骨髓基质细胞与关节软骨细胞生物学特性的比较研究

目的观察兔骨髓基质细胞(MSCs)诱导和基因修饰后的主要生物学特性,并与关节软骨细胞进行比较. 方法抽取成年雄性新西兰大白兔髂骨骨髓,密度梯度离心获得骨髓基质细胞,培养传至第5代,按处理方法分为常规培养液组(A组)、条件培养液组(B组)及重组缺陷型腺病毒携带肝细胞生长因子cDNA转染组(C组).条件培养液为常规培养液中含转化生长因子-β1(10 ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子(25 ng/ml)和地塞米松(10-7 mol/L).切取兔膝关节软骨,3 mg/ml Ⅱ型胶原酶消化传代培养至第3代(D组).观察原代MSCs及第5代MSCs(体外培养8～10周后)细胞形态,对第5代MSCs及第3代软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,MTT法检测细胞增殖情况.阿利新蓝法检测细胞培养上清液中糖胺多糖(GAG)含量.提取各组培养细胞总RNA,RT-PCR检测Ⅰ、Ⅱ型胶原表达. 结果原代MSCs为短梭形、簇状生长,传代细胞呈长梭形、旋涡样生长.A组细胞爬片Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阴性,GAG含量低,与D组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).B组细胞爬片Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,GAG含量升高,与D组比较差异无统计学意义(P＞0.05);C组转染后第4天增殖率降低,与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05),其余时间点各组间无统计学意义(P＞0.05).RT-PCR表明A、B、C组均表达Ⅰ型胶原,B、D组可表达Ⅱ型胶原,C组有较弱的Ⅱ型胶原表达. 结论 MSCs体外培养过程中自然转归趋向于成骨.传代后经向成软骨方向诱导,具有向软骨分化的能力;体外传代培养的MSCs具有干细胞自我增殖和定向分化的特性,可作为靶细胞接受外源目的基因转染并能有效表达.     

pcDNA3-hBMP2转染对成纤维细胞 生物学性状的影响

目的 探讨人BMP2基因转染对成纤维细胞NIH3T3生物学性状的影响。方法 构建重组真核表达载体pcDNA3-hBMP2,并在脂质体介导下,将其导入NIH3T3成纤维细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用细胞原位杂交和免疫组织化学方法检测hBMP2基因在NIH3T3成纤维细胞内的表达情况;MTT法和FCM检测pcDNA3-hBMP2转染pcDNA3-hBMP2后成纤维细胞超微结构的改变,碱性磷酸酶的检测观察转染pcDNA3-hBMP2后成纤维细胞向成骨细胞分化情况。结果 转染pcvDNA3-hBMP2后的NIH3T3细胞内有大量hBMP2mRNA的转录及其蛋白的表达;转染pcDNA3-hBMP2对成纤维细胞增殖和细胞周期无影响;转染pcDNA3-hBMP2后的成纤维细胞超微结构可见粗面内质网丰富,囊腔扩张明显其内充满中等电子密度的蛋白分泌物;碱性磷酸酶活性显著上升。结论 pcDNA3-hBMP2转染对成纤维细胞NIH3T3增殖和细胞周期无影响。转染后的成纤维细胞不仅可形成BMP2,而且具有向成骨细胞系分化的特性。     

