新型人工关节假体材料β钛合金Ti35Nb3Zr2Ta的生物相容性研究

[目的]通过体外实验评价本课题组自主研发的新型低模量β钛合金的生物相容性.[方法](1)采用非自耗真空电弧炉熔炼Ti35Nb3Zr2Ta,应用扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)、能谱扫描(EDX)和表面接触角测量方法观察材料表面特征;(2)将原代培养的大鼠成骨细胞与实验组(Ti35 Nb3Zr2Ta)和对照组(Ti6Al4V)合金体外培养,通过细胞计数、细胞骨架染色、MTT比色法、碱性磷酸酶活性测定、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和茜素红染色等方法观察成骨细胞在两组钛合金表面的粘附、伸展、增殖、分化及成骨能力.[结果]材料表面特征测试结果显示Ti35Nb3Zr2Ta具有比Ti6Al4V更高的表面粗糙度和更好的亲水性.细胞实验表明成骨细胞在Ti35 Nb2Ta3Zr表面的粘附、伸展、增殖、分化优于Ti6Al4V.[结论]新型低模量β钛合金TB5Nb3Zr2Ta显示了良好的生物相容性,有望成为一种新的人工关节假体.     

环指蛋白11调控Akt信号通路促进BMSCs成骨分化的机制研究北大核心CSCD

目的研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)对Akt信号通路的调节作用,为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路。方法从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代,取第4代细胞经流式细胞术,成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验。BMSCs成骨诱导分化培养0~14 d,通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,并用Western blot法检测RNF11蛋白表达。取第4代BMSCs,分为空白对照组(A组)、空载慢病毒(Lv-NC)组(B组)和敲低RNF11(Lv-ShRNF11)组(C组),成骨诱导分化培养0~14 d,采用Western blot检测RNF11蛋白表达,茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,14 d实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测Akt、Smad1/5/8及β-catenin信号通路蛋白相对表达量,以磷酸化前后比值表示。为研究RNF11对Akt信号通路的影响机制,取第4代BMSCs分为Lv-NC转染组(A1组)、Lv-ShRNF11转染组(B1组)和添加Akt信号通路激活剂SC79的Lv-ShRNF11转染组(C1组),14 d时采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量,茜素红染色、ALP染色及qRT-PCR检测成骨相关指标。结果流式细胞术及成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定显示分离培养细胞为BMSCs。RNF11蛋白相对表达量随成骨分化时间延长而逐渐增加(P<0.05);下调RNF11后,茜素红和ALP染色示C组相较于A、B组BMSCs成骨分化程度降低,qRT-PCR检测示Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量减少(P<0.05)。随成骨分化时间延长,RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量均上升(P<0.05)。下调RNF11后,C组相较于A、B组,其Akt信号通路蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),而对Smad1/5/8以及β-catenin信号通路蛋白相对表达量无明显影响(P>0.05)。B1、C1组相较于A1组,其RNF11蛋白相对表达量减少(P<0.05),B1组相较于A1、C1组,其Akt信号通路蛋白相对表达量降低(P<0.05);茜素红与ALP染色示C1组BMSCs成骨分化程度稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05);qRT-PCR检测示C1组Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05)。结论RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化。RNF11可作为提高BMSCs修复骨缺损疗效以及治疗骨代谢病的潜在靶点。     

地塞米松对骨髓间充质细胞增殖及成骨、成脂分化的效应

目的 探讨不同浓度地塞米松(dexamethasone,DEX)作用不同时间对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的增殖及成骨、成脂分化的影响.方法 体外分离培养大鼠BMSCs,将状态良好的第三代细胞接种于96孔板中,随机分组为对照组(不加入DEX)及不同浓度(1 nmol/L、10 nmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L)DEX作用组,培养1、3、5、7、9 d后,分别用细胞增殖检测(CCK-8)法检测细胞增殖状况.将BMSCs接种于6孔板中,随机分为对照组及不同浓度(1 nmol/L、10 nmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L)DEX作用组,培养7、14 d后分别用荧光定量PCR方法检测成骨、成脂相关基因的表达,培养14 d后用Western blot检测成骨、成脂相关蛋白的表达.培养5 d后进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色,培养14 d后进行油红"O"染色、茜素红染色.结果 较低浓度的DEX促进BMSCs增殖,而较高浓度DEX抑制BMSCs增殖.干预早期,较低浓度的DEX促进BMSCs成骨分化而高浓度DEX抑制其成骨分化;干预晚期,各浓度DEX均促进BMSCs成骨指标的表达,但是不能诱导BMSCs钙质沉积.DEX浓度依赖性地促进BMSCs成脂相关指标基因和蛋白的表达,并诱导BMSCs细胞内脂质沉积.结论 DEX可直接影响BMSCs增殖及向成骨、成脂方向分化,这种效应存在浓度和干预时间依赖性.     

