生米卡链霉菌DNA对北里链霉菌原生质体种间转化

采用SDS-苯酚法提取生米卡链霉菌DNA,同时以SDS处理生米卡链霉菌原生质体得到游离DNA。将提取DNA及游离DNA转化北里链霉菌原生质体,得到10~(-2)的转化率。转化子经发酵得柱晶白霉素,其产量比亲本高5.2倍,同时发现组份亦有所变化,A_5组份从9.1％提高到36.7％。     

链霉菌启动子的克隆和抗生素的产生

用启动子探针质粒pIJ486作载体,变青链霉菌TK24作受体,克隆来自金霉素链霉菌UK81的启动子,得到了三个转化子。其中转化子变青链霉菌TK24(pTA1)是含高活性外源启动子的重组子。而变青链霉菌TK24(pTA5)和变青链霉菌TK24(pTA7)中的外源启动子活性很低,但变青链霉菌TK24(pTA7)产生了新抗生素。其抗菌谱与供体金霉素链霉菌UK81的不同,当重组质粒,pTA7再转化金霉素链霉菌UK81时,得到的再转化子的抗菌谱仍与金霉素链霉菌UK81相同,但再转化子的抗生素产生被促进。经高压电泳和薄层层析表明,变青链霉菌TK24(pTA7)产生的胞内抗生物质为两种成份。金霉素链霉菌UK81(pTA7)和金霉素链霉菌UK81产生的抗生素成份相同而与变青链霉菌TK24(pTA7)产生的不同。实验得到的三个重组质粒pTA1、pTA5和pTA7上的插入片段大小分别为2.7kb、3.75kb和2.2kb。     

链霉菌启动子DNA片断的克隆

发展链霉菌宿主载体系统有可能进行抗生素耐药性,抗生素生物合成和各种酶基因的克隆。由于这类微生物染色体DNA的G+C含量很高,引起了人们对被克隆基因转录调节区的极大兴趣。为了克隆含有启动子的DNA片断,所以组建了许多启动子探针载体。详细分析几种启动子,表明它们在—10区域存在着共同的碱基顺序。     

生米卡链霉菌与北里链霉菌种间原生质体融合重组的研究

生米卡链霉菌和北里链霉菌用42％PEG4000做助融剂进行多配对原生质体种间融合,融合率为10~(-2)。同时,进行了UV灭活亲株的种间融合,融合率也为10~(-2)。采用液体培养基再生,表观融合率达10~(-1)。随机挑选形态各异的一定数量的融合子作产物分析,发现它们产生柱晶白霉素,总效价比直接亲本高5.9倍,比间接亲本高27％。高效液相色谱测定表明A_5组份从9.1％提高到43.4％。     

生米卡链霉菌启动子的克隆和表达

用高拷贝启动子探针质粒pIJ486为载体,变青链霉菌(S.lividans)TK24为受体,克隆并表达了生米卡链霉菌(S.mycarofaciens)的启动子,得到了对新霉素抗性不同的5个转化子。其中对新霉素有高抗性的转化子中重组质粒pIJM2的插入片段约为2kb,将 pIJM2转化生米卡链霉菌SM90919原生质体,得到新的转化子SM9pM201和SM9pM205,从SM9pM205菌株中分离到的质粒要比pIJ486和pIJM2小,约3.5kb。     

头状链霉菌中丝裂霉素C抗性基因mcrAB的克隆及其作用研究

丝裂霉素 C属于苯醌类抗肿瘤抗生素 ,在生物体内作为前药 ,经酶催化还原后可阻碍 DNA的复制。我们从头状链霉菌中克隆出丝裂霉素 C抗性基因 mcr AB,测序结果与另一丝裂霉素产生菌—淡紫灰链霉菌的 mcr AB基因序列进行了比较 ,结果表明此序列是高度保守的。同时还构建了带有 mcr AB基因的质粒载体 p YG2 0 6 ,将 p YG2 0 6用原生质体转化法导入变青链霉菌 TK6 4 ,并在此菌中表达 ,大大提高了该菌对丝裂霉素 C的抗性。进一步研究表明 :在有氧条件下 ,mcr AB基因表达的蛋白可抑制菌体对丝裂霉素 C的转化作用。     

链霉菌噬菌体1010和P13启动子在大肠杆菌中的克隆和表达

将螺旋链霉菌噬菌体1010和红霉菌噬菌体P13的San3A和HindⅢ酶切片段分别插入启动子探测质粒pGA46的BgIⅡ和HindⅢ位点,在大肠杆菌中获得了氯霉素抗性、四环素抗性的重组质粒。限制性内切酶酶切产物的电泳分析和DNA分子杂交分析结果表明重组质粒确由载体pGA46和噬菌体酶切片段连接而成。以限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、SolⅠ等对重组质粒进行酶切分析,并应用限制性内切酶和核酸酶BAl-31酶切重组质粒pSS31中的噬菌体DNA插入顺序。得到分子量由1.2Kb缩短至0.25Kb而仍保留启动子功能的片段,用大肠杆菌的启动子探测质粒pGA46作为载体分别克隆于San3A和HindⅢ酶切的大肠杆菌的启动子和探测质粒,在含有抗生素的培养基上分别选择T_c~r和C_m~r转化子。     