人胰岛素样生长因子I基因转染骨髓基质细胞的实验研究

目的检测人胰岛样生长因子Ⅰ基因转染骨髓基质细胞的效果及目的基因的表达情况,寻找一种改良组织工程种子细胞的新方法。方法抽取成年雄性山羊髂嵴骨髓,贴壁分离法接种培养骨髓基质细胞,检测细胞生长特性。取第2代细胞,按3∶1比例用FuGene6转染试剂介导,将重组真核表达质粒pIRES2 EGFP hIGF Ⅰ(EGFP为增强绿色荧光蛋白,hIGF Ⅰ为人胰岛素样生长因子Ⅰ)转染骨髓基质细胞,转染后4~72h和传代后分别用倒置荧光显微镜观察标志基因增强绿荧光蛋白的表达情况,计算转染效率。酶联免疫吸附试验检测培养上清液中hIGF Ⅰ的浓度变化。转染细胞爬片行hIGF Ⅰ免疫组化染色检测hIGF Ⅰ的表达。提取转染后48h的细胞总RNA,RT PCR检测hIGF Ⅰ和内核糖体进入位点(IRES)的表达。收集转染前及转染后48h的细胞行流式细胞仪检测细胞周期分布及荧光表达情况。结果成年山羊骨髓基质细胞在接种后24h开始贴壁,伸展成长梭形,原代细胞呈集簇状分布。在转染后4h即有细胞表达绿色荧光蛋白,荧光强度和表达细胞总数在48h达高峰, 72h时见部分细胞荧光强度下降,传代后仍可观察到EGFP的表达。转染后4~72h转染上清液中分泌hIGF Ⅰ的浓度呈逐渐上升趋势,在72h最高可达34 75ng/ml。转染后部分细胞形态发生变化。hIGF Ⅰ免疫组化染色证实在胞浆中     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及表型鉴定

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞分离及培养的方法,探讨体外培养骨髓间充质干细胞的生物学特性.方法 采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,测定生长曲线,镜下连续观察细胞的形态变化.流式细胞仪鉴定其表面抗原 CD29、CD34、CD44和CD45的表达情况.结果 原代骨髓间充质干细胞呈集落状生长,细胞呈梭形、纺锤形,呈放射状生长,传代后呈均一的成纤维细胞样.骨髓间充质干细胞生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致.流式细胞仪鉴定表明,骨髓间充质干细胞CD44、CD29表达呈阳性,CD45、CD38表达呈阴性.结论 采用密度梯度离心法结合贴壁培养法能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,并且在体外培养条件下可大量增生,形成形态均一的细胞集落,可以作为组织工程中种子细胞的来源.     

兔椎间盘髓核细胞体外生物学特性的实验研究

目的 对兔椎间盘髓核细胞进行体外培养,观察细胞的形态、表型及超微结构改变,研究其体外生物学特性.方法 取2周龄健康新西兰白兔椎间盘髓核组织,在含有15%灭活FBS的DMEM/F12培养液中培养,倒置相差显微镜下观察原代和传代细胞形态.分别在取材后、原代、第1代、第2代细胞培养期间,进行髓核细胞活力测定;爬片培养后进行甲苯胺蓝、HE、聚集蛋白聚糖番红O、Ⅰ型及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察;MTT法绘制髓核细胞生长曲线,并行原代及第2代细胞透射电镜观察,对体外细胞的生物学特性进行研究.结果 倒置相差显微镜见原代髓核细胞呈类圆形,折光性较强;5 d开始有细胞贴壁,细胞呈多角形或短梭形;6～8 d细胞生长进入指数生长期;约17 d时,细胞长满瓶壁,可进行传代;随传代次数增加,细胞形态逐渐由多角形、短梭形向长梭形改变.髓核细胞活力测定在刚分离完成后细胞活力为95%～97%,原代培养期间为98%～100%,第1代培养期间仍能维持为100%,第2代细胞活力下降较为明显,为75%～80%.髓核细胞甲苯胺蓝染色呈强阳性:HE染色见细胞核、细胞质着色明显.第1代髓核细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阴性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,聚集蛋白聚糖番红O染色呈阳性;第2代细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈弱阳性,聚集蛋白多糖番红O染色着色较浅.MTT生长曲线与体外细胞培养时生长过程相符.透射电镜显示原代髓核细胞内线粒体少,胞质内有大量糖原颗粒,随传代次数增加,糖原颗粒减少,线粒体数量增多,细胞器开始肿胀.结论 明确了兔髓核细胞体外生物学特性变迁,为组织工程髓核的种子细胞研究提供了实验依据.     

