自发性高血压大鼠组织和心肾缺血组织中Na~＋／Ca~（2＋）交换体基因的表达

自发性高血压和心肾缺血组织中钙离子水平明显升高。为探讨Ｎａ＋／Ｃａ２＋交换体在其中的作用，我们应用半定量逆转录一多聚酶链反应（ＲＴ一ＰＣＲ）技术，比较了自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）部分组织、缺血时心肌和肾脏与其正常对照组织中Ｎａ＋／Ｃａ２＋交换体ｍＲＮＡ的水平。结果表明，ＳＨＲ所测组织中Ｎａ＋／Ｃａ２＋交换体ｍＲＮＡ较正常ＷＫＹ大鼠均降低。结扎４８小时引起的缺血肾脏Ｎａ＋／Ｃａ２＋交换体ｍＲＮＡ亦降低。而因异丙基肾上腺素引起的心肌缺血组织中，Ｎａ＋／Ｃａ２＋交换体基因的表达上升。     

Na+/Ca2+交换体电流在兔左心室壁分布的异质性

目的探讨Na+/Ca2+交换体电流(INa+/Ca2+)在左室肌不同部位的分布特征及其与跨壁复极异质性的关系.方法采用全细胞膜片钳技术,分别记录兔左心室肌内膜下、中层及外膜下细胞的动作电位(AP)、INa+/Ca2+及IK.结果中层细胞AP时程明显长于外膜下细胞(P<0.01);在+40 mV时,外向INa+/Ca2+密度在中层细胞明显大于外膜下及内膜下细胞(P分别＜0.01,0.05);在-100 mV时,内向INa+/Ca2+密度在中层细胞明显大于外膜下(P<0.05);在测试电压为+50mV时,中层细胞的IKs尾电流密度明显小于外膜下细胞(P<0.05), 内膜下、中层及外膜下细胞的IKr尾电流密度无明显区别(P>0.05).结论 INa+/Ca2+与IKs在兔左室肌的分布具有异质性,并导致了跨壁复极异质性的形成.     

钠钙交换体激活 CaMKII 介导大鼠离体心脏缺血再灌注损伤

目的：探讨钠钙交换体(Na+/Ca2+ exchanger,NCX)在离体心脏缺血再灌注损伤中的作用及其可能机制。 方法：40只大鼠随机分为4组：正常对照组(Control组)、10 μmol/L KB-R7943药物对照组(KB-R7943组)、缺血再 灌注(ischemia reperfusion,IR)组和10 μmol/L KB-R7943干预缺血再灌注组(KB-R7943+IR组)。采用Langendorff灌流 装置建立离体心脏缺血再灌注模型;以再灌注末心肌纤维形态的变化、左室发展压(LVDP)比值、左室舒张末压 (LVEDP)、冠状动脉流出液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性、心肌梗死面积及细胞色素c和cleaved caspase-3蛋白的变化评价心肌损伤程度;Western印迹检测磷酸化钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II(Ca2+/calmodulin- dependent protein kinase II,CaMKII)和受磷蛋白(phospholamban,PLN)苏氨酸17位点磷酸化(pThr17)水平的变化。 结果：与Control组相比,IR组再灌注末心肌纤维排列紊乱,断裂明显,心肌梗死面积、LVEDP和冠状动脉流出 液中LDH活性明显增加,LVDP比值降低,细胞色素c、cleaved caspase-3、磷酸化CaMKII及pThr17-PLN水平均上调 (P<0.01);KB-R7943+IR组心肌梗死面积明显减小,LVEDP降低,LVDP比值明显改善,LDH活性明显降低,细胞色素 c和cleaved caspase-3蛋白水平明显降低,磷酸化CaMKII和pTh r17-PLN水平也明显下调(P<0.01)。结论：NCX可通过激活 CaMKII启动细胞凋亡和坏死,进而诱导心肌缺血再灌注损伤。     

