CDMP1转基因间充质干细胞片修复兔软骨缺损

目的 探讨软骨源性形态发生蛋白-1(CDMP-1)转基因细胞片修复兔软骨缺损的能力.方法 腺病毒转染CDMP1基因至第4代兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)中,连续培养7～14 d后接种至温度敏感性培养皿中制备细胞片,real time PCR和Western blot法检测转基因细胞片的CDMP1及Ⅱ型胶原蛋白表达;用细胞片工程技术构建组织工程化细胞片并移植入兔甲状软骨缺损处修复软骨缺损.实验分:1)BMSCs细胞片组;2)转染As-CMV-eGFP细胞片组;3)转染As-CMV-hCDMP1-IRES-eGFP细胞片组.分别于术后4和8周检测工程化软骨的Ⅱ型胶原蛋白及蛋白多糖(GAG)表达.结果 检测到转基因细胞片中CDMP1的表达;所获得的工程化软骨免疫组化和阿利新蓝染色显示:A组Ⅱ型胶原蛋白和GAG表达阳性,B组和C组Ⅱ型胶原蛋白和GAG表达阴性(P＜0.05).结论 CDMP转基因细胞片具有较好的软骨分化活性,可有效地修复兔喉软骨缺损.     

CDMP和TGF联合诱导BMSCs修复软骨缺损

目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)在软骨源性形态发生蛋白1(CDMP1)和转化生长因子-β(TGF-β1)联合诱导前后成软骨能力的差异.方法 采用免疫组织化学和阿新蓝染色的方法,检测BMSCs与聚乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA)构筑的三维立体培养体系在CDMP1和TGF-β1联合诱导前后,产生特异性软骨基质Ⅱ型胶...     

重组hTGF-β1基因转染的BMSCs在体内成软骨能力的初步研究

目的重组hTGF-β1腺病毒(adeno-hTGF-β1)转染的BMSCs在体内成软骨能力的初步研究,探讨其作为组织工程化软骨的种子细胞的可行性。方法重组adeno-hTGF-β1转染猪BMSCs,酶联免疫吸附定量检测(ELISA法)重组腺病毒转染hTGF-β1蛋白的表达。然后消化收集重组腺病毒转染后的BMSCs,均匀接种于圆盘状PGA支架上,对照组转染adeno-LacZ,然后植入裸鼠背部皮下,在植入后第3周取材,分别行大体观察、组织学、II型胶原免疫组化和蛋白聚糖含量检测对形成组织进行评价。结果 ELISA结果显示adeno-hTGF-β1转染的BMSCs,其hTGF-β1表达量是转染adeno-lacZ 的BMSCs 2.65倍( P0.05)。植入裸鼠体内后3周取材,实验组HE染色观察可见有软骨形成,但较不均匀,并被纤维组织分割,形成的软骨组织区域可见软骨细胞包埋在软骨陷窝内;对照组可见仅有少量软骨形成,被大量的纤维组织和未降解的PGA支架包裹,实验组和对照组形成软骨占总组织百分比,分别为(41.83±4.64)%和(17.50±2.85)%,P0.05。Safranin’O染色显示,实验组形成的软骨组织区域都有被染成桔红色蛋白多糖类基质分泌,着色比对照组更深。实验组形成的软骨组织区域有大量棕黄色的II型胶原颗粒,而对照组仅有少量的棕黄色的II型胶原颗粒,实验组形成的软骨组织中的蛋白聚糖含量多于正常猪耳软骨。结论重组hTGF-β1腺病毒转染BMSCs作为种子细胞,在裸鼠体内能促使软骨组织形成,从而为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程应用中奠定了基础。     

