RNAi沉默STAT3基因联合mTOR抑制剂rapamycin诱导BEL-7402肝癌细胞凋亡

目的：探讨PI3K/AKT/mTOR和JAK/STAT3 2条信号转导途径共同作用对肝癌细胞凋亡的影响,为肝癌基因治疗提供依据。方法：选取对数生长期BEL-7402细胞,随机分为对照组、mTOR抑制剂rapamycin(Rapa)组、阴性质粒组、阴性质粒+ Rapa组、STAT3-siRNA质粒组和STAT3-siRNA 质粒+Rapa组,应用LipofectamineTM 2000转染试剂将含有目的基因的质粒转染BEL-7402细胞,同时应用rapamycin,分别采用流式细胞术和Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡率和形态学的变化,JC-1 荧光染色观察线粒体膜电位(ΔΨm)变化,Western blotting法检测活性caspase-3蛋白表达水平。结果：STAT3-siRNA+Rapa组细胞凋亡率为60.22%±0.87%,明显高于其他各组(P<0.05),且细胞ΔΨm明显降低(27.28%±1.82%,P<0.05);Hoechst33258荧光染色检测,见STAT3-siRNA有大量细胞出现细胞核聚集、边缘化和核
碎裂等典型细胞凋亡形态;Western blotting检测,STAT3-siRNA+Rapa组活性caspase-3蛋白表达水平明显高于其他各组（P<0.05）。结论：RNAi沉默BEL-7402肝癌细胞STAT3基因联合rapamycin可促进BEL-7402肝癌细胞的凋亡,二者具有明显的协同作用。     

RNAi沉默STAT3基因对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的：研究pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒对人卵巢癌SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,阐明RNA干涉技术在卵巢癌生物治疗领域中的作用。方法：应用人卵巢癌细胞系SKOV3对15例裸鼠建立人卵巢癌皮下移植瘤模型,随机分为3组：对照组（生理盐水）、空质粒对照组及重组质粒组（pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3）。应用电子穿孔仪将质粒转入裸鼠移植瘤内,观察重组质粒注射后第7、14、21和28天各组裸鼠皮下移植瘤体积变化。利用Western blotting检测重组质粒对STAT3蛋白表达的影响,采用HE及TUNEL染色方法观察肿瘤组织形态变化及细胞凋亡情况。结果：重组质粒瘤内注射对SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长有明显的抑制作用,与2个对照组比较,重组质粒组裸鼠移植瘤生长速度明显减慢（P<0.01）。重组质粒组瘤体内STAT3及CyclinD1、VEGF、survivin、c-myc蛋白表达明显低于2个对照组（P<0.01）。HE染色显示,重组质粒组肿瘤细胞出现大片细胞坏死,2个对照组肿瘤细胞以正常形态居多。TUNEL染色显示,重组质粒组癌组织有大量细胞凋亡,2个对照组几乎均为TUNEL阴性反应细胞。结论：pSilencer1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒能明显抑制人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠皮下移植瘤的生长。     

STAT6基因沉默对结肠癌细胞增殖的影响

目的:研究细胞信号传导子和转录激活子6(STAT6)信号传导通路与结肠癌细胞增殖的关系及其可能机制。方法:构建STAT6特异的shRNA慢病毒表达载体,转染人结肠癌细胞HT-29,以阻断STAT6信号通路;用RT-PCR方法检测STAT6 mRNA表达和流式细胞术检测磷酸化STAT6蛋白(pSTAT6)表达来验证构建效果;流式细胞术分析细胞周期变化;MTT法检测肿瘤细胞增殖状况;RT-PCR和Western blot观察p21^(WAF1)、p27(WAF1)、p27^(KIP1)基因表达。结果:成功构建STAT6特异的shRNA慢病毒表达载体;STAT6基因沉默的结肠癌细胞中细胞增殖受到明显抑制(F=62.527,P<0.001);STAT6信号通路被阻断的结肠癌细胞中p21(KIP1)基因表达。结果:成功构建STAT6特异的shRNA慢病毒表达载体;STAT6基因沉默的结肠癌细胞中细胞增殖受到明显抑制(F=62.527,P<0.001);STAT6信号通路被阻断的结肠癌细胞中p21^(WAF1)、p27(WAF1)、p27^(KIP1)基因表达明显增多(P<0.01)。结论:STAT6信号传导通路能促进结肠癌细胞增殖,可能是通过调节p21(KIP1)基因表达明显增多(P<0.01)。结论:STAT6信号传导通路能促进结肠癌细胞增殖,可能是通过调节p21^(WAF1)、p27(WAF1)、p27^(KIP1)基因的表达起作用。     