左归丸含药血清调节Runx2激活ALP、OPN蛋白促进BMSCs增殖和分化的研究

目的 探讨左归丸(Zuoguiwan, ZGW)的补肾填精、益髓壮骨的作用,促进骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的增殖和向成骨细胞方向分化。方法 制备ZGW含药血清,设置10%FBS DMEM组、成骨诱导液组、2.5%空白大鼠血清-成骨诱导液组、2.5%ZGW含药血清-成骨诱导液组。采用MTT法观察各组对BMSCs的增殖,使用碱性磷酸酶钙钴染色法检测BMSCs向成骨细胞方向的分化能力,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)法检测细胞培养液中AKP的含量,Western blot检测BMSCs中Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙蛋白(osteocalcin, OPN)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)蛋白的表达。结果 2.5%ZGW含药血清-成骨诱导液组能够促进BMSCs的快速增殖,较早地进入平台期,促进BMSCs中AKP的分泌,提高ALP含量,上调BMSCs细胞中Runx2、ALP和OPN的蛋白表达水平。结论 ZGW抗骨质疏松的分子机制,可能与调节Ru...     

联合转染人VEGF165和ANG-1双基因对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]研究联合转染入血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管紧张素-1(ANG-1)双基因对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响.[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,获得腺病毒载体pAd-VIA,将其体外转染大鼠BMSCs,应用诱导培养液定向诱导向成骨细胞分化.实验分为4组:A.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs并诱导组;B.BMSCs诱导组;C.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs组;D.单纯BMSCs组.通过碱性磷酸酶(ALP)染色和活性的测定、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色来评价联合转染双基因对BMSCs成骨分化潜能的影响.[结果]重组腺病毒质粒pAdVIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,有大量的绿色荧光蛋白表达,体外转染大鼠BMSCs后,A、B组的ALP染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色为阳性,而C组和D组为阴性.ALP活性表达具有时间相关性,3 d开始表达,7 d到达高峰,在7、14 d,A、B组与C、D组之间ALP表达均具有统计学差异(P＜0.01),A组和B组之间,在各个时间点均无统计学差异(P＞0.05).[结论]腺病毒载体pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,未明显影响其体外成骨分化潜能.     

大鼠BMSC与ADSC体外Transwell共培养诱导成骨的实验研究

目的研究大鼠骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)与脂肪来源基质细胞(Adipose-derived stromal cells,ADSCs)体外Transwell共培养后对于ADSCs成骨分化的影响。方法取来源于同一只6周龄SD雄性大鼠的ADSCs及BMSCs,培养传代至第2代后按1∶1比例共培养(共培养组),下室植入ADSCs,上室植入BMSCs;同时设置单纯ADSCs组及BMSCs组为对照组。21 d时成骨诱导分化,然后行茜素红染色,比较共培养后BMSCs对于ADSCs成骨分化的影响。结果共培养组茜素红半定量测定结果与ADSCs组相比有显著性差异(P0.05),与BMSCs组相比无统计学差异(P0.05)。结论 ADSCs和BMSCs体外Transwell共培养后,其成骨矿化能力增强,BMSCs可通过旁分泌方式促进ADSCs成骨分化。     