腺病毒重组绿色荧光蛋白转染兔脂肪干细胞的体外研究

目的 通过采用腺病毒重组绿色荧光蛋白(Ad-EGFP)转染连续培养的家兔脂肪组织来源基质干细胞(ADSCs),检测其转染效率、最佳标记时间,探讨其作为干细胞标记示踪方法的可行性.方法 选择8～12周龄健康新西兰大白兔6只,雌雄不限,体质量1.5～2.5kg;切取6只兔腹股沟皮下脂肪组织1～2ml,采用贴壁法行体外分离培养ADSCs;将获取的第4代ADSCs进行流式细胞术表型鉴定和不同MOI值Ad-EGFP基因转染,同时通过活力和增殖实验进行Ad-EGFP体外转染对ADSCs的影响研究.结果 6份标本均成功培养出兔ADSCs且生长良好,并均成功进行了Ad-EGFP基因转染.①原代细胞培养48h后可见细胞贴壁生长,其ADSCs形态主要为宽大、扁平、短梭形细胞,传代后细胞形态主要为长梭形.经1:2传代后细胞增殖速度明显加快,3d后细胞已长满培养瓶底后,即可传代.②ADSCs倍增时间约72h.③第4代的ADSC表型呈CD29+,CD34-,CD44+,CD106-,CD133-和HLA-DR-.④Ad-EGFP可成功转入ADSCs.24h可见绿色荧光,5d时荧光表达强度最强;ADSCs传代后仍有强荧光表达.当MOI值为0、10、20、30、50、100时,转染率分别为0,11.2%,25.8%,46.7%,95.3%,97.2%.⑤转染组和未转染组细胞培养1、3、5、7、9、11d时,其细胞活力、增殖分化的差异均无统计学意义.结论 能大量从兔脂肪组织分离培养出基质干细胞;EGFP可成功转染ADSCs,其MOI值为50时较为理想.所以,腺病毒是较好的基因载体,而EGFP转染是一种较好的兔ADSCs标记方法.     

血管内皮生长因子基因稳定转染兔骨髓基质干细胞的研究

目的 检测人血管内皮生长因子(VEGF)基因稳定转染对兔骨髓基质干细胞(BM-SC)VEGF表达的影响.方法 分离并培养兔骨髓基质干细胞,利用脂质体介导pcDNA3.1-VEGF165转染兔BMSC,G418筛选稳定表达pcDNA3.1-VEGFl65的细胞克隆,RT-PCR、Western blot法检测转染前后细胞中VEGF165 mRNA和蛋白的表达.结果 通过筛选获得了稳定表达pcDNA3.1-VEGF165的细胞克隆.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot结果显示:稳定转染组BMSC中可检测到VEGF165 mRNA和蛋白的表达,空白和空载体组未见VEGF表达.结论 pcDNA3.1-VEGF165载体转染的兔BMSC可稳定表达外源性VEGF165 mRNA和蛋白,可作为治疗骨缺损和骨缺血性坏死研究的种子细胞.     

兔骨髓基质细胞的分离培养

目的 为骨组织工程寻找一种理想的种子细胞。方法 采取兔骨髓组织，应用梯度离心获取骨髓基质细胞，体外培养传代，通过光镜、透射电镜及成骨特性的鉴定，观察细胞的形态、生长特点及成骨特性。结果 培养的骨髓基质细胞形态多为三角形或梭形，生长增殖迅速，具有成骨能力，易于定向分化为成骨细胞。结论 自骨髓获得的骨髓基质细胞具有明显的增殖能力和成骨活性，可以做为骨组织工程中比较理想的种子细胞。     

人胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染骨髓基质细胞的实验研究

目的检测人胰岛样生长因子Ⅰ基因转染骨髓基质细胞的效果及目的基因的表达情况，寻找一种改良组织工程种子细胞的新方法。方法抽取成年雄性山羊髂嵴骨髓，贴壁分离法接种培养骨髓基质细胞，检测细胞生长特性。取第2代细胞，按3：1比例用FuGene6转染试剂介导，将重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-Ⅰ(EGFP为增强绿色荧光蛋白，hIGF-Ⅰ为人胰岛素样生长因子Ⅰ)转染骨髓基质细胞，转染后4～72h和传代后分别用倒置荧光显微镜观察标志基因增强绿荧光蛋白的表达情况，计算转染效率。酶联免疫吸附试验检测培养上清液中hIGF-Ⅰ的浓度变化。转染细胞爬片行hIGF—Ⅰ免疫组化染色检测hIGF-Ⅰ的表达。提取转染后48h的细胞总RNA，RT-PCR检测hIGF-Ⅰ和内核糖体进入位点(IRES)的表达。收集转染前及转染后48h的细胞行流式细胞仪检测细胞周期分布及荧光表达情况。结果成年山羊骨髓基质细胞在接种后24h开始贴壁，伸展成长梭形，原代细胞呈集簇状分布。在转染后4h即有细胞表达绿色荧光蛋白，荧光强度和表达细胞总数在48h达高峰，72h时见部分细胞荧光强度下降，传代后仍可观察到EGFP的表达。转染后4～72h转染上清液中分泌hIGF-Ⅰ的浓度呈逐渐上升趋势，在72h最高可达34．75ng／ml。转染后部分细胞形态发生变化。hIGF-Ⅰ免疫组化染色证实在胞浆中有大量棕黄色颗粒。RT-PCR证实有与hIGF-Ⅰ cDNA和IRES大小相符条带出现。流式细胞仪检测表明转染后骨髓基质细胞S期比例增加，荧光检测转染效率约22％。结论使用FuGene 6转染试剂可有效地转染体外培养的成年山羊骨髓基质细胞。在较长时间内有较高浓度的hIGF-Ⅰ蛋白质分泌人培养上清。hIGF-Ⅰ基因转染可促进骨髓基质细胞的增殖、分化。     