HPV58E6基因的克隆及体外表达

目的克隆并体外表达HPV58E6,为E6致癌作用和疫苗的研究奠定基础.方法通过PCR方法从HPV58全基因克隆中扩增出HPV58E6基因片段,利用基因重组技术,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3的T7启动子下游,体外转录成mRNA后,在源自网织红细胞的翻译缓冲液中表达生物素标记的HPV58E6蛋白,化学发光法检测,X光胶片曝光显影鉴定.结果酶切电泳证实质粒构建正确,SDS-PAGE电泳显示在相当于HPV58E6分子量约18.8kD的位置出现条带,X光胶片亦在相应位置出现印迹条带.结论成功表达了含有生物素标记的HPV58E6蛋白,为其致癌作用和治疗的研究奠定基础.     

钠/钙和钠/氢交换蛋白与心肌缺血再灌注损伤

Ca2+超载与缺血/再灌注损伤有密切关系,钠/钙交换蛋白和钠/氢交换蛋白是缺血/再灌注Ca2+超载过程中两个至关重要的因素。目前已有很多钠/钙交换蛋白(NCX)抑制剂和钠/氢交换蛋白(NHE)抑制剂用来防止Ca2+超载引起的缺血再灌注损伤。     

钠钙离子交换体介导的钙超载对造影剂诱导NRK52E细胞损伤的影响

目的:本研究探讨钠钙离子交换体(NCX)是否参与了造影剂诱导的肾小管上皮细胞损伤及反向模式钠钙离子交换体抑制剂KB-R7943对造影剂诱导的肾小管上皮损伤的影响。方法:鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)被分成6组:正常对照组、造影剂组、甘露醇组、钙离子拮抗剂(CCB)组、KB-R7943(10-5mol/L)和KB-R7943(10-6mol/L)组。造影剂作用1 h后,细胞损伤采用LDH检测,细胞形态变化及细胞凋亡分别由倒置显微镜和流式细胞仪检测;细胞内钙采用共聚焦微镜测定;钠钙离子交换体mRNA表达采用RT-PCR测定。结果:造影剂作用1 h后,细胞损伤、细胞凋亡、细胞内钙进行性增加,显著高于相同渗透压甘露醇组;KB-R7943显著改善了上述异常,且较相同浓度CCB具有更好的效果并显示出剂量效应;钠钙离子交换体mRNA表达没有变化。结论:经反向模式钠钙离子交换体导致的细胞内钙超载参与了造影剂诱导的肾小管上皮细胞损伤;反向模式钠钙离子交换体抑制剂KB-R7943以呈剂量方式对造影剂诱导的肾小管上皮细胞损伤发挥保护作用。     

PAX-2基因的克隆化和在原核细胞中的表达

①目的　以RT PCR技术克隆PAX 2全长开放读框 ,构建重组原核表达载体 ,制备重组人PAX 2蛋白 ,为肾肿瘤免疫治疗打下基础。②方法　从肾癌手术标本中分离mRNA ,RT PCR扩增筛选PAX 2全长开放读框 ,扩增产物经过限制性酶切分析及DNA测序后 ,克隆入高效原核表达质粒 pTrcHis,构建重组载体 ,转化工程菌株JM10 9,经IPTG诱导表达及 6×His配体亲和层析制备原核表达重组人PAX 2蛋白。③结果　RT PCR扩增获得约 1.2kb大小的产物 ,经限制性酶切分析和DNA测序 ,证实为人PAX 2基因的完整开放读框。④结论　肿瘤组织总RNA经RT PCR一步法能够对PAX 2基因的开放读框进行完整有效的筛选。经重组技术及高效原核系统制备重组人PAX 2蛋白的效率和纯度满意。体外制备的重组人PAX 2蛋白对肾肿瘤特异性抗原的瘤苗制备和免疫治疗具有重要价值。     