基因转染间充质干细胞修复大鼠骨缺损及其生物力学研究

目的评价腺病毒介导的人BMP-2基因转染的间充质干细胞对长骨骨干节段性骨缺损的修复效果。方法:36只雄性Wistar大鼠随机分为3组,每组12只,采用单侧股骨缺损模型,分别植入下列同系细胞与胶原的复合物:(1)Adv-hBMP-2转染的间充质干细胞;(2)Adv-βgal转染的间充质干细胞;(3)未转染细胞。于术后2、4、6、8周行放射学检查,术后8周的标本行组织学检查及生物力学测试。结果放射学检查显示,Adv-hBMP-2转染组术后2周有明显骨痂形成,术后8周12例骨缺损中有10例愈合,其他2组骨缺损均未愈合,放射学评分低于Adv-hBMP-2转染组,差异有统计学意义。组织学分析表明,Adv-hBMP-2转染组术后8周骨缺损内有丰富的编织骨和板层骨,其他2组无明显骨痂或仅有少量骨形成。生物力学测试显示,Adv-hBMP-2转染组手术侧股骨的弯曲强度是对侧未手术股骨的85%±8%。结论Adv-hBMP-2基因转染的同系大鼠间充质干细胞可修复长骨干节段性骨缺损。     

多孔磷酸钙骨水泥与转染骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞复合修复股骨髁骨缺损

BACKGROUND: Bone morphogenetic protein (BMP) can improve the osteogenesis capacity of tissue-engineered bone. However, how to prolong BMP release is a key for constructing tissue-engineered bone. OBJECTIVE: To study the repair effect of porous calcium phosphate cement (CPC) with bone marrow mesenchymal stem cells transfected with BMP-2 gene on bone defects. METHODS: After modeling of bilateral femoral condyle bone defects, 12 model rabbits were given implantation of porous CPC with bone marrow mesenchymal stem cells transfected with BMP-2 on the left (experimental group) and given implantation of porous CPC with bone marrow mesenchymal stem cells on the right (control group). Bilateral femoral condyles were taken and analyzed histologically at 4 and 12 weeks after implantation. RESULTS AND CONCLUSION: Better osteogenesis including more newly formed bone tissues and faster scaffold absorption was observed in the experimental group compared with the control group at 4 and 12 weeks after implantation. The area of newly formed bone tissues at different time and rate of bone formation at 12 weeks were significantly higher in the experimental group than in the control group (P < 0.001, P < 0.05). These findings indicate that transfer of BMP-2 into bone marrow mesenchymal stem cells combined with porous CPC could increase repair of bone defects.     

人骨形态发生蛋白2基因重组腺病毒表达载体转染兔骨髓间充质干细胞*

背景：采用GatewayTM技术构建腺病毒载体,显著弥补了外源性细胞因子局部应用的缺陷。 目的：观察人骨形态发生蛋白2重组腺病毒表达载体(Ad-BMP-2/GFP)转染兔骨髓间充质干细胞后骨形态发生蛋白2的表达情况。 方法：密度梯度离心联合贴壁培养法,分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞;GatewayTM技术构建的Ad-BMP-2/GFP腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞。 结果与结论：RT-PCR检测转染诱导后的细胞表达成骨细胞特异性产物骨钙素;转染后兔骨髓间充质干细胞在mRNA水平和蛋白水平均有人骨形态发生蛋白2的表达。结果表明构建的Ad-BMP-2/GFP可高效转染兔骨髓间充质干细胞,骨形态发生蛋白2在细胞中能高效表达。     

重组hTGF-β1腺病毒转染BMSCs及对其增殖的影响

目的探讨携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(adeno-hTGF-β1)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)表达及对其增殖的影响。方法重组adeno-hTGF-β1转染猪BMSCs,转染72h后以酶联免疫吸附分析(ELISA)方法定量检测重组腺病毒转染后hTGF-β1蛋白的表达,MTT法测定水貂肺上皮细胞(MV-1-Lu)的生长抑制率,验证转染后所表达的hTGF-β1蛋白的生物学活性,及MTT法检测转染后对BMSCs增殖的影响。结果转染72h,BMSCs表达hTGF-β1蛋白量是转染Adeno-lacZ的BMSCs2.65倍(P<0.05);MV-1-Lu细胞生长抑制率测定显示BMSCs分泌的hTGF-β1蛋白有生物学活性,MTT法检测结果提示adeno-hTGF-β1转染BMSCs的增殖能力较对照组弱。结论转染重组adeno-hTGF-β1的BMSCs表达有生物学活性的hTGF-β1蛋白,hTGF-β1蛋白对BMSCs的增殖有一定的抑制作用。     

