涎腺腺样囊性癌中RUNX3的表达、甲基化状态及其临床意义

目的 探讨RUNX3基因的异常表达与人涎腺腺样囊性癌发生、发展的关系.方法 以定量甲基化特异性PCR（qM-SP）法检测41例涎腺腺样囊性癌及其相应的正常涎腺组织中RUNX3基因的甲基化状态,并比较RUNX3基因启动子甲基化与腺样囊性癌临床病理因素之间的相关性.同时用Western blot法检测其中19例腺样囊性癌及其匹配的正常涎腺组织中RUNX3蛋白的表达,以分析RUNX3基因启动子甲基化对蛋白表达的影响.结果 实时定量qMSP结果显示腺样囊性癌及其相应正常涎腺组织中其RUNX3基因甲基化阳性率分别为（48.81±5.81）%和（27.98±3.84）%,两者存在显著差异（P＜0.001）.Western blot结果显示腺样囊性癌中RUNX3蛋白的表达量显著低于匹配的正常涎腺组织中的表达（P＜0.001）,提示RUNX3基因甲基化是引起RUNX3蛋白表达下调的原因之一,也与肿瘤的发生相关.结论 RUNX3基因启动子5＇-CpG岛高甲基化在人涎腺腺样囊性癌中是一高频分子事件,与该基因的表达缺失显著相关,是RUNX3基因表达缺失的主要机制之一.RUNX3基因甲基化与腺样囊性癌的发生存在密切联系.     

乳腺癌细胞中PNRC基因启动子区CpG岛甲基化状态的研究

目的 研究乳腺癌细胞中富含脯氨酸核受体辅活化子(proline-rich nuclear receptor coactivator protein,PNRC)基因启动子CpG岛的甲基化状态及在PNRC转录调节中的作用.方法 应用PT-PCR检测PNRC基因在正常乳腺细胞与乳腺癌细胞中的表达情况,并运用"MethPrimer"软件对PNRC启动子区进行分析,预测CpG岛,通过甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测PNRC启动子区CpG岛的甲基化状况;PT-PCR及Northern杂交检测乳腺癌细胞经甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dc)作用后,PNRC基因mRNA的表达情况;Westernblot检测5-Aza-dc干预对PNRC蛋白表达的影响;将含PNRC启动子序列的报告质粒转染乳腺癌细胞,再经5-Aza-dc处理后,检测PNRC基因启动子的活性.结果 PNRC基因在乳腺癌细胞中的表达较正常乳腺细胞明显降低;乳腺癌细胞PNRC基因启动子区存在CpG岛甲基化;乳腺癌细胞经5-Aza-dc处理后,PNRC基因mRNA及蛋白表达水平显著增加,其PNRC基因启动子的活性也明显增强.结论 PNRC基因启动子区的高甲基化导致PNRC在乳腺癌细胞中表达降低.     

涎腺腺样囊性癌转移细胞株的Notch基因表达

目的 筛选与涎腺腺样囊性癌转移相关的候选基因,并对其进行初步验证. 方法 限制片段差异显示PCR技术(RFDD-PCR)构建涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株(ACC-M、ACC-2)基因表达谱.生物信息学分析两个表达谱的Notch基因,半定量RT-PCR技术对两细胞株的Notch基因差异表达进行验证. 结果 用RFDD-PCR方法成功构建涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株(ACC-M、ACC-2)的表达谱,共获得5 420个基因片段,其中包含3个Notch基因.半定量RT-PCR证实Notch2、Notch4在ACC-M的表达高于ACC-2,Notchl在两表达谱未见表达,半定量RT-PCR发现其在ACC-M的表达高于ACC-2.Notch3在两个细胞株表达的差别无统计学意义.结论 Notch1、Notch2、Notch4可能与涎腺腺样囊性癌的发生、发展、转移有关.     

