急性HBV感染期或感染后对肝内HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞的分析

背景与目的:由于考虑到常规肝活检后相关并发症的风险性,对急性乙型肝炎病毒(H BV)感染者的肝内病毒特异性T细胞反应的特点尚无明确研究。该研究旨在应用细针抽吸活组织检查(FNAB)法对急性H BV感染者肝脏内的病毒特异性CD8+T细胞反应进行分析。方法:对H LA-A2阳性的急性H BV感染者分别于初次接诊时、H BsA g血清转换时、H BsAg血清转换3个月后进行FNA B。在FNA B抽吸出的细胞和外周血(PB)中应用H LA-A2四聚体识别H BV特异性CD8+T细胞。结果:在初诊时,肝内CD8+T细胞的存在与肝脏损伤的程度具有相关性。在每次FNAB后的…     

慢性HCV感染者肝内功能不良性CD8~+T细胞的聚集机制

背景与目的:H CV的慢性感染可导致肝纤维化和癌变。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的免疫反应与病毒清除或持续感染有关,并因此决定疾病的进程。方法:采集32例慢性H CV感染者肝内和外周血的CD8+T细胞,应用流式细胞仪分析CD3激发后的细胞表面分化标记、IFN-γ和TNF-α的生成、脱颗粒能力及穿孔素的成分。同时采集13例非病毒性肝病患者的CD8+T细胞作为对照。结果:无论其终末期前和终末期的分化因子(CCR7-CD45RA-/+)表型如何,H CV感染者肝内CD8+T细胞对T细胞受体(TCR)介导的刺激反应均弱于未感染者,这种缺陷与肝纤维化程度相关。…     

慢性HCV感染者IL-2分泌性CD4~+T辅助细胞的选择性缺失

在大多数丙型肝炎病毒(H CV)感染个体中,病毒持续存在并逃避宿主的适应性免疫反应,但目前还不清楚其免疫逃避机制。已有数个研究小组使用细胞增殖法及最近的二级四聚体方法证实H CV特异性CD4+T细胞在慢性H CV感染中反应减弱或缺乏。然而,目前对感染消退期和持续感染的H CV特异性CD4+T细胞的功能状态了解还很少。本研究采用酶联免疫斑点法检测干扰素γ(IFN-γ)和白介素-2(IL-2),分析了慢性感染患者细胞因子分泌模式,并将其与感染消退期进行比较。在自限性感染组中,IL-2高分泌与IFN-γ分泌有关。但是在持续感染组中与IFN-γ分泌…     

皮肤鳞状细胞癌患者中p53特异性CD8~+T细胞的反应

背景:系统性免疫抑制是发生皮肤鳞状细胞癌(SCC)的一个高危因素。在皮肤SCC皮损中,90%的p53发生突变和过度表达。尽管有相当的证据表明免疫反应在皮肤SCC发生中起重要作用,但尚无研究证明有潜在的肿瘤相关抗原。目的:验证皮肤SCC患者的循环中存在p53特异性功能性CD8+T细胞的假说。方法:采用γ干扰素免疫吸附法筛查H LA-A30201阳性患者和对照者外周血单核细胞对6个p53衍生性H LA-A30201限制性抗原表位的反应性。结果:26例皮肤SCC患者中的7例和10例对照者中的1例p53特异性CD8+T细胞出现频率显著升高。淋巴细胞浸润程度与p53抗原表…     

感染HCV妇女生育的儿童的CD4~+淋巴细胞对丙型肝炎病毒的特异性反应

背景与目的:T淋巴细胞对病毒抗原的特异性反应可能是宿主感染病毒后的免疫学标志。本文目的是研究垂直感染丙型肝炎病毒(H CV)是否会激活H CV特异性的T细胞反应,从而做为以前接触过该病毒的生物标记,这可能对解释H CV低垂直传播率有作用。方法:本文研究了28例由慢性H CV感染妇女生育的儿童。在培养的外周血单核细胞(PBM Cs)经H CV多肽刺激后,评估了H CV特异性的CD4+淋巴细胞的活化、增殖及细胞因子的产生。结果:在28例儿童中发现20例H CV特异性CD4+淋巴细胞反应。儿童H CV特异性CD4+淋巴细胞增殖比其母亲更频繁、更活跃。儿…     