STAT3基因沉默抑制人白血病细胞体外生长的实验研究

目的:构建人STAT3 shRNA(short hairpin RNA)慢病毒载体,研究慢病毒介导的STAT3 SiRNA(small interferenceRNA)对人慢性粒细胞白血病K562细胞体外生长特性的影响。方法:针对STAT3基因RNAi有效靶点构建STAT3 shRNA慢病毒载体,293T细胞内包装产生STAT3 SiRNA慢病毒,感染K562细胞后RT-PCR和Western-blot方法验证STAT3基因的敲减效率;细胞生长曲线和MTT法观察STAT3敲减后K562细胞体外生长和增殖情况;流式细胞术和Annexin V-FITC/PI法检测细胞周期改变和早期凋亡。结果:成功得到STAT3 SiRNA慢病毒,RT-PCR和Western-blot实验证实,针对其中两个靶点的STAT3 SiRNA对STAT3基因的敲减效率均在70%以上(P<0.05)。STAT3敲减后,K562细胞生长变慢,细胞增殖活性降低40%(P<0.05);细胞阻滞于G1→S期,并出现早期凋亡。结论:STAT3 SiRNA慢病毒可有效抑制K562细胞内STAT3基因表达,使细胞生长增殖受抑,细胞周期阻滞,细胞出现早期凋...     

顺铂处理联合STAT3 RNA干扰对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：探讨顺铂处理联合STAT3 RNA干扰对宫颈癌细胞增殖的影响。方法：实验分为对照组、顺铂组及联合组,联合组采用脂质体法转染STAT3的RNA干扰序列,Real time PCR 检测 RNA表达,CCK－8细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖。结果：与对照组相比,STAT3 mRNA在RNA干扰后下降约75％,表明成功干扰STAT3的基因表达。对Hela细胞的增殖影响,与对照组相比,细胞增殖抑制率在24 h,48 h,72 h分别为顺铂组：65．1％,72．5％,75．9％,联合组：75．4％,85．6％,89．1％。其中联合组与顺铂组比较差异有统计学意义（ P ＜0．05）。结论：顺铂处理联合STAT3 RNA干扰可显著抑制细胞增殖,其作用优于单独顺铂作用。     

肺腺癌A549细胞STAT3基因沉默对细胞周期分布和凋亡水平变化的影响

目的：研究沉默STAT3基因表达前后肺腺癌A549细胞的细胞周期分布状况和细胞凋亡水平变化及其意义。方法：利用流式细胞仪（FCM）检测RNA干扰（RNAi）技术沉默STAT3基因表达前后肺腺癌A549细胞的细胞周期状况和细胞凋亡水平变化。结果：STAT3沉默后,肺腺癌A549细胞大量处于G0／G1期（P〈0．05）,而S、G2／M期的细胞相对减少（P〈0．05）;并且细胞凋亡明显增多,前48h增长明显（R0．05）,48h后增长趋于平稳（P〉0．05）,但仍能较长时间维持较高水平。结论：STAT3siRNA能阻断A549细胞的细胞周期,使细胞周期停留在G0／G1期,不能进入S期,不能完成DNA的合成,无法进入M期,未完成细胞的分裂,并能诱导肺腺癌A549细胞的凋亡,提示STAT3的表达与A549细胞的细胞周期和凋亡密切相关。     