5-氮杂胞苷对Eca109细胞增殖及RUNX3基因表达的影响

目的 探讨去甲基化制剂5-氮杂胞苷(5-azaC)干预对Eca109细胞增殖及其抑癌基因RUNX3表达的影响.方法 应用MTT法来观察5-azaC对Eca109细胞增殖的抑制能力;采用10 μmol/L、20 μmol/L和50 μmol/L 3种不同浓度的5-azaC处理Eca109细胞株,采用MSP检测干预前后RUNX3基因启动子区的甲基化状况;应用RT-PCR、Western blotting检测干预前后RUNX3基因的mRNA和蛋白表达水平的变化.结果 Eca109细胞RUNX3基因启动子区处于异常的高甲基化状态,经5-azaC处理后,高甲基化的RUNX3基因启动子部分去甲基化;处理前启动子高甲基化的RUNX3基因其mRNA或蛋白均不表达,去甲基化处理后能重新激活该基因表达,经3种不同浓度5-azaC处理后,Eca109细胞生长减慢.结论 启动子区高甲基化是食管癌Eca-109细胞RUNX3基因失活的主要原因之一, 5-azaC能逆转RUNX3基因甲基化状态, 从而调控RUNX3基因表达并抑制细胞生长.     

应用抑制性消减杂交技术分析涎腺腺样囊性癌转移相关基因

目的：克隆涎腺腺样囊性癌转移相关的基因。方法：应用mRNA抑制性消减杂交技术，研究涎腺腺样囊性癌高、低转移细胞系基因表达上的差异。结果：以高转移细胞ACC-M为测试子，低转移细胞ACC-2为驱赶子，获得高表达的基因序列有7个，均为已知序列同源基因。其中XAGE-1b基因为肿瘤睾丸抗原家族中的一个重要基因。结论：与ACC-2相比ACC-M中部分基因的高表达与涎腺腺样囊性癌高转移特性的获得有关，此结果为进一步探索腺样囊性癌肿瘤转移分子机理以及肿瘤转移控制和基因治疗提供了重要的依据。     

5-氮-2＇脱氧胞苷对Reh细胞增殖及RUNX3基因启动子区甲基化状态的影响

目的：探讨5-氮-2＇脱氧胞苷对Reh细胞增殖及其抑癌基因RUNX3启动子区甲基化状态的影响。方法：应用MTT法观察5-氮-2＇脱氧胞苷对Reh细胞增殖的抑制能力;采用甲基化特异性PCR（MSP）检测5-氮-2＇脱氧胞苷干预前后RUNX3基因启动子区的甲基化状况;应用RT-PCR检测干预前后RUNX3基因的mRNA表达水平的变化。结果：经5-氮-2＇脱氧胞苷处理后,RUNX3基因启动子高甲基化的区域发生部分去甲基化,5-氮-2＇脱氧胞苷处理前启动子高甲基化的RUNX3 mRNA未见表达,而在其处理后该基因可见重新表达,经5-氮-2＇脱氧胞苷处理后,Reh细胞生长缓慢。结论：5-氮-2＇脱氧胞苷能使Reh细胞RUNX3基因启动子区发生部分去甲基化,从而调控RUNX3基因表达并能抑制其细胞生长。启动子区异常甲基化是白血病Reh细胞RUNX3基因失活的主要原因之一。     

亚硝基乙酰青霉胺对腺样囊性癌细胞VEGF表达双向调控作用

目的:观察亚硝基乙酰青霉胺(SNAP)对腺样囊性癌细胞中VEGF表达水平的调控作用。方法:将31.25μmol/L、62.25μmol/L、125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L不同浓度的SNAP作用于ACC-M和ACC-2细胞,或用浓度为100ng/m L的LPS预刺激12h后,用500μmol/L的SNAP分别刺激ACCs细胞0、1、2、4小时。采用CCK-8活细胞计数试剂盒对ACCs细胞进行毒性分析,半定量RT-PCR检测各组细胞中VEGF表达水平。结果:(1)在0μmol/L~500μmol/L浓度的SNAP作用下,细胞活力均保持在88%;用500μmol/L的SNAP分别作用不同时间ACC-M和ACC-2细胞活力,其活力均保持在86%。(2)当SNAP的刺激浓度在31.25μmol/L时能显著上调VEGF的表达,而500μmol/L的SNAP则显著下调ACCs细胞中VEGF的mRNA水平(P<0.01),仅为基础mRNA水平的0.23倍和0.17倍。结论:在涎腺腺样囊性癌细胞中亚硝基乙酰青霉胺对血管内皮生长因子的表达存在着双向调控作用。     