乳糜泻患者麸质激发试验后外周血T细胞的改变

背景:目前体外研究表明,乳糜泻(CD)患者的T细胞抗原决定簇主要来自于肠道T细胞克隆。T细胞克隆能识别对T细胞有刺激作用的麸质多肽,但患者体内麸质多肽对其总体特异性T细胞免疫应答的作用无法量化。目的:确定H LA-DQ2CD患者体内公认的优势T细胞抗原决定簇对总体麸朊T细胞免疫应答的作用。患者:H LA-DQ2阳性CD患者和健康对照者。方法:研究对象每日摄入20g麸质,持续3d。酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测外周血单核细胞(PBM C)γ干扰素(IFN-γ)水平,以此反映麸质激发前后多肽和麸质特异性T细胞的水平。结果:在59例CD患者中有50例,…     

程序性死亡因子1高表达影响急性乙型肝炎患者体内乙肝病毒特异性CD8+T细胞凋亡的研究

目的 观察急性乙型肝炎发病过程中患者体内病毒特异性CTL细胞上免疫抑制性分子程序性死亡因子1(programmed death 1,PD-1)的表达与凋亡的关系.方法 针对HBV不同表位合成2种pentamer,同时针对CMV表位合成pentamer作为对照.采集15例HLA-A2阳性的急性乙型肝炎患者(AHB)的外周血,流式细胞仪分析各病毒特异性CTL细胞表面PD-1分子表达水平及其凋亡水平;同时进行体外实验验证PD-1表达与凋亡的关系.结果 AHB患者发病早期HBV特异性的CD8+T细胞表面PD-1表达水平明显增高,增高的PD-1水平与HBV特异性CD8+T细胞自发凋亡呈明显正相关;体外共培养HepG2.215细胞与AHB患者CD8+T细胞,可明显诱导CD8+T细胞凋亡.结论 在HBV急性感染早期,HBV特异性CD8+T细胞PD-1表达明显升高,并明显诱导了病毒特异性CD8+T凋亡,从而避免了AHB患者肝脏遭受更为严重的免疫损伤.     

药物引起的高敏症状与巨细胞病毒再激活有关:致病T细胞的免疫学特征

作者报道1例三苄糖苷引起的与巨细胞病毒再激活有关的高敏症状,并对循环和皮肤浸润淋巴细胞的免疫学特征进行研究。发现循环及皮损中活性CD8阳性T细胞数量均比CD4阳性细胞多,体外药物刺激可使CD4阳性细胞增多并产生γ-干扰素,循环CD8阳性细胞与有限的T细胞受体Vβ结合,其中一些T细胞属于H LA-A2单倍体上巨细胞病毒源性缩氨酸,皮损中见CD8阳性细胞和巨细胞病毒共同紧密存在。这些结果表明本例患者的CD4阳性细胞是药物激活的,而CD8阳性细胞是巨细胞激活的,这2种细胞在药物引起的高敏症状中似乎扮演一种截然不同的角色。药物引起的高…     

聚乙二醇干扰素联用利巴韦林治疗基因1型丙型肝炎期间早期丙型肝炎病毒动力学和T细胞反应性的关系

背景与目的:为了解基因1型丙型肝炎治疗反应的个体差异,同时调查了基因1型丙型肝炎病毒(H CV-G1)动力学和病毒特异性T细胞的反应性。方法:30例H CV-G1型患者首次接受治疗,应用聚乙二醇干扰素α-2a180μg/周联用利巴韦林1.0～1.2g/d,并前瞻性地按照计划时间点收集血样。采用H CV衰减数学模型进行TaqM an法定量检测H CV-R NA,用Elispot法计数病毒特异性的CD4+/CD8+T细胞。结果:根据H CV动力学分析鉴定出两个亚群:快速治疗应答者(18/30例)和慢速治疗应答者(12/30例)。虽然这两个亚群在基线特征上没有差异,但快速应答者(FR)较慢速…     