基因重组腺病毒载体与慢病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的对比北大核心

背景:腺病毒载体和慢病毒载体均是较好的组织工程基因载体,两者在介导骨形态发生蛋白2转染兔骨髓间充质干细胞中的差异尚待探究。目的:比较腺病毒和慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2转染体外培养兔骨髓间充质干细胞的转导效率、持续时间及外源基因表达差异。方法:将第5代兔骨髓间充质干细胞分3组培养,A组以腺病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2(Ad-EGFP/BMP-2)转染细胞,B组以慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2(Lenti-EGFP/BMP-2)转染细胞,C组为未进行转染。转染24 h、48 h、72 h、1周、3周,检测EGFP基因表达;转染72 h后,免疫组织化学观察细胞骨形态发生蛋白2的表达;转染后72 h、1周、3周,Western blot检测骨形态发生蛋白2蛋白表达。结果与结论:(1)转染24 h后,A、B组可见EGFP表达,A组明显强于B组;转染48 h后,A、B组荧光进一步增强;转染72 h后,A组荧光强度近高峰,B组荧光持续增强。转染1周后,A组荧光强度开始下降,B组荧光强度仍然增强。转染3周后,A组荧光强度明显下降甚至消失,B组荧光强度有所下降,但仍然保持一定的表达。C组在各时间点均无EGFP表达;(2)A、B组胞浆均呈骨形态发生蛋白2阳性表达,C组呈阴性表达;(3)转染72 h后,A组骨形态发生蛋白2蛋白表达量强于B组;转染1周后,A组表达下降,B组表达增强并强于A组;转染3周后,A组表达微弱,B组持续表达且明显强于A组;(4)结果表明,相对腺病毒载体,慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2基因转染兔骨髓间充质干细胞在表达持续时间上具有一定的优势。     

TGF-β1基因修饰的间充质干细胞/仿生基质材料复合移植修复兔关节软骨缺损

目的 :探讨转化生长因子 β1(TGF β1)基因转染间充质干细胞 (MSCs)能否提高关节软骨缺损的修复质量和远期疗效。方法 :把组织工程学与分子生物学有机结合 ,体外将具有促进MSCs增殖分化、抑制多种炎性介质活性及免疫排斥反应等多重生物学效应的TGF β1基因转入关节软骨组织工程首选种子细胞MSCs,并与涂覆多聚赖氨酸的聚DL乳酸可降解多孔仿生基质材料复合移植 ,修复同种异体兔关节软骨缺损。以单纯空载体转染MSCs为对照 ,通过组织学、电镜及免疫组化等方法检测。结果 :转基因细胞 /仿生基质材料体外复合培养扫描电镜观察证实TGF β1基因修饰的MSCs增殖分化活性明显优于对照组。体内实验组织学及透射电镜结果显示实验组新生组织为透明样软骨 ,关节面平整 ,软骨下骨完全再生 ,与宿主骨软骨结合紧密 ,未见免疫排斥反应 ;对照组则新生软骨质量欠佳 ,与宿主骨整合欠佳 ,有不同程度的免疫排斥反应。免疫组化结果显示转基因细胞可继续表达TGF β1至少 4周以上。结论 :利用分子组织工程学 ,使TGF β1持续高效发挥作用 ,使提高关节软骨缺损、特别是创伤和骨关节炎关节软骨缺损的修复质量和远期疗效成为可能。     

骨形态发生蛋白基因在骨组织工程领域的研究进展

运用基因增强的组织工程学技术修复骨缺损具有广阔的临床应用前景，骨形态发生蛋白基因是目前骨组织工程研究最重要的目的基因。如何选择合适类型的骨形态发生蛋白基因、基因转染载体、靶细胞、转染途径以及在缺损局部持续高效表达出具有生物活性的骨形态发生蛋白是目前亟待解决的关键问题。对以上各方面的最新进展进行了综述，并对今后的发展方向进行了展望。     