视黄酸受体RARs和RXRs在hBMSCs成骨分化调控过程中的功能差异

目的探讨视黄酸受体RARs和RXRs对h BMSCs成骨分化的影响及机制。方法 h BMSCs体外培养并诱导成骨分化,茜素红和油红O染色检测诱导14 d细胞成骨与成脂分化状态; qRT-PCR及免疫印迹技术检测成骨成脂标志基因以及相关信号通路基因的表达水平。结果 RARs激动剂ATRA、9CRA和TTNPB上调成骨标志基因RUNX2、OSX及OCN的表达,但下调ALPL和I型胶原的表达并抑制钙化,RARs对钙化的抑制可能与其上调TGFβ/SMAD信号通路有关; RXRs激动剂SR11237对成骨分化无明显影响,但可在成骨诱导环境下上调成脂转录因子CEBPB、CEBPA和PPARG的表达,诱导细胞分化为脂肪细胞。结论 RARs诱导h BMSCs成骨分化但抑制钙化过程,RXRs诱导细胞成脂分化,对成骨分化无明显作用。     

玉米醇溶蛋白仿生组织工程支架材料体内外诱导成骨的实验研究

目的 检测玉米醇溶蛋白(zein)仿生三维多孔支架材料的生物相容性、骨诱导性和生物可降解性. 方法 将人骨髓基质干细胞(BMSCs)载人海藻酸钠或zein制成复合物.通过扫描电镜观察、噻唑蓝分析法以及碱性磷酸酶染色与定量检测,分别比较zein和海藻酸钠对BMSCs体外黏附、增殖和分化的影响.取24只8周龄裸鼠,随机分为两组,制成肌袋植入异位成骨模型.对照组单纯植入zein,实验组植入zein与兔BMSCs复合物.术后2、4、8和12周取材进行影像学和组织学观察. 结果 与海藻酸钠相比,zein在任何时间段均能够更好地促进兔BMSCs的体外增殖和分化,差异有统计学意义(P<0.05).同时,与单纯植入zein相比,BMSCs能够增强zein体内诱导成骨的作用. 结论 zein具有良好的生物相容性、骨诱导性和生物可降解性.     

镁合金对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响研究

目的：探讨镁合金对人骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及成骨分化的影响。方法抽取人骨BMSCs并予以鉴定;采用AZ31B镁合金浸提液培养人BMSCs 1、3、5、7 d,以普通培养基为对照组,CCK-8法检测细胞增殖活性;应用浸提液培养人BMSCs,诱导分化后检测成骨分化相关基因（COLⅠ、ALP、OPN）的表达。另设置调节pH值AZ31B组（pH-AZ31B组）,以观察pH值变化对实验结果的影响。结果 BMSCs表达CD34（-）、CD45（-）、CD44（＋）、CD73（＋）、CD90（＋）、CD105（＋）。浸提液培养1、3、5、7 d,AZ31B组细胞相对增殖率低于对照组（P＜0.05）,毒性评级为2级;对照组和pH-AZ31B组细胞活性较好,两组细胞相对增殖率比较,差异无统计学意义（P ＞0.05）。AZ31B组COLⅠ基因表达量与对照组比较,差异无统计学意义（P ＞0.05）;AZ31B组ALP基因表达量较低（P＜0.05）,pH-AZ31B组与对照组无显著差异（P＞0.05）;AZ31B组OPN基因表达量在诱导分化后6 d、12 d显著高于对照组（P＜0.05）,pH-AZ31B组与对照组无显著差异（P＞0.05）。结论镁合金对BMSCs增殖及成骨分化无不良影响,其影响可能与浸提液pH值的变化有关。     

BMSCs来源成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架构建血管化组织工程骨研究

目的探讨大鼠BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架植入大鼠桡骨缺损处的成骨作用和成血管作用。方法取分离培养至第3代的SD大鼠BMSCs行成骨和成内皮细胞诱导并鉴定。分别将内皮细胞(A组)、成骨细胞(B组)、混合细胞(成骨细胞和内皮细胞比例为1∶1,C组)均匀滴加于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架上制备3组细胞-支架复合物,MTT检测支架内细胞增殖活性。取2月龄雄性SD大鼠30只,制作大鼠桡骨5 mm长缺损模型并分别植入3组细胞-支架复合物(n=10)。术后4、8、12周分别取移植物行HE染色观察,CD34免疫组织化学染色计数微血管密度,RT-PCR法检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨保护素(osteoprotegrin,OPG)mRNA表达。结果 BMSCs成骨诱导7 d后ALP染色可见细胞质内蓝染颗粒,细胞核呈红染;内皮细胞诱导14 d后,CD34免疫细胞化学染色可见细胞内棕色颗粒。MTT检测示3组细胞活性随时间延长逐渐升高。HE染色示,术后12周A组未见明显类骨质形成,而有较密集的微血管结构及较多纤维组织形成;B、C组可见均质的类骨质,呈条索状和岛状分布,可见大量成骨样细胞存在。术后各时间点A、C组微血管密度均显著高于B组(P<0.05);A组术后12周微血管密度高于C组(P<0.05),其余2个时间点A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。A组3个时间点OPN和OPG mRNA表达水平均较低,与B、C组比较差异有统计学意义(P<0.05);B、C组分别于术后8、12周OPN mRNA表达达峰值,4周时OPG mRNA表达达峰值。结论 BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞按1∶1比例共培养于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架作为组织工程骨移植物,可以促进大鼠桡骨缺损部位骨的形成和血管化,促进骨缺损愈合。     