中国猕猴CD4~+ CD25~+调节性T细胞抑制抗结核分枝杆菌特异性T淋巴细胞免疫反应

目的:体外观察中国猕猴CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)对T淋巴细胞产生的抗PPD抗原特异性扩增的影响。方法:分离6只3月内人工感染过结核分枝杆菌卡介苗的雄性中国猕猴外周血单个核细胞(PB-MCs),免疫磁珠法分选纯化出Tregs,并用PKH26红标记。将去除Tregs的剩余PBMCs标记上CFSE,然后单独或与纯化的Tregs混合,分别给予结核杆菌纯化蛋白衍生物(PPD)或CD3/CD28单克隆抗体刺激,体外培养7d,用流式细胞术分析含或不含Tregs的PBMCs中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和Vγ2Vδ2T淋巴细胞对PPD抗原和CD3/CD28抗体刺激的反应。结果:PPD不仅能引起CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞扩增,而且引起Vγ2Vδ2T淋巴细胞也发生扩增。Tregs不仅能抑制CD3/CD28抗体诱导的CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和Vγ2Vδ2T淋巴细胞的抗原非特异性扩增,而且还可抑制PPD抗原刺激引起的CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和Vγ2Vδ2T淋巴细胞的抗原特异性扩增。结论:中国猕猴Tregs对T淋巴细胞产生的抗结核杆菌特异性免疫反应有负调节作用。     

调节性T细胞对肝纤维化小鼠肝脏免疫细胞的影响

目的 观察肝纤维化小鼠肝内调节性T细胞(regulatory T cell,Tregs)对具有杀伤能力的免疫细胞的影响.方法 将实验小鼠分为肝纤维化组、肝纤维化+CD25抗体组、对照组3组.实验组用四氯化碳诱导小鼠肝纤维化,4周后给予小鼠腹腔注射纯化的CD25单克隆抗体(PC61培养上清),下调体内Tregs水平.对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水.流式细胞分析检测肝脏Tregs水平以及CD8+T细胞(细胞毒性T细胞表面标志)、Kupffer细胞(F4/80)以及NK细胞的表达.实时荧光定量检测不同亚型的Kupffer细胞及IFN-γ在不同组小鼠肝脏的表达.结果 肝纤维化小鼠肝脏Tregs明显高于对照组,注射CD25抗体下调Tregs 50％以上.CD8+T细胞、Kupffer细胞在肝纤维化小鼠肝内表达升高,下调Tregs后均无明显改变;但NK细胞和IFN-γ在肝纤维化小鼠肝内表达明显下降,下调Tregs后表达显著上升,其中M1型Kupffer细胞在肝纤维化组表达略有降低,下调Tregs后表达升高;M2型变化不明显.结论 Tregs参与对肝纤维化小鼠肝脏的免疫调控,其中对M1型Kupffer细胞和NK细胞抑制作用明显,对CD8+T细胞抑制作用不显著.     

急性感染期HCV特异性T细胞早期增殖受损可致病毒清除失败

背景与目的:细胞介导的免疫(CM I)一直都被认为在原发性丙型肝炎病毒(H CV)感染的病毒清除中发挥了关键作用。然而,一些转为慢性感染的个体在急性感染阶段,体内也产生了CD4+和CD8+T细胞应答,这提示它们引发了一种有缺陷的CM I。在一个大样本受试人群队列中进行该研究目的是,通过检测CM I的幅度、强度、功能及持续时间,以确认在急性H CV感染的自然病程中,这些免疫功能障碍是否存在及其产生的时间。方法:为了综合研究CM I,对31例在其感染出现即被纳入该项前瞻性研究的急性H CV感染个体进行取样,并中位随访1年。结果:研究结果显示,…     