生米卡链霉菌麦迪霉素抗性基因的克隆

应用碱性裂解法提取质粒载体pIJ61和pIJ702,并通过氯化铯—溴化乙锭密度梯度离心纯化,得到了较好的结果。对TK64、TK24、TK23和JI1326四个受体菌作麦迪霉素抗性基因克隆,结果只有TK24对麦迪霉素敏感。 用Bam HI酶切质粒pIJ702,并通过碱性磷酸酶去除磷酸根。生米卡链霉菌的"total"DNA用MboI部分酶切,得到1～8kb大小的DNA片段,1μgBam H1酶切pIJ702DNA和5μgMbo1部分酶切的染色体DNA片段通过T4-DNA连接酶连接,转化变铅青链霉菌TK24原生质体,在R_2YE平板上再生,经过硫链丝菌素和麦迪霉素筛选,得到8个抗性转化子,进一步复证发现pIJ702-5的抗性最强,pIJ702-7的抗性最弱,并且它们在基本培养基上产生的色素也不同。 提取抗性转化子重组质粒,通过再转化实验进一步证实在杂合质粒上确实含有麦迪霉素的抗性基因。将重组质粒转化麦迪霉素产生菌—生米卡链霉菌63的原生质体,经过再生、筛选、得到9个转化子。对转化子进行发酵实验,发现它们的发酵效价与原始菌株相比,有明显的变化。     

国产和日本产柱晶白霉素与其它常用抗生素的体外抗菌活性比较

用试管双倍稀释法测定国产与日本产柱晶白霉素对104株革蓝氏阳性球菌的体外抗菌活性并与9种常用抗生素进行比较。结果表明:国产和日本产柱晶白霉素对革蓝氏阳性球菌的抑菌率基本一致。国产柱晶白霉素的抑菌、杀菌作用强于红霉素;略优于氯霉素和四环素;与青霉素G、庆大霉素基本相似,但不及氨苄青霉素、苯唑青霉素、丁胺卡那霉素及强力霉素。     

柱晶白霉素产生菌的诱变育种和发酵研究

柱晶白霉素产生菌经常规诱变及原生质体多次再生处理，获菌株９１－９１１，其产量比原始菌株提高了３５倍以上；清除了原菌株的菌丝毒性；主组分Ａ５含量也有明显增加。为充分发挥９１－９１１菌株的生产潜力，采用均匀设计方法对发酵培养基进行优化，获得ｂ培养基。９１－９１１菌株用６培养基在２００Ｌ、１０ｔ规模发酵罐上试验，证实９１－９１１菌株确是一株高产稳产的优良生产菌种。     

吸水链霉菌应城变种质粒的分离研究

采用蔗糖浓度为13％的YEME培养基培养吸水链霉菌应城变种10-22菌株,能获得生长量较高且分散状况良好的菌丝体。在探索链霉菌质粒DNA的分离方法时,以T.Kieser的方法为基础,提高国产溶菌酶的用量和延长酶解时间,首次从吸水链霉菌应城变种中分离到一种质粒DNA分子,将它命名为pSH_(47)。同时,通过pock形成能力的检测。进一步证实这个质粒的存在。吸水链霉菌应城变种10-22菌株经吖啶橙处理后获得的部分或全部丧失5102抗生素生物合成能力的几个阻遏突变株的质粒检测结果表明,它们都有与10-22菌株相同的质粒带。     

柱晶白霉素及其制剂的有效期预测方法的探讨

本文通过多组分抗生素降解动力学方程的推导,表明在一般情形下,多组分抗生素的效价变化不能表达为简单级数反应,因此不能用一般动力学方法预测有效期。将初均速法用于含8个以上组分的柱晶白霉素及其制剂的有效期预测,结果与留样考察相近。     

链霉菌产生的新型纤溶酶的纤溶性质和溶栓作用

目的旨在进一步确证纤溶活性的蛋白酶SW-1的溶栓作用和性质。用体外加热平板法、试管凝块法和在体内对大鼠静脉血栓溶解及对纤溶因子的作用等实验,发现SW-1在体外可直接降解纤维蛋白,而无激活纤溶酶原的作用。在体内,SW-1对大鼠静脉血栓有显著的溶解效果,与同剂量尿激酶的溶栓作用相当。给药(iv)30min后,SW-1引起大鼠血浆中纤溶酶、纤溶酶原水平提高,纤维蛋白原水平下降,而对组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、α₂-纤溶酶抑制剂无显著影响。提示SW-1是一种具有纤溶活性的蛋白酶,而不是纤溶原激活剂。     

MALEYLATION AND PH-DEPENDENCE OF STREPTOMYCES GRISEUS PROTEASE B

The enzymatic activity of Streptomyces griseus protease B (SGPB) was measured over pH range 8.4–11.5 using a specific new, chromophoric substrate N-succinyl-glycyl-glycyl-l -phenylalanine p-nitroanilide. It was found that the activity is dependent on ionization of a single group with apparent pK = 10.84, possibly lysine-125. Maleylation of the ?-amino group of this lysine was linearily associated with the loss of enzymatic activity. It is therefore suggested that the electrostatic interaction between the side chain of lysine-125 and the α-carboxyl group of the the C-terminal tyrosine is crucial to the active conformation of the enzyme. In contrast the maleylation of the α-amino group of the N-terminal isoleucine was rapid but could not be correlated to the loss of activity.     

国产柱晶白霉素的临床效果探讨

选择呼吸道、尿道、口腔、耳等部位感染及钩体病非重症者70例(病原学阳性75.7％)。随机以国产柱晶白霉素治疗40例及红霉素治疗30例对照观察。柱晶白霉素组420mg一日三次。3～21日痊愈～显效率76％,无效12.5％,清除革兰氏阳性球菌为90.1％,且对耐红霉素者多敏感,而革兰氏阴性杆菌耐药,对淋球菌效果差,仅有消化道反应7.5％。红霉素组375mg,一日三次,3～30日痊愈～显效率77.4％,无效9.7％,清除革兰氏阳性球菌81.3％,对丙型链球菌和淋球菌效果差,消化道反应为23.3％。显示柱晶白霉素是一种安全、有效的抗生素,特别适于门诊应用。