PLGA-[ASP-PEG]三嵌段基质材料对骨髓间充质干细胞黏附增殖及诱导成骨分化的研究

目的：探讨聚乳酸聚乙醇酸共聚物（poly lactic acid-co-glycolic acid,PLGA）-天冬氨酸（asparagic acid,ASP）-聚乙二醇（poly ethylene glycol,PEG）三嵌段多元共聚物上骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的黏附、增殖及成骨分化情况。方法：在PLGA支架材料中引入PEG和含有多个功能位点的ASP,制成PLGA-[ASP-PEG]三嵌段高分子支架材料。将材料与MSCs复合培养,以未改性的PLGA支架材料作对照,通过沉淀法、MTT法和考马斯亮蓝法分别检测MSCs的黏附和增殖变化。用成骨诱导培养基培养14d和28d,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和钙结节染色了解MSCs成骨分化情况。结果：MSCs在PLGA-[ASP-PEG]材料表面贴壁生长,细胞数目明显多于对照组。细胞黏附率检测显示,PLGA-[ASP-PEG]表面MSCs的黏附性能和增殖能力明显高于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。MTT比色实验显示MSCs在PLGA-[ASP-PEG]三嵌段材料上培养20d后,吸光度（A）值为1.336,约为对照组0.780的2倍。培养12d时,PLGA-[ASP-PEG]材料组的细胞蛋白含量为66.44μg/孔,对照组为41.23μg/孔。成骨诱导培养基培养后,ALP染色和钙结节染色均为阳性,PLGA-[ASP-PEG]三嵌段材料及其降解产物不影响MSCs的成骨分化。结论：PLGA-[ASP-PEG]能促进组织工程种子细胞在骨基质材料表面的黏附、增殖,并能较好地保持细胞的形态,对成骨分化无明显影响。     

Covalent attachment of P15 peptide to titanium surfaces enhances cell attachment,spreading, and osteogenic gene expression

P15, a synthetic 15 amino acid peptide, mimics the cell‐binding domain within the alpha‐1 chain of human collagen is being tested in clinical trials to determine if it enhances bone formation in spinal fusions. We hypothesize that covalent attachment of P15 to titanium implants may also serve to promote osseointegration. To test this hypothesis, we measured osteoblast and mesenchymal cell adhesion, proliferation, and maturation on P15 tethered to a titanium (Ti‐P15) surface. P15 peptide was covalently bonded to titanium alloy surfaces and incubated with osteoblast like cells. Cell toxicity, adhesion, spreading, and differentiation was then evaluated. Real‐time quantitative PCR, Western blot analysis, and fluorescent immunohistochemistry was performed to measure osteoblast gene expression and differentiation. There was no evidence of toxicity. Significant increases in early cell attachment, spreading, and proliferation were observed on the Ti‐P15 surface. Increased filapodial attachments, α₂ integrin expression, and phosphorylated focal adhesion kinase immunostaining indicated activation of integrin signaling pathways. qRT‐PCR analysis indicated there was significant increase in osteogenic differentiation markers in cells grown on Ti‐P15 compared to control‐Ti. Western blotting confirmed these findings. Surface modification of titanium with P15 significantly increased cell attachment, spreading, osteogenic gene expression, and differentiation. Results of this study suggest that Ti‐P15 has the potential to safely enhance bone formation and promote osseointegration of titanium implants. © 2012 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 30:1626–1633, 2012     