骨髓间充质干细胞用于软骨组织工程的研究进展

细胞移植技术治疗软骨损伤已成为一项新兴的组织工程学研究热点.骨髓间充质干细胞由于其具有扩增快、便于分离提纯、可以体外诱导分化成为软骨细胞的特性,有可能成为组织工程化软骨的新型种子细胞.随着骨髓间充质干细胞应用于软骨组织工程研究的深入,结合近年的研究文献和成果,就骨髓间充质干细胞的诱导微环境和诱导方式的研究进展进行综述,探讨骨髓间充质干细胞作为种子细胞在构建组织工程软骨中的优越性.     

慢病毒转染骨髓间充质干细胞在脊柱融合中的作用

目的 评价慢病毒转染的骨髓间充质干细胞诱导大鼠脊柱融合的能力.方法 构建携带骨形态发生蛋白2(BMP-2)的慢病毒并将其转染到骨髓间充质干细胞中,观察细胞的碱性磷酸酶染色和活性.并将转染的细胞移植到大鼠脊柱融合模型中,8周后处死大鼠,对其脊柱标本进行手触力学测试,Micro-CT扫描和组织学切片观察.结果 慢病毒转染细胞的碱性磷酸酶染色明显好于未转染细胞(3.2±0.4比1.1± 0.2,P＜0.05).转染的细胞移植到大鼠体内8周后,X线、Micro-CT、手触力学测试和组织学切片均显示转染的大鼠脊柱标本全部达到骨性融合.而未转染的大鼠脊柱标本均未融合.结论 慢病毒转染的骨髓间充质干细胞能够诱导脊柱融合,可作为基因载体工具用于脊柱融合.     

聚乙烯亚胺-蛋白纳米复合体转染蛋白进入骨髓间充质干细胞的应用研究

目的:探索纳米材料聚乙烯亚胺(PEI)携载不同分子量的蛋白质转染进人骨髓间充质干细胞(h BMSCs)的作用及优化其最佳配比条件。方法:利用物理化学作用构建6组PEI-DNase I(DNA酶I)复合体,运用激光散射技术初步摸索其最佳摩尔比,用透射电镜直观复原纳米-蛋白复合体外貌;同时,原代分离培养健康人的骨髓间充质干细胞并进行体外扩增,通过构建成功的4组PEI-GFP(绿色荧光蛋白)纳米蛋白复合体对h BMSCs进行转染,共聚焦荧光显微镜下观察荧光表达情况,再通过MTT法检测该复合体对细胞增殖的毒性影响,并用β-半乳糖苷酶实验验证其转入蛋白的活性表现。结果:当PEI与蛋白质的摩尔比为4∶1时,形成的复合体转染效率最高,β-半乳糖苷酶实验细胞染色变蓝。结论:PEI能与蛋白质形成纳米复合体,并能转染多种蛋白质进入人骨髓间充质干细胞,所转染的蛋白质分子仍具有活性,为细胞重编程技术提供了新途径。     

骨髓间充质干细胞分离培养的研究进展

骨髓间充质干细胞具有较强的自我增殖能力和多向分化潜能。随着对其细胞免疫学研究的深入 ,目前已建立了多种分离纯化并扩增的方法 ,为其在细胞工程和组织工程上的应用提供了基础     