pcDNA3.1-BMP-2真核表达载体构建及转染兔骨髓基质细胞的实验研究

目的 构建人骨形态发生蛋白2(BMP-2)真核表达载体，鉴定并转染兔骨髓基质细胞，为转基因治疗骨缺失疾病提供实验基础。方法 双酶切克隆载体将BMP-2目的基因与真核表达载体pcDNA3．1连接，免疫组化及Western blotting检测转染BMP-2基因骨髓基质细胞的表达效果。结果 成功构建BMP-2真核表达载体，转染骨髓基质细胞后，有BMP-2表达。结论 骨髓基质细胞经基因转染后可以表达BMP-2。为进一步实验研究提供基础。     

pcDNA3-hBMP2基因转染成纤维细胞及其稳定表达

目的 探讨外源性hBMP2基因在成纤维细胞获得稳定表达的可行性。方法 将hBMP2的cDNA连入真核表达载体pcDNA3,形成重组真核表达载体pcDNA3-hBMP2,在脂质体介导下,将其导入小鼠成纤维细胞株（NIH3T3）。通过G418筛选获得阳性克隆,并继续培养4周,然后用原位杂交和免疫组织化学方法检测BMP2基因在成纤维细胞NIH3T3内的稳定表达情况。结果 经原位杂交和免疫组织化学证实,转染 pcDNA3-hBMP2后的成纤维细胞NIH3T3内有大量hBMP2 mRNA的转录和蛋白的表达。结论 在脂质体介导下,hBMP2基因能够导入成纤维细胞内并在其内获得稳定表达。     

人骨形成蛋白7基因重组35型腺病毒载体的构建与鉴定

目的探讨构建携带人骨形成蛋白7(human bone morphogenetic protein-7,hBMP-7)基因的重组35型腺病毒(serotype35adenovirus,Ad5F35)载体,为基因治疗研究提供一种新的方法,并观察其在兔骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达。方法以pcDNA1.1/Amp-hBMP7质粒为模板扩增骨形成蛋白(BMP-7)基因(1.3kb),将回收的PCR产物片段克隆入pDC316载体,获得重组质粒pDC316-hBMP7。骨架质粒pBHG-fiber5/35和穿梭质粒pDC316-hBMP7共转染293细胞,同源重组产生重组腺病毒rAd5/F35-hBMP7。同样的方法构建rAd5/F35-EGFP。在体外用不同感染复数(M.O.I)值的rAd5/F35-hBMP7和rAd5/F35-GFP分别转染兔MSCs,并留置空白对照。采用流式细胞仪、RT-PCR方法检测目的基因的转染效率和表达。结果PCR、酶切鉴定以及序列测定与比对分析表明,重组腺病毒rAd5/F35-hBMP7质粒构建正确。转染兔MSCs的最高效率可达99%,hBMP-7基因存在于转染后的MSCs中并表达相应的mRNA。结论本实验成功构建了含hBMP-7基因的重组腺病毒rAd5/F35-hBMP7载体,在体外能高效转染兔MSCs。     

