基于功能化纳米粒子的大肠杆菌O157:H7检测技术研究

目的建立一种无需增菌即能快速、灵敏检测大肠杆菌O157:H7的新方法。方法制备一种表面包被大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的纳米级免疫磁颗粒,用于样品中菌体的富集和分离;制备一种表面分别标记有大肠杆菌O157:H7多克隆抗体和生物素化核酸探针的胶体金颗粒;利用生物素-亲和素-酶系统信号放大作用,达到对目标菌的快速、灵敏检测。结果该方法可在1h内完成菌体的分离和检测,检测限为10cfu/ml。结论该检测体系基于功能化纳米粒子进行菌体分离及信号放大,具有检测时间短、灵敏度高、操作简便等优点,在环境、食品检测,临床诊断和流行病监测中具有广泛的应用前景。     

沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157∶H7的多重PCR快速检测体系的初步探讨

目的建立能在12小时内同时快速检测沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157∶H7的多重PCR体系。方法碱性蛋白胨水(BPW)非选择性增菌6h;100℃10min制备DNA模板;根据大肠杆菌O157∶H7的uidA基因、志贺菌的ipaH基因及沙门菌的invA基因序列设计各菌引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定体系灵敏度和特异性。结果该多重PCR体系能在12h内同时检测3种目的菌;灵敏度为10～30cfuml;通过对23株目的菌和15株非目的菌检测,提示该体系特异性高。结论初步探讨出能在12h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157∶H7的多重PCR体系。     

郑州市2005年肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染状况调查

目的：了解郑州市肠出血性大肠杆菌O157∶H7在腹泻病人中的检出情况和宿主动物带菌及毒力基因情况.方法：对采集的宿主动物和腹泻病人粪便及食品应用免疫磁珠富集分离法进行大肠杆菌O157∶H7分离和鉴定.结果：郑州市内共发现3例肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染病例,首次从腹泻病人中检出产毒O157∶H7菌株,采集5种以上动物粪便标本共计475份,从牛粪（247份）中分离到16株O157∶H7,检出率为6.48%,从羊粪（33份）中分离到3株O157∶H7,检出率为9.10%,并检出3株产毒O157∶H7菌株.采集5类市售食品共146份,未分离到O157∶H7.结论：郑州市存在发生肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染暴发或流行的潜在危险.     

鉴定大肠杆菌O157:H7特异基因的PCR方法

目的建立一种特异、灵敏鉴定大肠杆菌O157:H7的PCR检测方法。方法针对大肠杆菌O157:H7表面抗原O和鞭毛抗原H的特异性基因rfbO157、fliCH7设计引物,分别扩增出目的产物。结果利用建立的方法对4株大肠杆菌O157:H7菌及12株非大肠杆菌O157进行检测,rfbO157、fliCH7基因的特异性均为100%;rfbO157基因的灵敏度约为6×104cfu/ml;fliCH7基因的灵敏度可达6cfu/ml。结论本方法特异性好,为实验室鉴定大肠杆菌O157:H7提供了一种简单、容易操作的手段。     

大肠杆菌O157∶H7双重荧光PCR方法的建立与应用

摘要:目的　建立快速检测食品中大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR 方法。方法　针对大肠杆菌O157︰H7菌体抗原O和鞭毛抗原H的特异性基因rfbE（O157）和fliC（H7）筛选设计引物和探针,优化反应条件,建立可特异性检测大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR方法,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行评价,对模拟样品和实际样品进行初步验证。结果　利用建立的方法对2株大肠杆菌O157︰H7及12株非大肠杆菌O157︰H7进行检测,O157︰H7菌株检测结果均为rfbE和fliC阳性,非O157︰H7菌株检测结果均为阴性,rfbE和fliC基因的特异性均为100%;2基因的检测灵敏度可达1.16×102 CFU/ml;批内、批间变异系数均小于3.5％;模拟样品立即检测,2个基因的最低检出限（2.7×102 CFU/ml）和细菌纯培养时接近;实际样品检测结果与我国检验检疫行业标准（SN/T 0973-2010）的检测结果一致。结论　建立的荧光定量PCR 方法特异性及重复性好,灵敏度高,可快速准确鉴定大肠杆菌O157︰H7菌株。     