雷奈酸锶通过上调骨形态发生蛋白2的表达促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞

目的: 探讨雷奈酸锶(strontium ranelate,Sr)是否可以通过上调骨形态发生蛋白 2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)的表达而促进大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化为成骨细胞。方法: 对大鼠BMSCs进行分离、纯化、培养及向成骨细胞的定向诱导分化,并在诱导培养时,根据实验目的加入不同浓度Sr以及BMP-2的拮抗剂noggin。用酶标法检测成骨细胞分化和功能成熟的早期标志物——碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的变化,用茜素红染色检测细胞钙化水平,用Western blotting法检测BMP-2蛋白的表达水平。结果: 应用0.1~7 mmol/L Sr处理细胞7 d均可使细胞ALP活性显著增加,其中浓度为3 mmol/L时效果最显著;应用3 mmol/L Sr处理细胞21 d可使细胞钙化结节明显增多;应用0.1~7 mmol/L Sr处理细胞7 d后细胞内BMP-2蛋白水平明显增高;在Sr处理BMSCs前,应用BMP-2拮抗剂noggin预处理细胞2 h不仅抑制Sr对BMP-2表达的上调作用,还拮抗Sr对ALP活性及钙化结节形成的促进作用。结论: 上调BMP-2的表达可能是Sr促进大鼠BMSCs分化为成骨细胞的作用机制之一。     

慢病毒介导的CCN1基因对大鼠骨髓间充质干细胞

 目的：探讨外源性CCN1对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）生长和迁移的作用。方法：构建带有绿色荧光蛋白的大鼠CCN1慢病毒载体（Lenti-GFP-CCN1）并感染大鼠BMSCs,筛选最适感染复数（MOI）;实验分为空白组、感染Lenti-GFP组和感染Lenti-GFP-CCN1组,倒置荧光显微镜下观察BMSCs感染后荧光表达情况;MTT法检测细胞存活率,划痕愈合实验检测细胞迁移作用。结果：与空白组和阴性对照组相比,Lenti-GFP-CCN1感染大鼠BMSCs后,细胞的存活率未见明显差异;感染组细胞划痕愈合实验的愈合宽度/原宽度值与空白组及阴性对照组相比差异显著（P<0.05）。结论：外源性CCN1对正常大鼠BMSCs存活率无影响,可促进BMSCs迁移。     

The effects of platelet-rich plasma on the osteogenic induction of bone marrow mesenchymal stem cells

Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are multipotent stem cells. Finding methods to improve the osteogenic potential of these cells is a key factor in bone tissue engineering. Platelet-rich plasma (PRP) contains powerful growth factors that produce changes in a variety of cell types. The purpose of this study was to explore the effects of PRP on the osteogenic differentiation of BMSCs in vitro. Rabbit BMSCs were harvested and cultured in vitro in control media or in media enhanced with PRP. BMSCs began to attach 12–24 hours after seeding. A MTT assay demonstrated that PRP-induced BMSCs grew rapidly compared with the control group. The PRP group also showed strongly positive staining of alkaline phosphatase and mineralized nodules whereas the control group showed negative staining. However, the alkaline phosphatase activity and the mRNA level of the osteogenic markers (osteocalcin and osteopontin) remained higher in the PRP group. These results confirmed that PRP could enhance the proliferation of BMSCs and effectively promote the osteogenic differentiation of BMSCs in vitro.     

雌激素对人骨髓间质细胞BMP-2 mRNA表达的影响

目的： 探讨雌激素对人骨髓间质干细胞BMP-2基因转录的影响。方法: 将骨髓间质干细胞第3代细胞经1周成骨诱导后，分为17β-雌二醇 100 nmol/L 处理组和对照组，通过RT-PCR法扩增BMP-2 mRNA，测定扩增条带的吸光度值，并与3-磷酸甘油醛脱氢酶看家基因GAPDH的mRNA之比值表示产物mRNA的相对含量。结果: 雌激素处理组BMP-2 mRNA表达明显高于非处理组（P<0.05）。结论: 雌激素通过刺激间质细胞BMP-2 mRNA的表达以发挥其促成骨作用。     

骨髓基质干细胞体外诱导成软骨的研究进展

骨髓基质干细胞具有强大的体外扩增能力和多向分化潜能,在不同诱导因素诱导下可以分化为软骨细胞,已成为软骨组织工程理想种子细胞的研究热点。近十几年对于如何诱导骨髓基质干细胞成软骨已有不少研究,如诱导因子诱导、基因修饰诱导及与软骨细胞共培养诱导等,都可以将骨髓基质干细胞成功诱导为软骨细胞。就骨髓基质干细胞体外定向诱导成软骨的方法进行综述对其研究进展作一回顾.