水蛭素通过上调VEGF/Notch1信号通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化

摘要：目的 观察水蛭素对人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）成骨分化的影响。方法 BMSCs细胞分为正常培养的对照组、成骨诱导的诱导组以及加入不同浓度（1、10、20 ATU/mL）处理的水蛭素组。MTT检测细胞增值并筛选水蛭素最适作用浓度。流式细胞仪检测细胞凋亡。RT-PCR和Western blot分别检测成骨基因Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达。BCIP/NBT染色法检测细胞中的碱性磷酸酶水平。茜素红染色检测矿化结节。检测VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的mRNA和蛋白表达。结果 骨髓间充质干细胞经成骨诱导细胞增殖显著增加,中高浓度的水蛭素可以不同程度促进成骨诱导的BMSCs细胞增殖（P＜0.05）,并筛选出20 ATU/mL作为水蛭素的使用浓度。水蛭素抑制成骨诱导的BMSCs细胞凋亡,上调Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达,增加碱性磷酸酶水平,促进细胞中矿化结节的生成,并提升BMSCs细胞中VEGF、Notch1、Jagged1和CBF1的表达（P＜0.05）。结论 水蛭素可能通过上调VEGF/Notch1信号通路促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。     

LncRNA DANCR靶向调控对绝经后骨质疏松BMSCs成骨分化的作用

目的 研究长链非编码RNA（lncRNA）分化非蛋白编码 RNA（DANCR）靶向微小RNA（miR）-19a-3p对绝经后骨质疏松（PMOP）骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化的调控作用。方法 选择健康女性志愿者4例和PMOP患者4例，分离培养BMSCs；PMOP患者BMSCs进行分组，转染阴性对照（NC）siRNA、lncRNA DANCR siRNA、miR-NC抑制物、miR-19a-3p抑制物。检测lncRNA DANCR、miR-19a-3p、PTEN的表达水平，成骨诱导分化后检测茜素红染色的OD405水平、碱性磷酸酶（ALP）活力、骨钙素（OCN）及骨桥蛋白（OPN）的mRNA表达水平。结果 PMOP患者BMSCs中lncRNA DANCR、PTEN的表达水平高于健康女性，miR-19a-3p的表达水平及成骨诱导后的OD405水平、ALP活力、OCN及OPN的表达水平均低于健康女性。在PMOP患者BMSCs中，si-DANCR组的lncRNA DANCR、PTEN的表达水平低于si-NC组，成骨诱导后的OD405水平、ALP活力及miR-19a-3p、OCN、OPN的表达水平高于si-NC组；si-DANCR+miR-19a-3p抑制物组成骨诱导后的OD405水平、ALP活力及miR-19a-3p、OCN、OPN的表达水平低于si-DANCR+miR-NC抑制物组，PTEN的表达水平高于si-DANCR+miR-NC抑制物组。结论 LncRNA DANCR靶向miR-19a-3p调控PMOP患者BMSCs的成骨分化。     

含SrCaP涂层镁合金ZK60对小鼠前成骨细胞功能的影响

目的探讨含锶钙磷（SrCaP）涂层镁合金ZK60对小鼠前成骨细胞黏附、增殖和成骨分化等功能的影响。方法制备含SrCaP涂层的镁合金ZK60材料,以不含SrCaP涂层的ZK60和钛合金材料作为对照,扫描电镜观察材料表面的超微结构;以小鼠MC3T3-E1细胞为对象,扫描电镜、荧光显微镜、MTT法、p-NPP法等观察上述材料对细胞黏附、增殖和成骨分化的影响。结果扫描电镜可见含SrCaP涂层镁合金ZK60表面的粗糙多孔结构。与ZK60组相比,前成骨细胞在该材料上铺展面积更大,黏附更好;死活细胞染色显示培养24 h时SrCaP-ZK60组活细胞数最多;浸提液培养5 d时SrCaP涂层镁合金组细胞增殖显著高于钛合金组（P＜0.05）;培养7 d后,SrCaP涂层镁合金表面成骨细胞碱性磷酸酶表达显著高于ZK60组及钛合金组（P＜0.05）。结论含SrCaP涂层镁合金ZK60具有良好的促成骨细胞黏附、增殖和成骨分化作用。