基于量子点和磁珠的大肠埃希菌O157∶H7检测研究

目的构建一种基于量子点和磁珠的大肠埃希菌O157∶H7的检测方法。方法以亲和素化磁珠结合生物素化的抗体制备修饰有大肠埃希菌O157∶H7抗体的磁珠,该磁珠可从检测体系中捕获大肠埃希菌O157∶H7,依次加入生物素化大肠埃希菌O157∶H7抗体、亲和素化Cd Se量子点后,分别经磁分离弃去未结合的分子,通过溶液的荧光吸收光谱的改变定量检测该菌。结果该方法特异性好,只有大肠埃希菌O157∶H7呈阳性反应,其余对照菌株均无明显反应;随着大肠埃希菌O157∶H7浓度的增大,655 nm处荧光值也逐步升高;并在1 h内实现对104cfu/ml的菌液的检测。结论本实验建立的这种方法检测时间短,结果易于判断,具有良好的临床应用前景。     

2000～2005年海盐县肠出血性O157:H7大肠埃希菌监测

目的：了解海盐县肠出血性O157：H7大肠埃希菌的分布及流行情况。方法：采取肠道门诊病人肛拭样和动物宿主粪便，采用免疫磁珠分离和大肠杆菌O157特异性单克隆抗体胶体金快速诊断技术以及特定培养基分离鉴定技术检测O157：H7大肠埃希菌。结果：从1例腹泻患者的大便中检了了1株O157：H7大肠埃希菌，不产生类志贺毒素；从动物粪便中检出7株O157大肠埃希菌。结论：海盐地区人群中感染率较低，且为非产毒株；猪、鸡是我地区O157：H7大肠埃希菌的主要贮存宿主动物。     

河北省食品中大肠杆菌O157∶H7分布及毒力研究

目的:掌握河北省食品中大肠杆菌O157∶H7分布状况及菌株的毒力研究.方法:运用免疫磁珠富集进行分离培养,并用PCR进行毒力基因分析.结果:共采集食品530份,检出O157∶H7大肠杆菌5株,总检出率为0.9%.其中,以生牛、羊肉检出率较高,分别为6.7%和4.4%.5株O157∶H7菌株中,4株带有SLT2、eae和Hly 3种毒力基因,1株带有SLT1、SLT2、eae和Hly 4种毒力基因.结论:掌握食品中O157∶H7分布及生物学特性对预防食源性疾病暴发有重要意义.     

郯城县2000~2001年O157大肠杆菌动物宿主带菌情况调查

目的:了解郯城县O157大肠杆菌动物宿主带菌情况。方法:标本直接接种mEC肉汤增菌液,先用免疫金标法筛选,后用免疫磁珠富集分离山梨醇麦康凯、麦康凯琼脂平板,点种CHROM agar O157显色琼脂平板,纯化菌进行生化反应、血清学等检测。结果:入户采集牛、驴、羊、猪、鸡等新鲜粪便,2000年共采集275份,检出4株O157∶H7,6株O157∶H-,2株O157∶H38,1株O157∶H19,1株O157∶H45,共计14株(5.09%);2001年共采集629份,检出4株O157∶H7,1株O157∶H-,1株O157∶H8,共计6株(0.95%)。结论:2000~2001年调查的动物宿主带菌率为2.21%。2001年调查的动物粪便带菌率比2000年明显下降(2χ=13.29,P<0.01)。     

大肠杆菌O_(157)∶H_7实时荧光PCR快速检测方法的建立

[目的]利用特异性荧光探针为特点的TaqM an荧光定量PCR技术,建立大肠杆菌O157∶H7污染的快速敏感特异的检测方法。[方法]以大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以大肠杆菌O157∶H7菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和Mg2+浓度,以大肠杆菌O157∶H7和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性。[结果]建立的反应体系在引物和探针的浓度为0.6μmoL/L、0.8μmoL/L,Mg2+浓度为4mmoL/L时,具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中,除大肠杆菌O157∶H7出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性。在纯菌条件下,定量检测低限为17 cfu/mL。同一样品重复检测3次C t值的变异系数均小于5%。[结论]该方法特异性强,稳定性高,操作简便快捷,适应食品微生物检验发展需要,具有较大的推广及应用价值。     

大肠杆菌O_(157)∶H_7的分离鉴定及应用复合PCR法同时检测其三个毒力因子

〔目的〕对驻滇部队感染性腹泻患者、猪和污水进行大肠杆菌O157∶H7(EO157∶H7)的分离鉴定。〔方法〕用O157免疫磁珠富集后 ,接种S -MAC琼脂平板培养 ,用MUG试验初筛 ,VIATEK3 2 全自动微生物鉴定仪鉴定 ,应用复合PCR法同时检测其三个毒力因子。〔结果〕从腹泻患者和猪中检出EcoliO157∶H7,该菌具有三个毒办因子。〔结论〕云南战区部队存在EcoliO157∶H7感染。复合PCR法的建立 ,为腹泻研究领域的病原学监测和流行病学调查提供了新手段     