氧化应激对膀胱癌中抑癌基因人runt相关转录因子3的影响

目的研究外源性活性氧过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激对膀胱癌中抑癌基因人runt相关转录因子3(RUNX3)表达和启动子区甲基化状态的影响。方法将膀胱癌HT1197细胞株分为H2O2组、H2O2+N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)组、H2O2+5-氮杂-2’脱氧胞苷(5-Aza-dC)组和空白对照组。采用Western印迹法检测H2O2作用下NAC、5-Aza-dC对细胞RUNX3蛋白表达的影响,甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)检测H2O2作用下NAC、5-Aza-dC对细胞RUNX3启动子甲基化状态的影响,Western印迹法检测H2O2处理对DNA甲基转移酶1(DNMT1)和组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)蛋白表达的影响,平板克隆形成实验检测H2O2处理对细胞克隆形成能力的影响。结果 H2O2组处理HT1197细胞株48h后的RUNX3蛋白表达水平显著低于空白对照组(P<0.05);而H2O2+NAC组、H2O2+5-Aza-dC组随着H2O2处理时间的增加RUNX3蛋白表达无明显变化,与空白对照组的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。H2O2组细胞RUNX3基因启动子区域发生甲基化,H2O2+NAC组和H2O2+5-Aza-dC组细胞发生部分甲基化,而空白对照组细胞RUNX3基因启动子区域未发生甲基化。使用H2O2处理膀胱癌细胞株48h后,H2O2组HT1197细胞中HDAC1和DNMT1蛋白表达均显著高于空白对照组(P值均<0.05)。H2O2组细胞形成的克隆体积较大、数量较多,其克隆形成率显著高于空白对照组(P<0.05)。结论外源性活性氧H2O2能促进膀胱癌细胞生长并影响RUNX3启动子区甲基化状态和表达,用抗氧化剂NAC或去甲基化制剂5-Aza-dC能逆转RUNX3启动子区甲基化并恢复其表达。提示外源性活性氧H2O2造成的膀胱癌细胞氧化应激很可能是膀胱癌细胞株中抑癌基因RUNX3启动子区异常甲基化、表达下调的主要原因。     

线粒体在埃克替尼诱导涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M细胞凋亡中的作用

目的利用涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M细胞为模型,研究不同浓度埃克替尼( icotinib)对涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M细胞凋亡的影响以及线粒体在 icotinib 诱导ACC-M细胞凋亡中的作用。方法 icotinib 和 P53抑制剂( PFT)分别处理ACC-M细胞,应用噻唑蓝比色法检测细胞活性,利用 Western blot 法检测 P53和胞质内细胞色素 C ( Cyt C)蛋白的表达变化,用Caspase-3凋亡相关蛋白活力检测ACC-M细胞的凋亡情况。结果 icotinib可抑制ACC-M细胞的活性,增加胞质Cyt C蛋白的表达和P53在线粒体的转位并诱导ACC-M细胞凋亡。用PFT预处理后,icotinib诱导ACC-M细胞的凋亡明显下降,线粒体蛋白P53的表达降低,胞质内Cyt C表达减少, Caspase-3凋亡相关蛋白活力下降。结论 icotinib可能通过诱导P53转位到线粒体进而促进ACC-M细胞凋亡。     