丙型肝炎病毒感染对CD4~+ CD25~+调节性T淋巴细胞的免疫调节作用

CD4+CD25+调节性T淋巴细胞可抑制T细胞免疫反应。本研究旨在确定HCV感染时CD4+CD25+T淋巴细胞的出现频率、表型、功能及其特异性。对病毒感染康复患者(n=15)、慢性感染者(n=30)及正常对照者(n=15)的外周血CD4+CD25+T细胞进行体外分析,对数量、表型以及其对HCV特异性干扰素γ的产生及增殖的影响进行研究。通过对细胞内细胞因子白介素10(IL-10)的染色来确定CD4+CD25+T特异性。CD4+CD25+T淋巴细胞所占比例在慢性感染组(平均3.02%)比康复组(1.64%,P=0.001)及正常对照组(2.27%,P=0.02)高。CD4+CD25+T细胞表现出高CD45RO、低CD…     

趋化因子受体CXCR3及初始/记忆T淋巴细胞在原发性胆汁性肝硬化患者肝脏和外周血中的变化

目的 通过研究原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者外周血和肝脏内淋巴细胞及其活化状态(分子标记:HLADR+CD3+)、初始T细胞(CD45RA)、记忆T细胞(CD45RO)及趋化因子受体CXCR3,了解肝内淋巴细胞活化状态及其影响因素.方法 流式细胞法检测两种肝病患者外周血和肝内淋巴细胞分子标记CD3、CD4、CD8、HLADR+CD3+、CD45RA、CD45RO、CXCR3,进行统计分析.结果 PBC患者在外周血中以CD4+T淋巴细胞为主,肝内浸润淋巴细胞CD8+T和CD4+T淋巴细胞无明显差异;肝内与外周血比较:CD4+T淋巴细胞明显减少,CD4/CD8比例明显降低, HLADR+CD3+T淋巴细胞差异无显著性,CD45RA明显低于外周血,CD45RO则差异无显著性,CXCR3高于外周血中.与NASH患者比较:PBC患者肝内CD4+T细胞增多,CD4/CD8上升,HLADR+CD3+增高,CD45RO、CD45RA减少,CXCR3增多;外周血T淋巴细胞及HLADR+CD3+两组间差异无显著性,CD45RA减少,CXCR3两组间差异无显著性.结论 PBC患者外周血淋巴细胞及其活化状态与肝内免疫状况有关;肝内CD4+T淋巴细胞较NASH患者增多,提示CD4+T的活化和增殖是PBC发生和发展的关键环节;记忆性T淋巴细胞数量(CD45RO)控制在一定范围内可能是自身免疫反应得以不断进行的原因;CXCR3与T淋巴细胞向肝脏定向迁徙有关.     

IL-21在慢性乙型肝炎中免疫调节作用的研究

目的探讨白细胞介素21(IL-21)在慢性乙型肝炎中的免疫调节作用。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测32例慢性乙型肝炎病人(病人组)和29例健康人(对照组)血清中IL-21水平。提取外周血单个核细胞后分别设为IL-21刺激组、IL-2刺激组和未刺激组,多色流式分析技术检测CD8+T细胞频率,胞内细胞因子染色技术检测CD8+IFN-γ+T细胞的频率。结果与对照组相比,病人组血清中IL-21浓度明显增高(t=2.75,P<0.01);与IL-2刺激组和未刺激组相比,IL-21刺激组CD8+T细胞频率及分泌IFN-γ水平显著升高(F=59.27、10.27,q=3.82~14.11,P<0.01)。结论 IL-21通过对CD8+T细胞的免疫调节效应参与慢性乙型肝炎病人体内病毒的清除,为临床治疗提供了新的靶标。     