STAT3小干扰RNA的构建及其对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建以STAT3为靶基因的短发夹状小干扰RNA表达载体,并探讨STAT3小干扰RNA表达载体对人结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响。方法：以pGPU6／GFP／STAT3质粒为载体,构建STAT3的小干扰RNA表达载体,使用脂质体法转染人结肠癌HCT116细胞系,用M1Tr法检测空白对照组、小干扰RNA组、阴性对照组与脂质体对照组的增殖活性,48h后流式细胞仪分析4组细胞周期分布与凋亡的变化,并且通过RT—PCR和Westernblot检测结肠癌HCTll6细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平。结果：酶切鉴定和测序分析表明靶向STAT3的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染HCT116后,STAT3的mRNA和蛋白水平较空载体转染组显著下降;小干扰RNA组与3对照组相比细胞增殖活性明显受到抑制（P〈0．01）;细胞生长明显减缓,G0／G1期细胞比例增加（P〈0．01）。结论：沉默STAT3基因可有效控制结肠癌细胞的增殖,使癌细胞阻滞于G0／G1期并诱导其凋亡,可望成为结肠癌治疗的新方法。     

STAT3基因沉默对结肠癌细胞SW480凋亡的影响

目的:探讨转染信号传导和转录激活子3(STAT3)的短发夹RNA(shRNA)对结肠癌细胞SW480凋亡的影响,为结肠癌的基因治疗提供实验依据。方法:设计、构建针对STAT3的shRNA真核表达载体,脂质体法转染SW 480细胞,MTT法观察细胞增殖情况,流式细胞仪检测检凋亡,QRT-PCR检测STAT3、Bcl-2、Caspase-3mRNA的变化。结果:成功构建了携带STAT3基因的shRNA的重组质粒,PCR和测序证实重组质粒构建正确。重组质粒转染结肠癌细胞后,细胞增值活性明显减弱,细胞阻滞于G1→S期,并出现早期凋亡。重组质粒转染组STAT3 mRNA的表达与对照组相比明显减弱(P<0.01),同时Bcl-2表达增强、Caspase-3mRNA表达减弱(P<0.05)。结论:STAT3 shRNA能抑制结肠癌细胞的增值,促进其凋亡,其促凋亡机制可能与STAT3基因沉默后影响Bcl-2、Caspase-3凋亡基因的表达有关。     

RNA干扰信号转导与转录因子3基因对宫颈癌Hela细胞增殖的影响

目的：利用RNA干扰技术沉默信号转导与转录因子STAT3的基因表达,检测其对Hela细胞的增殖的影响。方法：本次实验将其分组为Normal Control 组（NC组）及siSTAT3组两组。采用脂质体法转染siSTAT3,用Real time PCR检测STAT3的mRNA表达,用Western blot检测蛋白表达,用CCK-8法检测Hela细胞的增殖。结果：将两组的各项数据进行对比。对转录结果进行对比发现,siSTAT3组中的STAT3 mRNA 表达较NC组中的STAT3 mRNA 表达下降显著,其下降水平约为70%;对蛋白表达结果进行对比发现,siSTAT3组中的STAT3蛋白表达较NC组中的STAT3蛋白表达下降显著,其下降水平约为53%,上述数据显示,利用RNA干扰技术可成功地干扰了STAT3的基因表达。而siSTAT3组在对Hela细胞增殖的影响方面与NC组相比,其在24h,48h,72h,Hela细胞增殖的抑制率约分别为15.5%,29.4%,30.4%。结论：利用RNA干扰技术沉默信号转导与转录因子STAT3的基因表达可抑制Hela细胞的增殖。     

