建pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS两个荧光素酶报告基因载体,并对其进行生物活性鉴定。方法通过人工合成调控吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）表达的启动序列ISRE4（4个串联的ISRE序列）和GAS7（7个串联的GAS序列）,与pGL3-Enhancer连接成重组体pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7,通过转化扩增,筛选出阳性克隆,并通过酶切、测序及生物学活性检测鉴定构建好的荧光素酶报告基因载体。结果成功地构建了pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7两个荧光素酶报告基因载体,在IFN-γ的诱导下,能启动细胞内荧光素酶的表达。结论 pGL3-Enhancer-ISRE4和pGL3-Enhancer-GAS7的荧光素酶报告基因载体的成功构建为研究IDO蛋白的表达调控机制和以IDO为靶标的抗肿瘤免疫耐受药物快速高通量的筛选提供了重要的研究工具。     

人SAMHD1基因核心启动子区域的初步鉴定和分析

目的 鉴定人不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1 (SAMHD1)基因的核心启动子区域,研究SAMHD1的转录调控机制.方法 从HepG2细胞中提取基因组DNA,PCR扩增SAMHD1基因翻译起始位点上游937、667、553、399 bp片段.将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体,双酶切鉴定后将DNA条带切胶回收,再连入pGL3-Basic载体中,双酶切及DNA测序鉴定.将包含有4个片段的荧光素酶表达载体与pRL-TK共转染HepG2细胞,荧光素酶报告基因活性检测并分析4个片段的启动子活性.5'RACE鉴定SAMHD1在HepG2细胞中的转录起始位点.结果 电泳结果显示已经从HepG细胞中提取出基因组DNA.PCR扩增后电泳结果显示已经扩增出937、667、553、399 bp片段.双酶切后电泳结果显示成功将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体.双酶切及DNA测序鉴定已成功构建荧光素酶表达载体pGL3-937、pGL3-667、pGL3-553和pGL3-399.荧光素酶报告基因活性检测显示SAMHD1核心启动子区域位于0～-399区域(ATG前一个碱基为-1).5'RACE结果显示SAMHD1在HepG2细胞中转录起始位点位于-101.结论 SAMHD1的核心启动子位于翻译起始位点上游-101～-399区域,为深入研究肝细胞中SAMHD1转录调控机制奠定了基础.     

人参皂苷Rb1对NEP基因启动子活性的影响

目的 构建NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒,探查神经内肽酶(NEP)基因启动子中与人参皂苷Rb1影响NEP启动子活性有关的位点。方法 用NEP基因5′上游启动区2.4kb片段和荧光素酶报告基因载体pGL3-basic构建NEP启动子-荧光素酶报告基因质粒pGL3-nep2.4;用Erase-a-Base System对pGL3-nep2.4质粒2.4kb DNA插入片段5′端进行缺失,构建NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒;用Rb1处理NEP启动子缺失体转染的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,检测双荧光素酶活性,观察Rb1对NEP启动子活性的影响。结果 成功构建了含NEP启动子DNA序列的重组质粒pGL3-nep2.4。荧光素酶活性检测显示,转染pGL3-nep2.4质粒的SH-SY5Y细胞荧光素酶活性是转染pGL3-basic的13.1倍(P<0.01)。Rb1处理可使转染pGL3-nep2.4质粒的SH-SY5Y细胞荧光素酶活性增加,其是对照组的2.9倍(P<0.01);细胞荧光素酶活性检测亦显示,NEP基因上游启动区-894~-857bp(Region Ⅰ)及-100~-82bp(Region Ⅳ)片段缺失后,启动子活性分别是缺失前的29%(P<0.01)和25%(P<0.01),-559~-534bp(Region Ⅱ)及-223~-179bp(Region Ⅲ)片段缺失后,启动子活性分别是缺失前的5.12倍(P<0.01)及1.81倍(P<0.01)。Rb1处理后,RegionⅠ、Ⅱ和Ⅲ缺失体质粒转染细胞荧光素酶活性均与对照组无统计学差异(P>0.05),Region Ⅳ缺失质粒pGL3-226转染细胞荧光素酶活性也与对照组无明显差异(P>0.05),而含Region Ⅳ质粒pGL3-244转染细胞荧光素酶活性则是对照组的1.61倍(P<0.01)。结论 NEP基因5′上游2.4kb DNA片段有较强的启动子活性,Rb1能明显增加其活性。NEP基因2.4kb DNA片段有2个正调控区(RegionⅠ和Region Ⅳ)和2个负调控区(RegionⅡ和Region Ⅲ),Rb1通过Region Ⅳ发挥正调控作用。     

MDR1启动子的活性研究

目的:克隆编码多药耐药基因-1（MDR1）中不同长度的启动子片段并探讨和比较其在乳腺癌细胞中的转录活性。方法: 利用PCR扩增技术以MCF-7/ADR细胞基因组为模板克隆3种不同长度的启动子片段。pGL3-basic的启动区域中,构建一系列报告基因载体pGL3-MDR1Pn。以pGL3-control为阳性对照,分别将含不同长度的MDR1启动子的报告基因载体pGL3-MDR1Pn与pRL-TK以一定比例共转染到敏感的MCF-7细胞和耐阿霉素的MCF-7/ADR细胞,通过分析表达的荧光素酶的活性从而比较不同长度的启动子片段在这两种细胞中的转录活性。结果:通过酶切鉴定和测序验证了已将不同长度的MDR1启动子片段成功插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,且克隆的片段中没有出现碱基突变。将表达载体转染细胞后活性检测结果显示pGL3-MDR1P1、pGL3-MDR1P2和pGL3-MDR1P3在MCF-7中活性分别为阳性对照的(13.03 2.35)%、(14.60 3.57)%和(10.27 1.89)%;而在MCF-7/ADR中活性分别为阳性对照的(105.26 6.84)%、(59.08 4.95)%和(62.39 5.76)%。结论:成功克隆了MDR1启动子片段,并成功构建了荧光素酶报告基因载体pGL3-MDR1P。启动子的活性分析结果初步表明长度约为2 000 bp的MDR1P1在MCF-7/ADR中具有相对较高的特异性。