老年大鼠海马组织中神经生长因子及其受体基因表达的变化

目的：观察老年大鼠海马组织中NGF及其受体基因表达的变化。方法：采用RT－PCR法，半定量分析2年龄大鼠海马组织中NGF及其受体p75mRNA含量的变化。结果：与正常成年（3月龄）大鼠相比，2年龄大鼠海马组织NGF mRNA含量显著下降，而NGF受体p75mRNA的表达无明显改变。结论：老年鼠海马NGF基因表达明显下降，而其受体p75的表达变化不明显。提示衰老可能与NGF基因表达量减少有关。     

抗HBs单克隆抗体Fv段基因的克隆及其表达

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）获得抗－ＨＢｓ单克隆抗体Ｆｖ段轻、重链基因，经连接后形成一条单链含轻、重链的Ｆｖ基因（ＳｃＦｖ），并在重组－噬菌体－抗体系统（ＲＰＡＳ）中获得表达，用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）证明表达的Ｆｖ段具有特异性抗原结合活性。     

氯胺酮对大鼠大脑皮层和丘脑突触体Na^＋K^＋—ATP酶活性的影响

目的动态观察氯胺酮对大鼠大脑皮层和丘脑Na+,K+-ATP酶活性的影响.方法SD大鼠32只,随机分为对照组、麻醉组、恢复Ⅰ组和恢复Ⅱ组.对照组腹腔注射生理盐水10ml·kg-1,其余各组均为腹腔注射氯胺酮1100mg·kg-1.对照组腹腔注射生理盐水后10min断头,麻醉组、恢复Ⅰ组和恢复Ⅱ组分别在大鼠翻正反射消失后10min、翻正反射恢复后和完全清醒后断头,取双侧大脑皮层和丘脑匀浆,离心,制备粗制突触体,用分光光度法测Na+,K+-ATP酶活性.结果大鼠氯胺酮100mg·kg-1腹腔注射能明显降低大脑皮层和丘脑Na+,K+-ATP酶活性,分别较对照组降低了32.8%和31.4%(P＜0.05),而在翻正反射恢复后和动物完全清醒后Na+,K+-ATP酶活性恢复(与对照组相比,P＞0.05).结论Na+,K+-ATP酶活性在氯胺酮全麻机理中可能发挥重要作用.     

Inhibition of central Na＋/H＋ exchanger type 3 can alleviate sleep apnea in Sprague-Dawley rats

Background Recent studies showed the central Na＋/H＋ exchanger type 3 （NHE3） has a close relationship with ventilation control.The objective of the study is to investigate the role of NHE3 in sleep apnea in Sprague-Dawley （SD） rats.Methods A sleep study was performed on 20 male SD rats to analyze the correlation between the sleep apneic events and total NHE3 protein content and inactive NHE3（pS552） in the brainstem measured by Western blotting.Another 20 adult male SD rats received 3 days of sleep and respiration monitoring for 6 hours a day,with adaption on the first day,0.5％ DMSO microinjection into the fourth ventricle on the second day,and AVE0657 （specific inhibitor of NHE3） microinjection on the third day.Rats were divided into two groups with injection of 5 μmol/L or 8 μmol/L AVE0657 before the sleep study.The effects of AVE0657 on sleep apnea and sleep structure of rats were analyzed through self-control.Results The total post-sigh apnea index （TPSAI） and post-sigh apnea index in non-rapid eye movement （NREM） sleep （NPSAI） and total apnea index （AI） in NREM sleep （NAI） were negatively correlated with NHE3（pS552） protein contents in the brainstem （r=-0.534,-0.547 and-0.505,respectively,P＜0.05）.The spontaneous apnea index in REM sleep （RSPAI） was positively correlated with the level of NHE3（pS552） protein expression in the brainstem （r=0.556,P＜0.05）.However,the sleep AI had no relationship with total NHE3 protein.Compared with the blank control and microinjection of 0.5％ DMSO,5 μmol/L AVE0657 significantly reduced the total AI and NPSAI （both P＜0.05） without a significant effect on sleep architecture.In contrast to blank control and microinjection of 0.5％ DMSO,injection of 8 μmol/L AVE0657 significantly reduced the AI and PSAI in NREM and REM sleep （all P＜0.05）.Conclusions The severity of sleep apnea was negatively correlated with central inactive NHE3.A specific inhibitor of NHE3 decreased the sleep AI.Thus,our results indicate that central NHE3 might be a molecular target for sleep apnea treatment,whose inhibitors may be potential therapeutic drugs for sleep apnea.     