RNAi沉默Smad4基因表达对人前列腺癌细胞增殖的影响

目的 观察RNA干扰技术沉默Smad4基因表达对人前列腺癌细胞增殖能力的影响,探讨Smad4在前列腺癌恶性进展中的作用.方法 用半定量RT-PCR和Western blot方法检测LNCaP、PC-3、DU145以及ARCaP亚细胞系IF11、IA8等多种不同前列腺癌细胞Smad4 mRNA及蛋白表达的情况,筛选出Smad4基因阳性表达的细胞;针对Smad4基因不同部位设计并化学合成3对不同的靶向小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),脂质体介导瞬时转染阳性表达Smad4的细胞,转染后48 h分别用RT-PCR和Western blot检测Smad4 mRNA及蛋白表达水平的变化,用MTT法检测沉默Smad4表达对细胞增殖的影响.结果 检测的5种前列腺癌细胞中仅LNCaP、PC-3、DU145 3种细胞表达Smad4 mRNA及蛋白;选择PC-3细胞做siRNA转染,与阴性对照序列组(siRNA-NC)相比,转染48 h后,转染SiRNA1、SiRNA2、SiRNA3的3组PC-3细胞的Smad4 mRNA表达水平均显著下降,但仅有siRNA3组Smad4蛋白表达水平显著降低.转染SiRNA3沉默Smad4基因表达后PC-3细胞的体外增殖能力显著增强(P＜0.05).结论 不同前列腺癌细胞Smad4基因的表达存在差异,靶向siRNA下调Smad4的表达可增强前列腺癌细胞的增殖能力.     

STAT3 siRNA对肺腺癌A549细胞STAT3及其下游基因表达的影响

目的：观察RNA干扰沉默STAT3基因对人肺腺癌A549细胞STAT3、CyclinD1、Bcl-2、BAX、Caspase-9蛋白表达的影响及其相关性及对细胞生长的影响,探讨肺癌基因治疗的新途径。方法：采用化学合成法,合成针对STAT3基因不同位点设计的3条小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）序列（siRNA1-3）和1条带有荧光标记的应用STAT3-siRNA转染处理人肺腺癌细胞系A549,转染16h后荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR检测STAT3基因表达的变化,蛋白免疫印迹法检测转染后A549细胞STAT3,CyclinD1,BAX,Bcl-2,Caspase-9蛋白表达,AM-BLUE检测A549细胞生长情况。结果：经RNA干扰能有效减低A549细胞STAT3mRNA表达水平（P〈0.05）,转染后A549细胞STAT3、CyclinD1、Bcl-2蛋白的表达水平均显著降低（P〈0.05）,而BAX、Caspase-9蛋白的表达水平升高（P〈0.05）。STAT3蛋白表达分别与CyclinD1、Bcl-2蛋白表达呈正相关（r=0.854,0.910,P〈0.05）;与BAX蛋白表达程负相关性（r=-0.848,P〈0.05）;与Caspase-9蛋白表达程无相关性（r=-0.787,P〉0.05）。RNA干扰法沉默STAT3基因后,A549细胞增殖受到明显抑制。结论：STAT3-siRNA可有效抑制STAT3、CyclinD1、Bcl-2在人肺腺癌A549细胞中的表达,升高BAX、Caspase-9在人肺腺癌A549细胞中的表达,抑制A549细胞生长。     

STAT3-siRNA对人结直肠癌细胞SW480的干涉作用

【目的】应用经小干扰RNA（shortinterfereRNA，smNA）表达盒介导的RNAj对结直肠癌细胞中的STAT3基因进行干涉作用以研究STAT3-siRNA对STAT3基因表达阳性的结直肠癌细胞凋亡的影响。【方法】用脂质体转染试剂将STAT3-siRNA表达盒（STAT3-siRNA expression cassettes，STAT3-SECs）体外转染至人结直肠癌SW480细胞及人成纤维细胞中。于48h后收集细胞，先经荧光染色方法观察细胞表象变化，再通过流式细胞仪检测人结直肠癌SW480细胞凋亡情况，最后分别提取细胞总RNA，用RT—PCR测定STAT3基因在mRNA水平的表达。【结果】SW480STAT3-SECs组的细胞可见凋亡小体，出现明显的凋亡现象，而其它实验组均未出现明显的凋亡现象。流式细胞术结果显示SW480STAT3-SECs组中凋亡细胞百分比由0．2％增加至26．0％；S期细胞比率由32．3％下降至9．2％。在mRNA水平上，SW480STAT3-SECs组细胞的STAT3基因表达减少了（62．16±12．50）％，显著低于SW480对照组（P〈0.01）。【结论】应用RNAi技术沉默STAT3基因可以降低人结直肠癌SW480细胞中STAT3的表达，诱导细胞的凋亡。     