人骨形成蛋白7基因重组2型腺相关病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人骨形成蛋白7基因（hBMP7）重组腺相关病毒载体,并观察其在兔骨髓间充质干细胞中的表达。方法将骨形成蛋白7基因片段克隆入穿梭质粒pUC18获得重组质粒pUC18-hBMP7。KpnⅠ和鼠Ⅱ双酶切质粒pUC18-hBMP7／与pSNAV,用T4DNA连接酶连接分别回收的两片段后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV—hBMP7／,转染BHK-21细胞,筛选培养,用能表达Rap和Cap的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSVl-rc／△UL2感染此细胞,裂解细胞收获病毒液。采用氯仿处理-PEG／NaCl沉淀-氯仿抽提法分离浓缩、纯化与测定病毒滴度。用rAAV2-hBMP7／和rAAV2-EGFP在体外分别转染兔骨髓间充质干细胞。流式细胞仪、RT-PCR和Western—blot方法检测兔骨髓间充质干细胞中hBMP-7基因的转录和表达。结果成功构建具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7／,病毒载体对兔骨髓间充质干细胞早期转染效率可达99．8％,hBMP7／在兔骨髓间充质干细胞中可得到转录和表达。结论成功构建了人骨形成蛋白7基因重组腺相关病毒载体,rAAV2-hBMP7／载体在体外可转染兔骨髓间充质干细胞,并获得较高的转染效率。     

重组pcDNA3.1-hBMP-2转染人骨髓基质干细胞和对其增殖及血管内皮生长因子表达的影响

目的构建人骨形成蛋白-2(hBMP-2)真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-2,转染人骨髓基质干细胞(MSCs),探讨基因转染对其增殖和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响. 方法利用重组DNA和基因克隆技术构建重组载体pcDNA3.1-hBMP-2;细胞培养和基因转染技术体外转染人MSCs;免疫细胞化学、原位杂交和蛋白印迹法检测细胞BMP-2的表达;通过流式细胞仪和VEGF探针原位杂交分析其对细胞增殖和VEGF表达的影响. 结果转染后细胞在mRNA水平和蛋白质水平均表达BMP-2;转染后S期细胞比例增多,提示细胞DNA的合成增加;BMP-2基因转染上调细胞VEGF的表达. 结论在脂质体介导下,pcDNA3.1-hBMP-2转染MSCs获得成功.基因转染后能促进细胞增殖并将通过使VEGF的表达增加促进血管再生,为进一步骨缺损的基因治疗及构建组织工程骨奠定了实验基础.     

趋化性细胞因子受体CXCR4基因表达对人骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响

目的探讨趋化性细胞因子受体CXCR4基因表达对人骨肉瘤细胞增殖和迁移的影响。方法Real-time PCR 检测人骨肉瘤细胞株 HOS-8603、U2OS 和 MG-63 中 CXCR4 mRNA 的表达情况;构建、鉴定pcDNA3/CXCR4 重组质粒并将其转染到 HOS-8603 细胞中（PCDNA3/CXCR4 组）,同时制备转染 pcDNA3 空质粒的阴性对照组（pcDNA3组）。MTT检测细胞增殖情况,穿膜小室重组细胞基底膜迁移实验检测细胞迁移情况。结果 HOS-8603细胞中CXCR4 mRNA相对表达含量低于U2OS、MG-63细胞（P 〈0.05）。转染后24、48h,pcDNA3/CXCR4 组 CXCR4 mRNA 表达量是 pcDNA3 组的 96 倍和 124 倍（P 〈0.05）。与 pcDNA3 组比较,转染后24、48、72 h,pcDNA3/CXCR4组细胞增殖率和发生迁移的细胞数明显增加（P 〈0.05）。结论 CXCR4的表达可能是促进骨肉瘤细胞增殖和迁移的重要因素。     

人血管生成素1真核表达载体的构建及在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的 探索构建人血管生成素1(human angiopoietin 1，hAng-1)真核表达载体，转染体外培养兔骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stemcells，MSCs)修复骨缺损的可能性。方法 基因重组和限制性内切酶酶切构建真核表达载体pcDNA3-hAng 1，经脂质体DOTAP介导质粒转染兔MSCs，G418筛选阳性克隆，RTPCR及免疫印迹杂交检测hAng-1 mRNA及蛋白表达。结果 重组真核表达载体pcDNA3-hAng-1经限制性内切酶Xho-I和BamH-I酶切后，电泳显示1．4kb hAng-1目的片段和5．4kb pcDNA3载体片段，转染兔MSCs后，RT-PCR检测出目的基因mRNA，免疫印迹杂交检出hAng-1的蛋白表达。结论 构建的真核表达载体pcDNA3-hAng-1能在转染的兔MSCs中表达，可以为组织工程骨修复奠定基础。     