广东省食品中O157:H7大肠杆菌分离株的生化特征、毒力因子与耐药性的探讨

目的:了解广东省食品中O157:H7大肠杆菌分离株中生化特征、毒力因子的携带与耐药情况。方法:采用免疫磁珠富集法进行O157:H7大肠杆菌分离,对O157:H7大肠杆菌分离株进行生化、噬菌体、血清学鉴定后,应用PCR技术检测其毒力因子,应用纸片法(K-B法)进行药敏试验。结果:从277份样品中分离出2株O157:H7大肠杆菌,总检出率为0.72%;对这2株O157:H7大肠杆菌分离株进行PCR毒力因子的测定,其中1株为携带eaeA、H ly和SLT2毒力因子的强毒株,而另1株分离株未检出毒力因子。药敏试验结果显示,这两个O157:H7大肠杆菌分离株对青霉素类、四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类5大类的部分抗生素有多重耐药性。结论:广东省食品中存在O157:H7大肠杆菌强毒株的污染。O157:H7大肠杆菌多重耐药株的出现,提示应关注我国畜牧养殖业抗生素的使用情况。     

广东省食品中0157:H7大肠杆菌分离株的生化特征、毒力因子与耐药性的探讨

目的了解广东省食品中O157H7大肠杆菌分离株中生化特征、毒力因子的携带与耐药情况.方法采用免疫磁珠富集法进行O157H7大肠杆菌分离,对O157H7大肠杆菌分离株进行生化、噬菌体、血清学鉴定后,应用PCR技术检测其毒力因子,应用纸片法(K-B法)进行药敏试验.结果从277份样品中分离出2株O157H7大肠杆菌,总检出率为0.72%;对这2株O157H7大肠杆菌分离株进行PCR毒力因子的测定,其中1株为携带eaeA、Hly和SLT2毒力因子的强毒株,而另1株分离株未检出毒力因子.药敏试验结果显示,这两个O157H7大肠杆菌分离株对青霉素类、四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类5大类的部分抗生素有多重耐药性.结论广东省食品中存在O157H7大肠杆菌强毒株的污染.O157H7大肠杆菌多重耐药株的出现,提示应关注我国畜牧养殖业抗生素的使用情况.     

PCR检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的研究快速、特异、灵敏的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法,并比较单一PCR和多重PCR对检测灵敏度的影响.方法选择O157∶H7的O抗原、H鞭毛抗原及SLT1和SLT2毒素基因特异的4对引物,分别或共同进行PCR扩增,检测40株O157∶H7和非O157∶H7菌株,将细菌按10+1～10+6稀释后比较PCR的检测灵敏度.结果所有O157∶H7菌株均在497 bp和625 bp处出现O157抗原基因和H7抗原基因产物,其产毒株在484 bp和(或)210 bp处出现SLT2和(或)SLT1基因产物,非O157∶H7菌株PCR结果均为阴性;单一PCR检测灵敏度为150 CFU/PCR反应,多重PCR为＞1 500 CFU/PCR反应.结论在经过增菌后,多重PCR比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便,为产毒和非产毒O157∶H7的诊断提供了新的手段.     

沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157：H7的多重PCR快速检测体系的初步探讨

目的建立能在12小时内同时快速检测沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157：H7的多重PCR体系。方法碱性蛋白胨水（BPW）非选择性增菌6h；100℃10min制备DNA模板；根据大肠杆菌O157：H7的uidA基因、志贺菌的ipaH基因及沙门菌的invA基因序列设计各菌引物，进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系，测定体系灵敏度和特异性。结果该多重PCR体系能在12h内同时检测3种目的菌；灵敏度为10～30cfu／ml；通过对23株目的菌和15株非目的菌检测，提示该体系特异性高。结论初步探讨出能在12h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157：H7的多重PCR体系。     