孔雀绿比色法同步测定大鼠成骨细胞膜Ca~(2+)-ATP酶和Na~+、K~+-ATP酶活性

为探索同步测定大鼠成骨细胞膜Ｃａ２＋－ＡＴＰ酶和Ｎａ＋、Ｋ＋－ＡＴＰ酶活性的方法。采用孔雀绿比色法测定磷以反映酶活性。结果显示：Ｃａ２＋浓度以及成骨细胞传代培养的代数是影响酶活性的重要因素。Ｃａ２＋有助于提高ＡＴＰａｓｅ活性。Ｃａ２＋浓度为４０μｍｏｌ／Ｌ时，ＡＴＰａｓｅ活性较高。细胞传代越多，膜Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ活性越低。成骨细胞膜Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ活性低于Ｎａ＋、Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ。结论：孔雀绿比色法同步测定大鼠成骨细胞膜Ｃａ２＋－ＡＴＰ酶和Ｎａ＋、Ｋ＋－ＡＴＰ酶活性，方法简便、灵敏、可靠。     

HBx基因的克隆和序列分析及其真核表达载体的构建

目的：通过HBx基因的克隆、序列对比和进化树分析以及peDNA3．1（＋）-HBx真核表达载体的构建，为进一步研究HBx基因与肝癌发生发展的关系打下基础。方法：用Oliga6．0结合Primer Premier5．0软件设计特异性引物，通过PCR方法从广西HBsAg阳性病人血清中（血清型Adrq^＋）分离得到的病毒株构建的HBxAg质粒中扩增HBx基因。用DNA star5．01和Vector NTI Suite8．0软件进行序列对比分析和进化树构建。经双酶切将HBx基因定向插入到pcDNA3．1（＋）质粒中。结果；成功克隆了基因型C型突变型HBx基因，并构建出真核表达载体pcDNA3．1（＋）HBx。新基因被GeneBank接受，在GeneBank上登录号为AY839630。序列对比和进化树分析表明．新克隆的基因与野生基因型C型有高度的同源性（97．80A），2．2％的变异。结论：从广西HBsAg阳性病人病毒株（血清型Adrq^＋）中发现了新的基因型C型突变型HBx基因（mutantgenotypeC）。peDNA3．1（＋）-HBx真核表达载体的构建，将为进一步研究HBx基因在树鼩实验性肝癌诱发过程中所起的作用打下基础。     

半定量RT－PCR方法在基因表达研究中的应用

目的：定量检测Ｂ型内皮素受体（ＥＴＢ－Ｒ）基因在大鼠心、肝、肺、肾等器官及培养的肾小球系膜细胞（ＭＣ）的表达。方法：半定量逆转录。多聚酶链反应技术（ＳｑＲＴ－ＰＣＲ），并以ＮｏｒｔｈｅｒｎＥＰ印迹法作对照。结果：ＥＴＢ－Ｒ基因在上述器官及ＭＣ均有表达，而表达水平依次为肺、心、肾和肝。结论：ＥＴＢ－Ｒ在不同器官有不同水平的基因表达，说明内皮素对不同器官的效应不同；ＭＣ是内皮素在肾内发挥作用的靶细胞。     