RNAi沉默Galectin-1基因对HePG2 肝癌细胞增殖、凋亡的影响

目的 建立小干扰RNA(siRNA)抑制Galectin-1 基因表达的实验条件,观察利用siRNA选择性抑制Galectin-1基因表达对人肝癌细胞系HePG₂生长、凋亡及迁移能力的影响。方法 用RT-PCR技术检测siRNA对HePG₂细胞Galectin-1基因沉默的效率; 用流式细胞术检测HePG₂ Galectin-1基因沉默前后细胞凋亡率; 以四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测Galectin-1基因沉默对HePG₂细胞增殖的影响;用Millecell小室检测Galectin-1基因沉默对HePG₂细胞侵袭人工基底膜能力的影响。结果 与siRNA转染前比较,转染后人肝癌细胞系HePG₂细胞中Galectin-1 基因表达率明显下降(100.0% vs 10.3%,P<0.01),HePG₂细胞凋亡率明显上升(0 vs 22.5%,P<0.01),HePG₂细胞增殖率显著下降(100.0% vs 54.0%,P<0.01), HePG₂细胞的迁移能力明显受抑(100.0% vs 52.3%,P<0.01)。结论 基于mRNA的siRNA干扰技术可以有效抑制Galectin-1 基因在人肝癌细胞系HePG₂中的表达;Galectin-1基因沉默对人肝癌细胞系HePG₂的生物学行为具有明显的阻遏效应。由此推测,Galectin-1基因表达在肝细胞癌的发生、发展中起重要作用。     

小鼠STAT3基因干扰质粒的构建及其效果鉴定

目的构建小鼠STAT3基因的特异性RNA干扰质粒,并鉴定其在细胞水平的抑制效果.方法采用DNA载体介导的RNA干扰技术构建小鼠STAT3基因的特异性RNAi质粒(pBS/U6/STAT3-siRNA),并通过RT-PCR、免疫印迹、免疫细胞化学染色等技术对pBS/U6/STAT3-siRNA的抑制效率进行鉴定.结果经双酶切鉴定筛选出4个阳性干扰质粒,分别转入293T细胞后均可明显降低STAT3的表达,尤以靶向( 2 334～ 2 351)位点的质粒干扰效率最高,达70%.结论小鼠STAT3基因的特异性干扰质粒(pBS/U6/STAT3-siRNA)能从蛋白及mRNA水平上特异和高效地抑制STAT3基因的表达.这种DNA载体介导的双链RNA干扰质粒为进一步探究STAT3与胚胎发育的相关功能提供一种有效的研究工具.     