Nesprin蛋白对骨髓间充质干细胞的影响

目的构建nesprin蛋白siRNA慢病毒载体(LV-siNesprin),感染骨髓间充质干细胞(MSCs),观察nesprin蛋白对MSCs的影响。方法针对nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,并将4对oligo退火成双链DNA,测序鉴定。将4种miRNA干扰质粒(SR-1、SR-2、SR-3、SR-4)转入大鼠血管平滑肌细胞,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blotting)检测干扰效应,筛选最佳干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达的目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应获得含干扰序列的LV-siNesprin+绿色荧光蛋白(GFP),包装慢病毒,测定病毒滴度。LV-siNesprin+GFP转染MSCs,Western blotting鉴定比较nesprin蛋白表达情况(分为LV-siNesprin+GFP组、GFP对照组和正常细胞组),用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞核形态改变和四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测MSCs感染LV-siNesprin后24 h、48 h、72 h和96 h的增殖情况(分为LV-siNesprin+GFP组、GFP对照组和正常细胞组)。结果测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和Western blotting筛选出最佳干扰miRNA质粒SR-3,成功构建LV-siNesprin,包装慢病毒,病毒悬液的活性滴度为1×106ifu/ml。LV-siNesprin转染MSCs后,nesprin蛋白表达明显下降,出现细胞核融合、核碎裂等形态学改变;MTT法检测显示,LV-siNesprin+GFP组MSCs增殖速度较GFP对照组和正常细胞组减慢。结论 Nesprin蛋白对MSCs核膜稳定维持核膜空间结构起作用,并利于细胞增殖更新。     

人VEGF165基因在狗骨髓基质细胞中的表达

目的 :检测转染 pcDNA3 hVEGF165狗骨髓基质细胞的VEGF165mRNA表达。方法 :用脂质体介导转染狗骨髓基质细胞 ,用免疫组化及RT PCR检测VEGFmRNA的表达。结果 :重组质粒 pcDNA3 hVEGF165转染骨髓基质细胞后 ,免疫组化及RT PCR检测有VEGFmRNA的表达。结论 :采用脂质体介导的方法可将hVEGF165基因转染至狗骨髓基质细胞并表达外源性基因     

丙型肝炎病毒核心蛋白诱导人胆管上皮细胞转化及成瘤实验

目的　探讨丙型肝炎病毒核心蛋白 (HCV -C)对人胆管上皮细胞 (BEC)的转化及致癌作用。方法　通过脂质体介导将含有HCV- C基因重组真核表达载体pcDNAHCV- C导入BEC细胞,G418筛选表达目的基因的细胞;聚合酶链反应 (PCR)及免疫组织化学SABC法检测细胞中HCV -C基因及蛋白的表达;细胞计数、锚着非依赖性生长实验、成瘤性检测等鉴定其生物学行为变化,免疫组织化学SABC法检测所致肿瘤组织中HCV- C蛋白表达。结果　HCV -C转染的BEC细胞中HCV- C蛋白表达于胞质,质粒pcDNAHCV C转染细胞的倍增时间较pcDNA3转染细胞和未转染BEC细胞明显缩短(分别为 14h, 28h, 30h)。pcDNAHCV C和pcDNA3转染细胞及未转染BEC在软琼脂中的克隆形成率分别为 36. 0%、2 .5%和 1 5% (P<0. 01)。3种细胞接种裸鼠后,pcDNAHCV C转染细胞注射组出现肿瘤,病理学检查证实为胆管细胞癌,肿瘤组织有HCV- C蛋白的表达。而pcDNA3转染细胞及未转染BEC细胞注射组在注射 36d后仍未见肿瘤发生。结论　HCV- C蛋白具有促胆管细胞转化和促进肿瘤发生的作用。