脑缺血再灌注后脑组织Cyclin D1和CDK4基因的表达及其意义

①目的研究脑缺血再灌注后细胞周期蛋白D1(CyclinD1)和周期蛋白依赖性蛋白激酶4(CDK4)基因表达及其与神经细胞凋亡的关系。②方法成年健康雌性SD大鼠36只,随机分为假手术组4只和实验组32只,实验组再进一步分为缺血1.5h再灌注2h、6h、12h、1d、2d、3d、7d和14d亚组,每组4只。应用线栓法经左侧颈外颈内动脉插线建立SD大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型,应用原位末端标记(TUNEL)技术检测脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的变化,原位杂交技术检测CyclinD1mRNA和CDK4mRNA的表达。③结果脑缺血再灌注2h脑组织即开始出现凋亡神经细胞,并于1d和2d分别在皮质区和纹状体区达高峰。神经细胞CyclinD1mRNA和CDK4mRNA的表达分别于再灌注2h和6h开始逐渐增强,并于12h和1d分别在皮质区和纹状体区达高峰,至再灌注14d降至假手术组水平。④结论脑缺血再灌注后皮质区、纹状体区对缺血更为敏感,CyclinD1mRNA和CDK4mRNA表达可能是诱导细胞凋亡的重要因素之一。     

人肥胖基因在pBV221中的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中高效表达人ｌｅｐｔｉｎ。方法：根据中国人肥胖基因（ｏｂｅｓｅｇｅｎｅ，ＯＢ）ｃＤＮＡ序列和高效表达质粒ｐＢＶ２２１的多克隆位点，设计ＰＣＲ引物，以含有人ＯＢ的重组质粒ｐＵＣ１９ＯＢ为模板，体外扩增人ＯＢ编码ｌｅｐｔｉｎ的片段（ＯＢ１），并经内切酶消化鉴定。将带有一对限制性内切酶位点的ＯＢ１和ｐＢＶ２２１分别进行双酶切，然后把ＯＢ１定向克隆于ｐＢＶ２２１中。结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＶ２２１ＯＢ１，实现了人ｌｅｐｔｉｎ在大肠杆菌中的表达。结论：采用定向克隆技术，将ＯＢ１插入表达质粒ｐＢＶ２２１，连接效率高，且重组质粒中ＯＢ１均为正向插入，确保了人肥胖基因在大肠杆菌中的表达。     

选择性钠/氢离子交换抑制剂预处理对未成熟心肌的保护作用

目的　研究选择性Na+ /H+ 交换抑制剂HOE6 4 2 (Cariporide)预处理对未成熟心肌缺血 /再灌注损伤的保护作用及机制。方法　 2 0只健康新西兰幼兔 (3～ 4周龄 ) ,利用Langendorff左室做功模型灌注其离体心脏 ,建立全心缺血 /再灌注模型。KH液自主动脉逆行灌注心脏 ,向球囊缓慢注入生理盐水 ,调整至左室舒张末压 (LVEDP)为 10mmHg ,做功 2 0min ,随机分为两组 ,组Ⅰ :对照组 ,继续灌注 15min ;组Ⅱ :HOE6 4 2预处理组 ,用加入HOE6 4 2的KH液 (浓度为 5 μmol/L)继续灌注 15min。然后两组心脏均以St.Thomas停搏液诱导停跳 ,常温(37℃ )缺血 4 5min(保湿保温 ) ,再灌注 6 0min。记录冠脉流量 (CAF) ,多导生理记录仪记录左心功能指标 ,原子吸收分光光度计测定心肌细胞内钙 (Ca)含量 ,自动生化分析仪测量冠脉流出液中磷酸肌酸激酶 (CK)、磷酸肌酸激酶同工酶 (CK -MB)、乳酸脱氢酶 (LDH)漏出量含量 ,计算心肌含水量 ,透射电镜观察心肌超微结构改变。结果　CAF、左室发展压 (LVDP)、左室压力微分 (±dp/dtmax)恢复率 ,心肌组织内Ca及心肌含水量 ,心肌超微结构变化 ,HOE6 4 2预处理组明显优于对照组 (P <0 .0 5 )。结论　HOE6 4 2预处理通过减少细胞内钙超载 ,模拟缺血预处理的心肌保护效果 ,对未成熟心肌缺血 /     