DcR 3 基因对胰腺癌裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响

目的 探讨RNA 干扰沉默诱骗受体-3（DcR3）对人胰腺癌细胞裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响 及其可能机制。方法 取对数生长期的AsPC-1 细胞1×106 个/ml,接种于5 周龄裸鼠右后肢腹股沟,当皮下肿瘤 直径为8 mm,随机分为4 组（n =10）：对照组、化疗组、阴性质粒+ 化疗组、DcR3-siRNA+ 化疗组。观察 DcR3-siRNA 联合化疗药物对人胰腺癌AsPC-1 细胞裸鼠移植瘤的治疗效果。应用ELISA 和Western blot 检测DcR3 蛋白的变化;TUNEL 分析肿瘤细胞凋亡;Western blot 和RT-PCR 检测FasL、Caspase-8 和 Caspase-3 等凋亡因子的表达。结果 化疗组、阴性质粒+ 化疗及DcR3-siRNA+ 化疗组3 组均可抑制移植瘤的生 长,与对照组比较,3 组抑瘤率平均值分别为（35.87±4.58）%、（40.68±4.16）% 和（90.25±2.53）%,4 组比较 差异有统计学意义（F =47.736,P =0.000）,DcR3 siRNA+ 化疗组抑瘤率较化疗组升高;对照组、化疗组、阴 性质粒+ 化疗以及DcR3-siRNA+ 化疗组移植瘤重量平均值分别为（0.95±0.03）、（0.63±0.04）、（0.67±0.02） 和（0.17±0.06）g,4 组比较差异有统计学意义（F =85.531,P =0.000）,DcR3-siRNA+ 化疗组瘤重较化疗组减轻; 对照组、化疗组、阴性质粒+ 化疗组、DcR3-siRNA+ 化疗组凋亡率平均值分别为（6.3±2.21）%、（14.8±2.65） %、（14.5±3.06）% 和（54.6±3.23）%,4 组比较差异有统计学意义（F =104.225,P =0.000）,DcR3-siRNA+ 化疗组凋亡率较化疗组提高;DcR3-siRNA+ 化疗组的FasL、Caspase-8 和Caspase-3 蛋白表达较其他各组上 升（P =0.000）。结论 沉默DcR3 可激活FasL/Caspase 凋亡途径,促进细胞凋亡,增加胰腺癌细胞移植瘤对化 疗的敏感性。     

DcR3基因对胰腺癌裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响

目的探讨RNA 干扰沉默诱骗受体-3（DcR3）对人胰腺癌细胞裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响及其可能机制。方法取对数生长期的AsPC-1 细胞1×106个/ml,接种于5 周龄裸鼠右后肢腹股沟,当皮下肿瘤直径为8 mm 左右,随机分为4 组（ n=10）：对照组、化疗组、阴性质粒+ 化疗组、DcR3 siRNA+ 化疗组。观察DcR3 siRNA联合化疗药物对人胰腺癌AsPC-1细胞裸鼠移植瘤的治疗效果。应用ELISA和Western blot检测DcR3 蛋白的变化;TUNEL 分析肿瘤细胞凋亡;Western blot 和RT-PCR 检测FasL、Caspase-8 和Caspase-3 等凋亡因子的表达。结果化疗组、阴性质粒+ 化疗及DcR3 siRNA+ 化疗组均可抑制移植瘤的生长,与对照组比较,3 组抑瘤率平均值分别为（35.87±4.58）%、（40.68±4.16）%和（90.25±2.53）%,4 组间差异有统计学意义（F =47.736,P =0.000）,DcR3 siRNA+ 化疗组抑瘤率较化疗组增加;对照组、化疗组、阴性质粒+ 化疗以及DcR3 siRNA+ 化疗组移植瘤重量平均值分别为（0.95±0.03）、（0.63±0.04）、（0.67±0.02）和（0.17±0.06）g,4 组间差异有统计学意义（F =85.531,P =0.000）,DcR3 siRNA+ 化疗组瘤重较化疗组减轻;对照组、化疗组、阴性质粒+化疗组、DcR3 siRNA+化疗组凋亡率平均值分别为（6.3±2.21）%、（14.8±2.65）%、（14.5±3.06）%和（54.6±3.23）%,4 组间差异有统计学意义（F =104.225,P =0.000）,DcR3 siRNA+ 化疗组凋亡率较化疗组增加;DcR3siRNA+化疗组的FasL、Caspase-8 和Caspase-3 蛋白表达较其他各组上升（P =0.000）。结论沉默DcR3 可激活FasL/Caspase 凋亡途径,促进细胞凋亡,增加胰腺癌细胞移植瘤对化疗的敏感性。