胰腺癌中人RUNT相关转录因子3基因启动子区甲基化及其临床意义

目的检测胰腺癌人RUNT相关转录因子3(RUNX3)基因启动子的甲基化情况并探讨其临床意义。方法采用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)检测56例胰腺癌组织及癌旁组织、14例正常胰腺组织、3株人胰腺癌细胞株(PANC1、CFPAC-1、SW1990)、1株正常肝细胞株(HL-7702)中RUNX3基因启动子区CpG岛甲基化状态。检测用甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-cdR)处理前后胰腺癌细胞株RUNX3 mRNA的表达。分析RUNX3异常甲基化与胰腺癌临床特征的关系。结果56例胰腺癌组织中,51.79%(29/56)存在RUNX3基因启动子区CpG岛的异常甲基化,癌旁胰腺组织有10.7%(6/56)存在异常甲基化,而正常胰腺组织中未检测到RUNX3基因异常甲基化。RUNX3基因异常甲基化与患者病理分化程度(r=0.314,P=0.018)、淋巴结转移(r=0.370,P=0.005)显著相关。在5-Aza-cdR处理前,胰腺癌细胞株PANC1、CFPAC-1、SW1990的RUNX3 mRNA无表达或低表达,经5-Aza-cdR处理后各胰腺癌细胞株RUNX3 mRNA恢复表达。结论胰腺癌组织及胰腺癌细胞株均存在RUNX3基因CpG岛异常甲基化;RUNX3启动子的高甲基化与其基因表达降低有关,与胰腺癌组织分化程度、淋巴结转移相关。     

宫颈癌细胞FHIT基因启动子CpG岛甲基化状态分析

FHIT基因是一种与凋亡有关的肿瘤抑制基因,广泛存在于各种细胞凋亡系统中,在多种肿瘤及细胞系中失活,其启动子部位CpG岛甲基化是FHIT基因失活的主要机制之一。本研究应用甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)对不同宫颈鳞癌细胞系FHIT基因启动子CpG岛甲基化状态进行检测,在分子水平上了解FHIT异常甲基化与宫颈癌的相关性,为宫颈癌去甲基化治疗提供依据。     

腺病毒介导的P~(53)基因对涎腺腺样囊性癌细胞系生长的影响

目的研究P53基因对涎腺腺样囊性癌细胞系生长的影响。方法以人涎腺腺样囊性癌细胞系SACC-83、SACC-LM、ACC-2、ACC-M和NACC为实验对象,将载有人野生型P53cDNA的重组腺病毒(Ad5CMV-P53)感染涎腺腺样囊性癌细胞系,观察Ad5CMV-P53对涎腺腺样囊性癌细胞生长的影响。结果5种涎腺腺样囊性癌细胞系转染Ad5CMV-P53病毒后,均可以诱导其发生凋亡,使细胞系生长受到明显的抑制。结论Ad5CMV-P53介导的野生型P53基因,可能是一种有效的治疗涎腺腺样囊性癌的辅助手段。     

Notch信号通路相关基因的表达与涎腺腺样囊性癌转移的关系

目的筛选与涎腺腺样囊性癌转移相关的Notch信号通路基因。方法对已构建的涎腺腺样囊性癌高低转移细胞株ACC-M、ACC-2基因表达谱进行生物信息学分析,在与Notch信号通路基因进行比对后,筛选出差异基因,通过荧光实时定量PCR技术对相关基因的表达差异进行初步验证。结果涎腺腺样囊性癌的表达谱中有46个基因与Notch信号通路有关。验证发现,Notch-1,Notch-2,Notch-4,CHUK,FOXC1,FZD2,FZD3,GBP2和RUNX1在2个细胞株中的表达差别有统计学意义（P〈0．05）,同时Notch-1在发生转移的涎腺腺样囊性癌中的表达明显高于未发生转移的涎腺腺样囊性癌（P〈0．05）。结论Notch信号通路中的多个基因可能参与了涎腺腺样囊性癌的发生和发展;Notch-1的表达与涎腺腺样囊性癌的发生、转移密切相关。