鱼抗冻肽基因在大肠杆菌中的克隆及表达

为探索鱼抗冻肽基因在大肠杆菌中的高效表达条件，我们将鱼抗冻肽基因克隆到原核高效表达载体Ｐ＾ｋｋ２２３－３上，筛选到８个重组克隆，经转化大肠杆菌ＤＨ５α，ＩＰＴＧ诱导５￣６ｈ，超声裂解细菌产物，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳胶带中分子量９ＫＤ处显示一条表达产物带，证明插入的抗冻肽基因已表达，含量占菌体总蛋白的１０％左右     

脑胶质瘤多药耐药基因表达及其对化疗药物敏感性

①目的　检测 1型多药耐药基因 (MDR1)产物P170在人脑胶质瘤组织中表达及其对化疗药物敏感性。②方法　采用免疫组化的方法 ,对 38例人脑胶质瘤手术切除标本的MDR1表达水平进行检测 ;采用四唑蓝快速比色法检测氟尿嘧啶 (FU )、顺铂 (DDP)、甲氨喋呤 (MTX)、丝裂霉素 (MMC)、司莫司汀 (MeCCNU)、洛莫司汀(CCNU)、双氯乙基亚硝脲 (BCNU)、威猛 2 6 (VM 2 6 )对脑胶质瘤细胞的抑制率。③结果　 38例人脑胶质瘤细胞P170阳性表达率为 6 5 .7% ,与正常脑组织 (表达率为 0 )比较差异有显著性 (P =0 .0 0 0 2 ) ;BCNU ,MeCCNU ,CCNU对胶质瘤的抑制率较高 ,FU ,MTX ,MMC对胶质瘤的抑制率较低 ,差异有显著性 (F =4 7.6 ,q =5 .2 5～ 6 .78,P <0 .0 5 )。脑胶质瘤对 8种化疗药物的敏感性差异有极显著性 ;随着胶质瘤恶性程度的增高 ,P170的阳性表达率逐渐升高 (胶质瘤Ⅰ～Ⅳ级的表达率分别为 0 ,5 3.3% ,70 .6 % ,10 0 .0 % )。④结论　脑胶质瘤的耐药性与MDR1表达水平密切相关。     

RhoGDI2蛋白在膀胱癌组织中的表达及意义

目的:研究RhoGTP酶GDP解离抑制因子2(rho GDP dissociation inhibitor 2,RhoGDI2)蛋白在膀胱癌组织中的表达情况及意义.方法:收集来自广西医科大学附属肿瘤医院2010年10月至2014年6月的膀胱癌组织标本44例.用免疫组织化学的方法定位、定量检测膀胱癌组织中RhoGDI2蛋白的表达情况,按不同病理参数对膀胱癌组织进行分组并比较各分组RhoGDI2蛋白的表达是否有统计学差异.结果:全部膀胱癌组织标本均可见RhoGDI2蛋白阳性表达,不同性别和不同年龄分组的RhoGDI2蛋白表达无差异(P＞0.05).在Ta～T3期,RhoGDI2蛋白表达与分期相关(P＜0.05),随着分期增高表达降低,T3与T4期比较无差异(P＞0.05);RhoGDI2蛋白表达与分化相关(P＜0.05),分化程度越高,表达越低;原发与复发、非转移与转移组之间比较有差异(P ＜0.05),复发组和转移组的RhoGDI2蛋白表达降低.结论:膀胱癌组织中RhoGDI2蛋白可能抑制膀胱癌的浸润、转移,在蛋白水平上可能是膀胱癌转移抑制因子.