自噬小体疫苗能够检测人外周血抗原特异性T细胞

目的:探讨自噬小体疫苗DRibbles是否可用于检测人外周血中抗原特异性T细胞.方法:制备表达CEF蛋白的HEK293T细胞及表达CMV pp65蛋白的LT3细胞,从中提取DRibbles,用HEK293T CEFDRibbles及LT3 pp65 DRibbles刺激人外周血单个核细胞(PBMCs),通过流式细胞术检测分泌IFN-γ的T细胞占总T细胞的百分比.结果:与阴性对照HEK293T GFP DRibbles相比,HEK293T CEF DRibbles刺激组分泌IFN-γ+的CD8+T细胞比例显著增高(3.38％ vs0.05％),分泌IFN-γ+的CD4+T细胞比例亦显著增高(0.46％ vs0.06％);LT3 pp65 DRibbles刺激组分泌IFN-γ+的CD8+T细胞平均百分数为0.21％,阴性对照LT3 GFP DRibbles刺激组仅为0.05％(P＜0.01);与LT3pp65细胞裂解产物相比,LT3 pp65 DRibbles能诱导更多的CD8+T细胞分泌IFN-γ(P ＜0.05),在诱导CD4+T细胞分泌IFN-γ方面,DRibbles与细胞裂解产物类似(P＞0.05).结论:包含病毒抗原的DRibbles能够有效激活人PBMCs中的病毒抗原特异性CD8+T细胞及CD4+T细胞.     

原发性胆汁性肝硬化患者肝脏和外周血淋巴细胞活化状态与γ干扰素、白介素2表达的研究

目的了解肝内淋巴细胞活化状态及其影响因素,为阐明PBC的发病机制、寻找治疗新措施提供理论基础.方法流式细胞法检测PBC患者外周血和肝内CD3、CD4,CD8,CD4/CD8,HLADR＋CD3^＋,HLADR＋CD8^＋,γ干扰素（IFN-γ）、白介素2（IL-2）,并与NASH患者比较.结果 PBC患者外周血T淋巴细胞以CD4＋T淋巴细胞占明显优势,肝内浸润T淋巴细胞以CD8^＋T淋巴细胞和CD4^＋T淋巴细胞为主;肝内CD4^＋T淋巴细胞较外周血中明显减少,CD4/CD8比例明显降低,但较NASH患者高.PBC患者外周血T淋巴细胞亚群组成比例及HLADR＋CD3^＋、HLDR＋CD8^＋并无显著性差异,外周血中IFN-γ、IL-2无显著性差异;但PBC患者肝内CD4^＋T细胞增多;CD4/CD8上升,HLADR＋CD3^＋、HLDR＋CD8^＋均增高,IFN-γ、IL-2均高于NASH患者.结论 PBC时外周血淋巴细胞及其活化状态可部分反应肝内免疫状况,肝内CD4^＋T淋巴细胞的活化和增殖是PBC发生和发展的关键环节;肝脏中HLADR＋CD3^＋、HLDR＋CD8^＋异常活化的同时肝组织内IL-2和INFγ增高,提示Th1细胞因子在PBC的发生和发展中起到重要作用.     

寻常型天疱疮患者一级亲属中Dsg3诱导T淋巴细胞的增殖

目的 研究寻常型天疱疮(PV)特异性抗原桥粒芯糖蛋白3(Dsg3)刺激下PV患者一级亲属T淋巴细胞的增殖情况,探讨PV的发生机制.方法 Dsg3刺激PV患者一级亲属外周血单个核细胞(PBMC)体外培养3 d,BrdU掺入流式细胞术胞内染色,检测Dsg3特异性CD3+、CD3+CD4+,CD3+CD8+T细胞的增殖情况.结果 PV抗体阳性亲属中PBMC经Dsg3刺激培养者与未经Dsg3刺激培养者比较,CD3+CD4+T细胞增殖率显著升高[(2.79±1.05)%vs(1.85±0.44)%,P<0.05],PV抗体阳性亲属CD3+CD4+T细胞增殖率明显高于正常对照者[(2.79±1.05)%vs(1.25±0.71)%,P<0.05).结论 PV患者一级亲属中PV抗体携带者体内存在Dsg3自身反应性CD3+CD4+T淋巴细胞,Dsg3释放可能在PV启动中起重要作用.     