福建省食品污染物监测O157∶H7大肠杆菌的调查与分析

目的:对福建省食品中O157∶H7大肠杆菌进行分离调查,并对分离菌株的O157抗原编码基因(rfbO157)和H7抗原编码基因(flicH7)以及毒力基因(志贺毒素基因stx、粘附抹平因子基因eaeA、溶血素基因hlyA)进行检测。方法:按照《全国食品污染物检测相关实验室操作手册(食源性致病菌部分)》的要求,用EC肉汤增菌,快诊金卡筛选,接种CHROM agar O157显色平板,血清和生化系列证实。结果:1 380件食品中分离到O157∶H7大肠杆菌4株,分别为福州的生猪肉和水产品蚶中各1株、尤溪的冻鸡肉2株,检出率0.29%。结论:福建省食品中存在O157∶H7大肠杆菌的污染,虽检出率较低,这可能与福建不是O157∶H7大肠杆菌的流行地区有关,但监测是一项长期的工作,防患于未然,同时福建省也将O157∶H7大肠杆菌列入了食品安全预警系统的一部分。     

南京市疾病预防控制中心细菌实验室2007年能力验证结果分析

[目的]通过能力验证提高微生物实验室检测能力,检验人员技术水平,增强实验室竞争力.[方法]依据国家标准GB/T 4789-2003中对沙门氏菌、致病性大肠埃希氏菌检测方法结合沙门菌,大肠杆菌O157∶H7显色培养基及ATB生化鉴定仪对样品进行鉴定.[结果]经分离鉴定,PTA 101样品中检出2株沙门菌,分别是巴拿马沙门菌和肯塔基沙门菌; PTB077样品中检出大肠杆菌O157∶H7,而PTA385和 PTB260中未检出目标菌.[结论]本次能力验证使用选择性强,特异性高的显色培养基及快速生化鉴定条(ATBID32E),克服了国标中致病菌检测周期长的特点,使检测更加快速、特异、敏感,取得满意结果.     

厂东省食品中O157：H7大肠杆菌分离株的生化特征、毒力因子与耐药性的探讨

目的：了解广东省食品中O157：H7大肠杆菌分离株中生化特征、毒力因子的携带与耐药情况。方法：采用免疫磁珠富集法进行O157：H7大肠杆菌分离，对O157：H7大肠杆菌分离株进行生化、噬菌体、血清学鉴定后，应用PCR技术检测其毒力因子，应用纸片法（K—B法）进行药敏试验。结果：从277份样品中分离出2株O157：H7大肠杆菌，总检出率为0．72％；对这2株O157：肿大肠杆菌分离株进行PCR毒力因子的测定，其中1株为携带eaeA、Hly和SLT2毒力因子的强毒株．而另1株分离株未检出毒力因子。药敏试验结果显示，这两个O157：H7大肠杆菌分离株对青霉素类、四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类5大类的部分抗生素有多重耐药性。结论：广东省食品中存在O157：H7大肠杆菌强毒株的污染。O157：肿大肠杆菌多重耐药株的出现，提示应关注我国畜牧养殖业抗生素的使用情况。     

郯城县O157大肠杆菌动物宿主带菌情况调查

[目的]了解郯城县O157大肠杆菌动物宿主带菌情况。[方法]标本直接接种mEC肉汤增菌液,先用免疫金标法筛选,后用免疫磁珠富集分离山梨醇麦康凯、麦康凯琼脂平板,点种CHROMagar O157显色琼脂平板,纯化菌进行生化反应、血清学等检测。[结果]入户采集牛、驴、羊、猪、鸡等新鲜粪便275份,共检出4株O157：H7,6株O157：H-,2株O157：H38,1株O157：H19,1株O157：H45,共计14株。[结论]2000年调查的动物粪便带菌率为5.09%。     

多重PCR检测粪便中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157:H7方法的研究

[目的]建立12h内快速检测粪便中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157︰H7的多重PCR方法。[方法]探讨已报道的多重PCR体系检测粪便中3种目的菌的可行性,根据沙门菌invA基因、志贺菌ipaH基因及大肠杆菌O157︰H7rfbE基因筛选设计新引物,优化反应条件,测定方法灵敏度和特异性。8h短时增菌后,对24份模拟粪便样品进行检测。[结果]已报道的多重PCR体系不适用于粪便中3种目的菌的检测;新建立的体系适用于粪便样品的检测,能在12h内同时检测3种目的菌。通过短时增菌,该体系对粪便样品中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157︰H7的灵敏度分别为:8.5cfu/10ml增菌液,27cfu/10ml增菌液,5cfu/10ml增菌液。对28株目的菌和13株非目的菌的检测结果表明该方法具有良好特异性。[结论]成功建立能在12h内同时检测粪便样品中沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157︰H7的多重PCR检测方法,该方法特别适用于健康带菌者3种目的菌的快速筛查,为卫生检验检疫、食品微生物安全的监测和监督提供一有用的工具。