氧化低密度脂蛋白干预记忆性CD8+T细胞亚群的分化

目的 探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对CD8+记忆性T细胞亚群分化的影响及其机制.方法 将雌性10周龄未发生糖尿病NOD小鼠随机分为2组(n=5):ox-LDL组及对照组.断颈处死各组小鼠磁珠分离脾脏CD8+T细胞体外培养(IL-2),ox-LDL组加入ox-LDL 30μg/mL体外刺激24 h,ox-LDL未处理组作为对照组.24 h后分离细胞.体外实验利用流式细胞仪检测各组以下指标:胞内CD8+IFN-γ+确定胰岛β细胞特异性杀伤性CD8+T细胞的比例;细胞表面分子CD8、CD44、CD62L确定CD8+记忆性T细胞的不同亚群分化;T细胞相关转录因子TCF-1及STAT-3的活化确定关键性转录因子的作用.体内实验中,将各组CD8+记忆性T细胞通过尾静脉注射的方法移植给未发病NOD小鼠,同时设立未移植的模型对照组,每5 d检测血糖1次,监测小鼠的血糖改变及生存率.结果 相比对照组,ox-LDL(30μg/mL)作用24 h后,胰岛β细胞特异性杀伤性CD8+T细胞活化减少[(0.7±0.03)%vs(2.7±0.14)%,P<0.01],记忆性T细胞中的效应记忆性T细胞形成数目减少[(10.3±0.71)%vs(30.3±1.36)%,P<0.01],干细胞样记忆性T细胞增加[(72.3±3.8)%vs(55.1±2.61)%,P<0.05].T细胞转录因子TCF-1及p-STAT-3活化的也受到抑制[TCF-1:(14.5±0.82)%vs(34.2±1.23)%,磷酸化STAT-3:(3.3±0.12)%vs(22.1±1.1)%,P<0.01].T细胞移植给未发病NOD小鼠后,ox-LDL处理组小鼠血糖升高明显低于对照组(P<0.05),且生存率提高(P<0.05).结论 ox-LDL干扰记忆性CD8+T细胞核转录因子TCF-1活化及STAT-3的磷酸化,抑制长效杀伤作用的效应性和记忆性CD8+T细胞形成,诱导干细胞样记忆性CD8+T细胞形成,从而阻止胰岛β细胞自身免疫损伤及□型糖尿病的发生.     

体内CD8~+T细胞剔除对无症状期SHIV感染猴的影响

目的 CD8+T细胞在一些病毒感染疾病的免疫反应中起着重要的作用,但CD8+T细胞在HIV无症状期的作用尚不明确,本研究通过体内CD8+T细胞剔除,研究CD8+T细胞对SHIV感染猴的影响,进一步了解艾滋病的发病机制。方法选择8只SHIV病毒感染的恒河猴,均处于无症状期,随机分成两组,实验组4只恒河猴在0、3、7 d注射抗CD8+T抗体cM-T807,不同的时间取外周血、腹股沟淋巴结。流式细胞术测定恒河猴外周血和淋巴结中CD8+T细胞数目,Real-time RT-PCR法测定实验猴血浆病毒载量,并使用IFN-γElispot方法测定其对猴细胞免疫的影响。结果 CD8+T细胞敲除后,4只猴的病毒载量都转阳,但反应性不一,HIV-1的靶细胞CD4+T细胞有轻微下降,后反弹,与病毒载量无相关性;CD8敲除猴的感染情况(血浆病毒载量和CD4细胞)比SHIV病毒急性感染轻,这与ELIPOT结果一致。结论 CD8+T细胞在HIV无症状期发挥重要的作用,但其作用具有个体差别。